Genómica Estructural Mapeo Genético en Plantas

Transcripción

1 Genómica Estructural Mapeo Genético en Plantas

2 Aplicaciones de los marcadores moleculares al Análisis de Genomas Vegetales: 1. Diversidad genética: Evaluación de Germoplasma Identificación y Protección Varietal 2. Base Genética de los Caracteres de interés Agronómico: Caracteres simples Caracteres Complejos MAPAS Mapeo Comparativo Clonaje Posicional MAS

3 Mapa Genético Tipos de mapas genéticos Mapa genético de ligamiento Descripción lineal de los marcadores/genes en un determinado cromosoma (marcadores próximos se heredan juntos). Mapa físico Localización física de regiones del cromosoma

4 Mapa de ligamiento

5 La frecuencia de recombinantes depende de la distancia fisica entre los loci a1 A a1 b1 B b1 a2 a2 b2 b2 Homocigotos (Padres) Meiosis a1 a2 X b1 b2 Gametos Meiosis Sobrecruzamiento a1 a2 F1 b1 b2 Heterocigotos (F1) a1 a2 a1 b2 b1 a2 b1 b2 Σ = 1 1/2 (1-r) 1/2 r 1/2 r 1/2 (1-r) r = frecuencia de recombination

6 La frecuencia de recombinantes depende de la distancia física entre los loci r = a1 b2 a1 b2 b1 a2 + b1 a2 a a2 b1 b2 nº recombinantes = nº parentales r = 0,5: NO ligamiento nº recombinantes < nº parentales r < 0,5: Ligamiento nº recombinantes ~ 0 r ~ 0: Ligamiento completo

7 Mapeo Genético Estimación del orden y distancias entre marcadores Dos marcadores cercanos en un cromosoma tienden a heredarse juntos La frecuencia con que esto ocurre permite estimar la distancia entre ambos

8 Mapeo Genético Construcción de mapas multiloci 1) Construir grupos de ligamiento calculando distancias entre parejas de loci (LOD>3) 2) Ordenar los marcadores del mismo grupo de ligamiento (máxima verosimilitud). 3) Estimar las distancias entre los marcadores

9 MAPMAKER > Análisis de ligamiento para marcadores dominantes, recesivos y codominantes tipo de cruzamiento, número de marcadores, número de individuos genotipados, genotipo detecta grupos de ligamiento por análisis de dos puntos análisis de tres puntos para calcular el orden más probable calcula los LOD scores (verosimulitud del ligamiento) entre todos los pares posibles Construye un mapa genético con distancias para cada grupo de ligamiento

10 Mapeo Genético Programas disponibles MAPMAKER JOINMAP LINKEM MAPMANAGER COMBIN LINKAGE CRIMAP MULTIMAP CARTHAGENE

11 Mapa Genético Requerimientos del Mapeo de ligamiento 1) Marcadores 2) Poblaciones (diseños experimentales)

12 Mapeo Genético Requerimientos del Mapeo de ligamiento 1) Marcadores - Cuantos más mejor - Dominancia vs Codominancia

13 Mapeo Genético Requerimientos del Mapeo de ligamiento 2) Poblaciones - F2 - Retrocruzamiento - NILs, RILs -

14 Aproximación clásica Mapeo General con Poblaciones segregantes Cruzamientos entre individuos muy diferentes Retrocruzamiento, F2, Pseudo F2...

15 Muestreo de Marcadores al azar Caracteres de interés Marcadores estrechamente ligados Mapas Saturados descendencias individuos marcadores

16 Aproximaciones alternativas Muestreo de Marcadores en regiones específicas Líneas casi isogénicas (NILs) - Retrocruzamientos recurrentes - Subproducto de Mejora Líneas Consanguíneas recombinantes (RILs) - Mapa previo - NO Subproducto de Mejora Análisis de bloques segregantes (BSA)

17 Desarrollo de líneas casi isogénicas (NILs) x x x x

18 Desaparición de la cromatina no deseada en función del número de retrocruzamientos. cm nº de Retrocruzamientos Hanson, Genetics 44: 833-7

19 Material empleado para el mapeo genético en Plantas R r P1 X P2 Gametos (H) Colchicina Cultivo In vitro F1 Rr Autofecundación F2 F2 Dobles Haploides (DH) Retrocruzamiento con P2 (BC) Rr rr RR Rr Rr rr RR Rr Autofecundación Rr Rr F5 Near isogenic lines (NILs) Autofecundación RR rr Recombinant inbred lines (RILs)

20 Resultado final de la generación de una población segregante para un carácter monogénico planta: Cromosoma 5 r R Fenotipo

21 Parentales T x S BSA F1 F2 T S Bloques T S

22 Mapa Genético en Centeno (Secale cereale L.)

23 Cruzamientos en centeno A1 X R A2 X R A3 X R A4 X R A6 X R AR1 AR2 AR3 AR4 AR6 AR1.5 AR1.7 AR1.11 AR1.13 AR1.15 X X R R X R AR2.6 AR2.14 X R AR3.14 AR4.18 AR6.17 1:1 9:7 3:1 3:1 15:1 1:1 3:1 3:1 3:1 3:1

24 Ligamiento a isoenzimas localizados en el cromosoma 6R

25 RAPDs ligados a la Tolerancia al Aluminio OpB OpR01 600

26 Transformación a SCAR OpB OpB OpR01 600

27 Loci Distribución de la descendencia X2 cm T,11 s,11 T,12 s,12 T,22 s,22 Alt1, OpA ,75*** 33,5 Alt1, Aco ,17*** 24,6 T,+ T,- s,+ s,- Alt1, Est ,75 - Alt1, Est ,18 - Alt1, Ndh ,94** 46,4 Alt1,OpB ,51*** 21,9 Alt1,OpB ,28*** 0 Alt1,OpR ,64*** 2,2 Relaciones de ligamiento obsevadas entre el locus Alt1 y otros loci localizados en 6R

28 6RS 2,1 cm 5,5 cm OpR Alt1 OpB ,1 cm Centrómero 4,8 cm 10,0 cm 6,4 cm Aco1 OpB OpA Ndh2 24,0 cm 6RL 0,7 cm Est6 Est8

29 7RS 0 SCARQ SCIM SCIM OPO2 984 SCIM OPO2 633 OPO7 666 SCIM OPQ4 725 SCIM ScALMT1 OPQ4 578 SCIM SCIM OPN1 667 OPN1 708 OPJ SCM40 OPF SCM OPD1 858 OPJ3 857 SCIM OPF OPF Centromere

30 Identificación de Caracteres Cuantitativos con Efecto sobre Caracteres de Interés Agronómico en Plantas Cultivadas

31 Mendel Fisher Haldane Wright

32 Genética Mendeliana Genética Cuantitativa Caracteres Discretos Caracteres Contínuos Tipo Individuos Grado Poblaciones

33 Gen único Cualitativo Cuantitativo Poligénico Ambiental

34 Mapeo de Loci de Caracteres Cuantitativos (QTLs) Que es un QTL? Es la localización de un gen que afecta a un carácter cuantitativo El mapeo de caracteres cuantitativos no es tan simple como el de cualitativos

35 En los 1920 s Fisher y Wright desarrollaron los conceptos de Genética Cuantitativa y QTLs El mapeo de QTLs se ha vuelto una realidad en los últimos años por el desarrollo de los marcadores moleculares Cantidad ilimitada Sin influencia ambiental Análisis en fases tempranas Sencillos, rápidos y objetivos

36 Análisis de QTL Hay asociación entre el genotipo para el marcador y el fenotipo para el carácter cuantitativo? laboratorio campo computadora

37 Mapeo por Intervalos La presencia de un QTL y su efecto se estima en función de los marcadores que flanquean el intervalo que acotan

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39 Software Mapmaker/QTL: Interval mapping -> http//www-genome.wi.mit.edu/ Mapmaker/SIBS: Sib-pair data -> http//www-genome.wi.mit.edu/ QTL cartographer: Para los tres métodos cartografía MapQTL: Parte de JoinMap, un paquete de análisis de ligamiento MQTL: Permite test de permutaciones para establecer el umbral de significación (no análisis de F2) ftp://gnome.agrenv.mcgill.ca/pub/genetics/software/mqtl LINKAGE: Programa de análisis de ligamiento de marcadores que también incluye la información fenotípica ftp://linkage.cpmc.columbia.edu/software/linkage

40 Por qué es tan difícil caracterizar un QTL? Imprecisión del mapeo Poca capacidad para detectar QTLs de pequeño efecto o bajas heredabilidades Factores Poblaciones empleadas para mapeo de al menos 500 individuos Clasificación del carácter muy exacta Repeticiones (distintos años, poblaciones y ambientes)

41 QTL de Tolerancia al Aluminio en centeno AR1 n ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 cm

42 QTL de Tolerancia al Aluminio en centeno S T F2 n ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 cm

43 QTL de Tolerancia al Aluminio en centeno 7RS

44 Ailés es portador del Alelo MÁS Tolerante para Qalt4 Riodeva es portador del alelo MÁS Tolerante para Qalt5 Índice de Recrecimiento de la Raíz (cm.) Qalt5 Qalt5 Ailés Qalt5 Ailés Qalt5 Ailés Qalt5 Riodeva Qalt5 Riodeva Qalt5 Riodeva Qalt4 Riodeva Qalt4 Riodeva Qalt4 Qalt4 Riodeva Qalt4 Ailés Qalt4 Ailés Qalt4 Ailés 4,03 21,24-5,30 25,43 26,24-26,00 29,65

45 Ailés es portador del Alelo MÁS Tolerante para Qalt4 Riodeva es portador del alelo MÁS Tolerante para Qalt5 Qalt5 Índice de Recrecimiento de la Raíz (cm.) Qalt5 Ailés Qalt5 Ailés Qalt5 Ailés Qalt5 Riodeva Qalt5 Riodeva Qalt5 Riodeva Qalt4 Riodeva Qalt4 Riodeva Qalt4 Qalt4 Riodeva Qalt4 Ailés Riodeva no es tan sensible Qalt4 Ailés Qalt4 Ailés 4,03 21,24-5,30 25,43 26,24-26,00 29,65

46 Mapas físicos

47 Mapas físicos La distancia entre marcadores es una distancia física real, basada en pb. Baja resolución: Marcadores citogenéticos Alta resolución: Mapas de restricción, secuenciación DNA

48 Cariotipo Mapeo físico

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50 Genómica Comparativa

51 Aplicaciones de los marcadores moleculares al Análisis de Genomas Vegetales: 1. Diversidad genética: Evaluación de Germoplasma Identificación y Protección Varietal 2. Base Genética de los Caracteres de interés Agronómico: Caracteres simples Caracteres Complejos MAPAS Mapeo Comparativo Clonaje Posicional MAS

52 Especie ancestral Especie 1 Especie 2 Especie 3 Especie 4 Mutaciones

53 Para que comparamos? Que podemos comparar? Qué información obtenemos?

54 Para que comparamos? VISTA Genome Browser La conservación a lo largo de distancias evolutivas importantes indica una constricción funcional útil para detectar genes de interés

55 Para que comparamos? CMTV Comparative Map and Trait Viewer La caracterización de diferencias entre organismos indica el mecanismo del cambio

56 Para que comparamos? Podemos trasladar la información de especies modelo a especies de interés económico A. thaliana Medicago truncatula Soja

57 Que comparamos en la actualidad? Marcadores genéticos (mapas comparativos) Secuencias parciales y completas de genomas

58 1. Mapas comparativos Especie Especie 2

59 2. Secuencias Líneas de datos donde cada elemento puede ser una de cuatro letras (A, C, G o T). Las líneas pueden ser muy largas miles de millones de letras. Las secuencias pueden ser de todo tipo. Especie 1: caggaaaacacacactcacatacatgaacaatatctc Especie 2: caggataatgcacac catacatgcacaaaat tc

60 Servidores y programa de alineamiento NCBI BLAST WU-BLAST blast.wustl.edu/ BLASTZ BLAT LAGAN lagan.stanford.edu/lagan_web/index.shtml mavid baboon.math.berkeley.edu/mavid MUMMer SSAHA

61 Visualización Comparativa de Genomas Apollo CMap CMTV Ensembl NCBI Map Viewer PipMaker pipmaker.bx.psu.edu/pipmaker SOCKEYE UCSC Genome Browser VISTA www-gsd.lbl.gov/vista/ ECR Browser ecrbrowser.dcode.org/ Virtual Comparative Map rgd.mcw.edu/vcmap

62 Con la secuenciación completa de genomas se reinventó la Genómica Comparativa

63 Vertebrados BACs Shotgun Margulies y Birney, 2008 Completa

64 Anotación de genomas Obviamente, para comparar genomas es extremadamente importante identificar donde están localizados los genes

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66 Genómica Comparativa La comparación entre genomas es una herramienta adicional para la identificación de genes. Por otra parte, la identificación de genes es una herramienta para la comparación de genomas.

67 Genes Candidato

68 Genes Candidato El objetivo en los análisis del genoma de especies de interés económico es identificar los genes responsables de los caracteres de interés

69 Genes Candidato Gen Candidato Biológico -Gen con una función biológica conocida relacionada con el desarrollo o la fisiología del carácter Gen Candidato Posicional - gen mapeado previamente en una región en la que se ha identificado un QTL Gen Candidato Posicional comparativo - Gen candidato mapeado en otra especie en una región de sintenia conservada que corresponde a la región del QTL.

70 Genes Candidato Metodología 1) Elección del gen candidato. 2) Obtención de secuencias (primers) para amplificar el gen. 3) Búsqueda de polimorfismos en genes candidatos. 4) Desarrollo de métodos de genotipado. 5) Identificación de poblaciones para el estudio de asociación. 6) Estudio de asociación del gen con el fenotipo. 7) Comprobación de asociaciones.

71 Genes Candidato 1) Elección del gen candidato 1) Aspectos biológicos o fisiológicos. 2) Efectos mutacionales en otras especies 3) Localización cromosómica 4) Localización en otras especies

72 2) Obtención de primers para PCR Información de secuencia en bases de datos: -Genbank -EMBL Información de distintas especies secuencia consenso Software standard para: -Comparar secuencias -Diseño de primers Genes Candidato Secuenciación del producto de PCR

73 Genes Candidato 3) Búsqueda de polimorfismos en genes candidatos Cualquier polimorfismo puede utilizarse (1/500pb)

74 Genes Candidato 4) Desarrollo de métodos de genotipado a gran escala PCR-RFLP SNPs: Primer extension Pirosecuenciación Chips

75 Genes Candidato 5) Poblaciones para el estudio de asociación Cualquier población con variación genética Variedades Líneas comerciales Líneas de selección

76 Genes Candidato 6) Comprobación de asociaciones Repetir el análisis en otros materiales

77 Ejemplo de Aproximación por Gen Candidato

78 P Ailés (T) X Riodeva (NT) F 1 X Riodeva (NT) F 2

79 Genética de la tolerancia en centeno 1R 2R 3R 4R 5R 6R 7R Alt4 Alt1 Q atl5 Alt3

80 Genes Candidatos 1. Colección de ESTs obtenidas de raíces de centeno tratadas con Al. 2. Genes ya descritos con patrones de expresión diferentes entre genotipos sensibles y tolerantes al Al. 3. Canales de exudación de ácidos orgánicos de arroz y Arabidopsis.

81 Gen ScALMT1 de centeno: Localización 7RS Alt1 M 1R 2R 3R 4R 5R 6R 7R 7RS 7RL CS CSI I M ScALMT1 está en 7RS MI

82 Gen ScALMT1 de centeno: Mapeo M A R T NT M 7R Alt1=ALMT1 MI ScALMT1 está completamente ligado a Alt1

83 7RS 0 SCARQ SCIM SCIM OPO2 984 SCIM OPO2 633 OPO7 666 SCIM OPQ4 725 SCIM ScALMT1 OPQ4 578 SCIM SCIM OPN1 667 OPN1 708 Transportador de Malato OPJ SCM40 OPF SCM OPD1 858 OPJ3 857 SCIM OPF OPF Centromere

84 Gen ScALMT1 de centeno: Expresión ScALMT1 es inducido por Al en los ápices de la raíz Mayor expresión en las raíces de las plantas tolerantes 23 Nivel de expresión ScALMT μmol/g-1 3h 6h 9h 12h 24h NT T NT T NT T NT T NT T 0 min 30 min 1 hora 6 horas 24 horas

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86 Clonaje posicional, Genes Candidatos y QTLs

87 QTLs generaciones número de individuos número de marcadores Análisis de Bloques Segregantes, NILs, RILs

88 Análisis de bloques segregantes (BSA) Diferentes combinaciones de Genes y Ambientes pueden ser responsables de los fenotipos extremos

89 Mapas de alta resolucion para clonar un QTL Análisis del caracter cuantitativo Análisis de marcadores Detección de QTLs y ligamiento Relleno de huecos (Más marcadores en la región) Más individuos (Más recombinantes en la region)

90 QTL de Espigado en arroz

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95 Selección Asistida por Marcadores (MAS)

96 Los Caracteres de Interés y el apoyo en los Marcadores Moleculares Caracteres de interés Gen Gen Gen Gen Gen Mejora QTL QTL QTL QTL QTL Estudio Marcadores estrechamente ligados

97 MAS Uso de MMs estrechamente ligados a un carácter de interés para sustituir o apoyar los test de campo Asumimos que los MMs pueden predecir de manera fiable el fenotipo para el carácter

98 MAS NT P 1 x P 2 T F 1 F 2 MAS

99 Utilidades de los MMs en Mejora Gestión y uso de los Recursos Genéticos Selección de los individuos mejores Transferencia de los factores genéticos a líneas élite Retrocruzamiento asistido por MMs Control segmento a introducir Recuperación genotipo receptor

100 Ventajas Método rápido y barato de selección Selección en fases tempranas Fiabilidad No hay efectos ambientales Discriminación entre homocigotos y heterocigotos

101 Selección del tipo de MM Complejidad metodológica Fiabiliadad Grado de polimorfismo Cantidady calidad del DNA necesario Coste...

102 Integración de la Tecnología Molecular en la Mejora Vegetal Hay muchos artículos científicos sobre mapas y muy pocos ejemplos de MAS Retos: Mejorar la comunicación entre Biólogos Moleculares y Mejoradores Simplificar las tecnologías moleculares Abaratar los costes de los MMs

103 Aplicaciones de los marcadores moleculares al Análisis de Genomas Vegetales: 1. Diversidad genética: Evaluación de Germoplasma Identificación y Protección Varietal 2. Base Genética de los Caracteres de interés Agronómico: Caracteres simples Caracteres Complejos MAPAS Mapeo Comparativo Clonaje Posicional MAS