Universidad de Oviedo. Máster en Investigación en Medicina. Expresión diferencial y significación clínica de las proteínas

Transcripción

1 Universidad de Oviedo Máster en Investigación en Medicina Expresión diferencial y significación clínica de las proteínas relacionadas con la inflamación en la hiperplasia benigna prostática y en el cáncer de próstata Sandra Bermúdez Fernández Junio 2012 Trabajo Fin de Máster

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3 Universidad de Oviedo Máster en Investigación en Medicina Expresión diferencial y significación clínica de las proteínas relacionadas con la inflamación en la hiperplasia benigna prostática y en el cáncer de próstata Trabajo Fin de Máster Autora Director Tutor Sandra Bermúdez Fernández Dr. Francisco J. Vizoso Prof. Manuel F. Fresno

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5 Manuel Florentino Fresno Forcelledo, Doctor en Medicina por la Universidad de Oviedo, Catedrático de Anatomía-Patológica del Departamento de Cirugía y Especialidades Médico-Quirúrgicas del Hospital Universitario Central de Asturias, y Profesor del Máster Investigación en Medicina por la Universidad de Oviedo. Francisco José Vizoso Piñeiro, Doctor en Medicina por la Universidad de Oviedo, Jefe de la Unidad de Investigación de la Fundación Hospital de Jove. CERTIFICAN: Que el Trabajo Fin de Máster presentado por Dña. Sandra Bermúdez Fernández, titulado Expresión diferencial y significación clínica de las proteínas relacionadas con la inflamación en la hiperplasia benigna prostática y en el cáncer de próstata, realizado bajo la dirección del Dr. Francisco J. Vizoso dentro del Máster en Investigación en Medicina por la Universidad de Oviedo, reúne a nuestro juicio las condiciones necesarias para ser admitido como Trabajo Fin de Máster en la Universidad de Oviedo. Y para que así conste dónde convenga, firman la presente certificación en Oviedo a 07 de Junio de Vº Bº VºBº Fdo. Dr. Francisco J. Vizoso Fdo. Prof. Manuel F. Fresno Director del Proyecto Tutor del Proyecto

6 Índice

7 Índice Agradecimientos...1 Introducción La Próstata Situación y relaciones Estructura Hiperplasia benigna prostática Epidemiología del cáncer de próstata Conceptos generales Incidencia y mortalidad Supervivencia de los pacientes con cáncer de próstata Factores de riesgo para el cáncer de próstata Edad Raza Factores genéticos Hormonas Diagnóstico Tacto rectal (TR) Antígeno prostático específico (PSA) Velocidad de PSA Biopsia prostática Screening del cáncer de próstata Estadiaje Clasificación TNM Puntuación de Gleason Inflamación y cáncer Interferon-β... 16

8 Índice 8.2 IL- 1β NFkB Hipótesis y Objetivos Pacientes y Métodos Consideraciones éticas Selección de pacientes Elaboración de mallas de tejido y tinción inmunohistoquímica Análisis de la tinción tisular Análisis estadístico Resultados Casos perdidos Expresión global de IFNβ, IL-1β y NFkB en la HBP y en el CaP Expresión de IFNβ, IL-1β y NFkB por los distintos tipos celulares Relación de la expresión simultánea de IFNβ, IL-1β y NFkB Relación de la expresión de los factores con las características clínico-patológicas de los pacientes Relación de la expresión de los factores a estudio con la recurrencia bioquímica Relación de la expresión de los factores a estudio con la supervivencia de los pacientes Discusión Conclusiones Bibliografía... 64

9 Agradecimientos 1

10 Agradecimientos Me gustaría expresar mis agradecimientos al Dr. Francisco J. Vizoso, por haberme dado la oportunidad de formar parte de su equipo, y enseñarme a transmitir de la forma más correcta posible el contenido de este trabajo. Al Prof. Manuel F. Fresno por aceptar ser el tutor de este trabajo. También me gustaría mostrar mis agradecimientos, de una forma muy especial, a Noemí Eiró, por haberme enseñado, guiado y compartido la realización de este proyecto. Pero sobre todo, por haberme apoyado en los momentos más tensos, y por estar siempre dispuesta a ayudar con una sonrisa. A Sara Atienza, por haberme explicado los pasos a seguir en el laboratorio y haberme ayudado en la realización de las tinciones inmunohistoquímicas; pero sobre todo, por estar también siempre dispuesta a ayudar. Agradecer al Dr. Luis Ovidio González y a la Dra. Nana Beridze sus análisis anatomopatológicos. Así mismo, quisiera agradecer a la Unidad de Investigación de la Fundación Hospital de Jove, su grata acogida y el cariño con el que me han tratado; así como el fomentar un agradable ambiente en el lugar de trabajo. Porque sin su estimada ayuda, la realización de este proyecto de investigación no habría sido posible. A Jorge García, por su ayuda en todo momento, su paciencia, sus ánimos y por ser mi mayor motivación. 2

11 Introducción 3

12 Introducción 1. La Próstata 1.1. Situación y relaciones La próstata es una glándula sexual del hombre localizada en la pelvis anatómica. Se encuentra por debajo del cuello vesical, detrás del pubis y delante del recto. Está atravesada por la uretra prostática y por los conductos eyaculadores. El volumen prostático normal oscila entre g (anchura de 3,5-4cm, diámetro anteroposterior de 2 cm, y altura de 3-3,5 cm) (1). Desde el punto de vista clínico, en el examen rectal, la próstata se encuentra constituida por dos lóbulos laterales, separados por un surco central. También existe un lóbulo medio que puede proyectarse en la vejiga en los hombres de edad avanzada. Estos lóbulos no se corresponden con estructuras histológicamente definidas en la próstata normal, pero suelen estar en relación con el crecimiento patológico de la zona de transición lateralmente, y las glándulas periuretrales centralmente (2). 1.2 Estructura La próstata está compuesta aproximadamente por un 70% de elementos glandulares y un 30% de estroma fibromuscular. El estroma de la próstata consiste principalmente en células de músculo liso y fibroblastos, junto con otras poblaciones de células endoteliales, nerviosas, y procedentes de la infiltración inflamatoria. El microambiente del tejido estromal, juega un importante papel en la producción autocrina/paracrina de diferentes factores, así como en la producción de moléculas estructurales encargadas de mantener el comportamiento normal de la célula y la homeostasis de diferentes órganos (3). 4

13 Introducción Los elementos glandulares de la próstata, se encuentran divididos en diferentes zonas. Así, en el ángulo que divide a la uretra preprostática y prostática, se encuentra la zona transicional, representando el 5-10% del tejido glandular de la próstata. Esta zona de transición, da origen, por lo común, a la hipertrofia benigna de próstata HBP, y se estima que el 20% de los adenocarcinomas de la próstata se originan en ella (4). Los elementos glandulares, cuyos conductos se encuentran en la zona central de la uretra, alrededor de los oficios de los conductos eyaculadores, constituyen el 25% del tejido glandular de la próstata; extendiéndose hasta la base de la vejiga. Sólo del 1 al 5% de los adenocarcinomas de próstata se originan en la zona central, aunque puede estar infiltrada por cánceres de zonas adyacentes (4). La mayor parte del tejido glandular prostático (70%) lo constituye la zona periférica, que se extiende por las caras posterior y lateral de la glándula. Aproximadamente el 70% de los cánceres de próstata se originan en esta zona, siendo también la región más afectada por la prostatitis crónica. 2. Hiperplasia benigna prostática La hiperplasia benigna prostática (HBP) es una patología cuya elevada prevalencia aumenta con la edad. La HBP afecta a 1 de cada 4 hombres de 50 años, a 1 de cada 3 hombres de 60 años y a más de la mitad de los hombres de más de 80 años. No obstante, raramente aparecen síntomas antes de los 40 años (5). La HBP es una enfermedad que se caracteriza por el crecimiento histológico de la glándula prostática, que produce una obstrucción al flujo de salida urinario, dando lugar a los denominados síntomas del tracto urinario inferior (STUI). Estos síntomas se dividen en 5

14 Introducción irritativos, como puede ser la polaquiuria, la nocturia, la urgencia miccional o la incontinencia; y los síntomas obstructivos, como la dificultad para iniciar la micción, un chorro miccional débil o intermitente, el goteo post-miccional, la sensación de vaciado incompleto o la retención de orina (6). Aunque la patogénesis de la HBP no es bien conocida, actualmente se reconoce la influencia del estroma en el crecimiento hiperplásico de la próstata, de manera que se ha demostrado que determinados cambios en el estroma conducen a nuevas interacciones estroma-epitelio que dan lugar a la progresión de la hiperplasia. De esta forma, se han objetivado diversos cambios en la producción de hormonas, citoquinas, factores de crecimiento y otras moléculas, habiéndose involucrado a la inflamación como un factor añadido de desarrollo y progresión de la HBP (7-9). 3. Epidemiología del cáncer de próstata 3.1. Conceptos generales El cáncer de próstata (CaP) es el tercer tumor más frecuente entre los hombres en países desarrollados, y el sexto tumor más común en el mundo. Actualmente, constituye la segunda causa más frecuente de mortalidad por cáncer en los varones, después del carcinoma de pulmón (10). El CaP supone un importante problema de salud en los países desarrollados, dado que afecta con mayor frecuencia a los varones de edad avanzada. Así, alrededor del 15% de los cánceres en varones, en países desarrollados, se corresponden con CaP; frente a una tasa del 4% en aquellos países en vías de desarrollo (11). La mayor incidencia de CaP se 6

15 Introducción registra en EEUU, Canadá y países escandinavos, y la menor en China y otros países asiáticos (12). El CaP es diagnosticado infrecuentemente antes de los 50 años de edad (< 0,1% de todos los pacientes). Los hombres que padecen esta patología, suelen tener una edad comprendida entre los 72 y 74 años, y aproximadamente el 85% de los pacientes son diagnosticados después de los 65 años (10). 3.2 Incidencia y mortalidad La incidencia a nivel mundial del CaP es del 25,3 por cada hombres (13). En Europa, el CaP representa actualmente el 22,2% del total de los cánceres diagnosticados en el hombre; siendo su tasa de mortalidad del 9,3% (14). En España su incidencia ha disminuido en los últimos años, encontrándose en aproximadamente 56 casos por habitantes. La tasa de mortalidad, ajustada a la población estándar europea por cáncer de próstata en España, fue de 17,57 casos por habitantes. Esta mortalidad ha experimentado un descenso progresivo desde el año 1996, donde la tasa era de 24,16 por habitantes. A pesar de ello se estima que en el año 2012 habrá nuevos diagnósticos de CaP y muertes debidas a esta patología (15, 16). 3.3 Supervivencia de los pacientes con cáncer de próstata El estudio EUROCARE-4, analiza la supervivencia de pacientes adultos, diagnosticados de cáncer, entre los años 1978 y 2002, en 23 países europeos. Los registros poblacionales españoles que han participado son Albacete, País Vasco, Castellón, Girona, Granada, Murcia, Navarra, y Tarragona. Según este estudio, la supervivencia de los 7

16 Introducción pacientes diagnosticados de CaP en España, es del 92,7% al año del diagnóstico, y del 82,4% a los 5 años (17, 18). Esta supervivencia ha mejorado respecto a los datos aportados por el estudio EUROCARE-3, que determinaba la supervivencia para los pacientes diagnosticados de CaP en España, entre los años , del 86% al año del diagnóstico y del 65,5% a los 5 años (19). 4. Factores de riesgo para el cáncer de próstata 4.1 Edad El envejecimiento aumenta el riesgo de CaP. El riesgo varía con la edad, siendo solamente del 0,005% para los menores de 39 años, 2,2% entre los 40 y 59 años, y subiendo al 13,7% para el grupo de edad comprendido entre los 60 y 79 años (20). La probabilidad de encontrar un CaP cuando se realizan autopsias en hombres fallecidos es mucho mayor, alrededor del 20% entre los 50 y 60 años, y aumenta hasta un 50% en hombres entre 70 y 80 años. Lo que indica un alto grado de prevalencia de la enfermedad subclínica (20). 4.2 Raza Los índices más bajos de CaP se registran en la población de origen asiático, siendo de 107,2/ habitantes; seguidos de la población hispana con un 127,6/ habitantes, y los caucásicos con 179,9/ habitantes. Pero sin duda, la raza con mayores tasas de CaP, alcanzando cifras de 275,3/ habitantes, es la afro-americana. Los índices de muerte por CaP también son mayores en afro-americanos (21). 8

17 Introducción La supervivencia a cinco años para los afro-americanos ha mejorado en los últimos 30 años, llegando al 93%; pero sin alcanzar el 98% de los caucásicos (22). 4.3 Factores genéticos La distribución del CaP en el entorno familiar puede ser debido a la susceptibilidad genética, la exposición a factores ambientales comunes, o esporádica, puesto que la prevalencia de este tumor es muy alta. Aproximadamente el 10-15% de los pacientes con CaP (caucásicos, afro-americanos o asiáticos), tienen como mínimo un familiar que también está afectado (23). El riesgo de desarrollar CaP en los familiares, aumenta con el número de personas afectadas en la familia, y cuanto menor sea la edad al diagnóstico. Cuando un familiar de primer grado padece un CaP, se duplica el riesgo como mínimo. Cuando dos o más familiares de primer grado se encuentran afectados, el riesgo aumenta entre 5 y 11 veces (24, 25). Una pequeña subpoblación de pacientes con CaP (9%), presenta un auténtico CaP hereditario; es decir, poseen tres o más familiares afectados o al menos dos familiares con enfermedad de comienzo antes de los 55 años (26). Los pacientes con CaP hereditario suelen tener un comienzo 6-7 años antes que los casos espontáneos, pero no difieren en otros sentidos (27). 4.4 Dieta Entre los factores alimentarios que podrían influir en la aparición del CaP, figuran el aporte calórico total, la grasa de origen alimentario, la carne roja, los productos lácteos, algunos micronutrientes y vitaminas, el consumo de frutas y verduras, minerales (calcio, selenio) y fitoestrógenos (isoflavonoides, flavonoides, lignanos) (28, 29). Un exceso de estos 9

18 Introducción alimentos, influye en la activación o inhibición de determinados factores que intervienen en la homeostasis, controlando la proliferación celular. 4.5 Hormonas Los andrógenos tienen un importante papel tanto en el desarrollo y crecimiento de la próstata, como en su tratamiento. La próstata es el lugar de mayor producción no testicular de dihidrotestosterona. La 5α-reductasa es una enzima que convierte la testosterona en dihidrotestosterona, que actúa sobre las células epiteliales prostáticas. La deprivación androgénica con antiandrógenos, como la flutamida y agonistas LHRH, es un tratamiento establecido en el CaP avanzado (30). 5. Diagnóstico Los principales instrumentos diagnósticos para obtener indicios de CaP, son el tacto rectal (TR), la concentración sérica de PSA y la ecografía transrectal (ETR). El diagnóstico definitivo para su detección, se basa en la presencia de adenocarcinoma en muestras de biopsia de próstata o piezas quirúrgicas. Con el examen histopatológico, se podría llegar a la gradación y determinación de la extensión del tumor. 5.1 Tacto rectal (TR) La palpación de la próstata mediante el TR puede detectar alteraciones en el tamaño, consistencia o uniformidad. En aproximadamente el 18% de todos los pacientes, se detecta un CaP a partir de un TR sospechoso aislado, con independencia de la concentración de PSA (31, 32). 10

19 Introducción Se trata de una prueba con mucha variabilidad inter-examinador y con bajo valor predictivo positivo para la detección del CaP (33). 5.2 Antígeno prostático específico (PSA) El PSA es una serina proteasa afín a la calicreína que producen, casi de forma exclusiva, las células epiteliales de la próstata. Posee especificidad de órgano, pero no de cáncer. Por tanto, las concentraciones séricas pueden aumentar en presencia de hipertrofia benigna de próstata (HBP), prostatitis y otras enfermedades no malignas (34). En sangre el PSA puede circular de forma libre (PSA libre) o bien unido a proteínas, alfa-1 antiquimiotripsina (PSA complex) y alfa-2 macroglobulina; siendo la suma de todos el PSA total. No existe un punto de corte definido del nivel de PSA que indique con certeza la existencia de un CaP. La interpretación del nivel de PSA del paciente se ha de realizar en función de su edad y los valores de referencia que aparecen en la tabla 1 (35). 11

20 Introducción Tabla 1: Niveles de PSA en relación con la edad. EDAD (años) PSA total (ng/ml) < , , ,4 >70 0-6,4 Según el Prostate Cancer Prevention Trial, la incidencia de CaP en varones mayores de 55 años, con tacto rectal normal y PSA < 4ng/ml, seguidos durante 7 años, fue del 15%, y un 15% de éstos tenían CaP de alto grado (36). Con el seguimiento postoperatorio del PSA, en la actualidad se puede detectar la recurrencia bioquímica del CaP muchos antes de que la enfermedad se manifieste clínicamente. En pacientes prostatectomizados, se considerará recurrencia bioquímica de la enfermedad cuando los niveles séricos de PSA superen los 0,4 ng/ml. Por otro lado, en aquellos pacientes cuya intención curativa haya sido la radioterapia o braquiterapia, se considerará recurrencia bioquímica de la enfermedad cuando los niveles séricos de PSA se incrementen en 2 ng/ml sobre el PSA nadir (37) Velocidad de PSA Es el incremento anual absoluto del PSA sérico (ng/ml/año) (38). Un incremento del PSA > 0,75mg/ml/año con un mínimo de tres determinaciones en no menos de 18 meses, incrementa la sensibilidad del test de PSA y facilita la indicación de realizar una biopsia de próstata. 12

21 Introducción 5.3 Biopsia prostática El método diagnóstico confirmatorio de elección para el CaP es la biopsia sistematizada por vía transrectal y bajo control ecográfico. Además la ETR también resulta de utilidad para evaluar la presencia de lesiones tumorales en la glándula prostática, así como para valorar su extensión, el volumen de la próstata y calcular la densidad de PSA (PSA/volumen glándula). El primer valor elevado de PSA no debería conllevar una biopsia inmediata. El valor de PSA debe comprobarse al cabo de unas semanas con el mismo análisis en condiciones normalizadas (39). 6. Screening del cáncer de próstata En la actualidad, existe generalmente acuerdo en que la detección temprana del CaP en pacientes asintomáticos, debe comenzar a los 50 años. Aunque algunos expertos consideran que los pacientes con riesgo más elevado, como los afro-americanos y los que tienen un familiar de primer grado afectado, deben ser evaluados entre los años. Un intervalo de detección de 8 años podría ser suficiente en aquellos hombres con niveles de PSA de 1 ng/ml. Además, la prueba de PSA ya no sería necesaria en pacientes mayores de 75 años y con un valor basal de PSA de 3 ng/ml, debido al bajo riesgo de fallecer a causa de CaP (40). 13

22 Introducción 7. Estadiaje 7.1 Clasificación TNM Whitmore (1956) presentó el primer sistema de clasificación de la estadificación clínica del cáncer de próstata, que luego fue modificado por Jewett (1975). La American Joint Committee for Cancer Staging and End Results Reporting (AJCC) adoptó el sistema que se basa en la extensión del tumor primario, la afectación de los ganglios linfáticos regionales, y la presencia de metástasis a distancia (TNM) en 1975 (41). 7.2 Puntuación de Gleason La puntuación o score de Gleason se realiza mediante el estudio histopatológico del tejido obtenido en la biopsia prostática, valorando su grado de diferenciación (41, 42): GX: El grado no puede evaluarse. G1: Bien diferenciado (anaplasia leve) (Gleason 2-4). G2: Diferenciado moderadamente (anaplasia moderada) (Gleason 5-6). G3-4: Diferenciado precariamente o no diferenciado (anaplasia marcada) (Gleason 7-10). 8. Inflamación y cáncer La lesión de los tejidos, ya sea física, química o infecciosa, desencadena una secuencia de eventos que constituyen la respuesta inflamatoria. La inflamación es un mecanismo importante que puede eliminar el agente responsable de la lesión e iniciar la reparación de los tejidos mediante una respuesta inmunitaria innata y adaptativa bien coordinada. Cualquier fallo en el preciso control de esta respuesta inmune puede perturbar el microambiente celular, lo que conduce a alteraciones en los genes relacionados con el 14

23 Introducción cáncer, y la modificación postraduccional de proteínas cruciales implicadas en el ciclo celular, reparación del ADN y la apoptosis (43). La inflamación crónica es un factor de riesgo para el desarrollo del cáncer. En muchos estudios epidemiológicos, el papel de la inflamación crónica en el proceso de carcinogénesis se examinó a través de estudios de las citoquinas pro-inflamatorias y antiinflamatorias, junto con otros factores como las infecciones víricas y los marcadores genéticos que intervienen en la respuesta inflamatoria (44). Esta relación entre la inflamación y el desarrollo del cáncer se afianza con el papel que desempeñan las citoquinas en la promoción de la angiogénesis, metástasis, la subversión de la inmunidad adaptativa y el microambiente tumoral (45). Existen evidencias que apoyan el papel de la inflamación en el CaP. Así, se encontraron altos niveles de citoquinas pro-inflamatorias en las muestras de tejido prostático y en el semen de los pacientes con prostatitis crónica (46); así como en el líquido prostático recogido de las prostatectomías (47). También se han identificado componentes de bacterias y virus en muestras patológicas de los hombres con CaP. Además, existen datos que revelan que la presencia de patógenos en el sistema urinario puede contribuir a la transformación maligna del epitelio prostático, a través de la activación de los receptores Toll-like (TLRs) (45). Por otra parte, los niveles de diferentes interleuquinas (IL), como la IL-1 y la IL-6, así como el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), podrían estar asociados con la inflamación, los elevados niveles séricos de PSA y la progresión tumoral (48). La inhibición de estas citoquinas podría ser una posible diana terapéutica en el tratamiento del CaP. 15

24 Introducción Sin embargo, hasta que no se comprenda mejor la carcinogénesis prostática, el verdadero impacto global de la inflamación en el CaP continúa siendo difícil de alcanzar. 8.1 Interferon-β Los interferones (IFNs) son una familia de glicoproteínas naturales a la que pertenece el IFN-α, IFN-β e IFN-γ. La actividad antivírica del IFN condujo a su descubrimiento, pero más tarde los estudios revelaron que por inducción de la diferenciación, la fase de acumulación y la apoptosis, el IFN-β, puede inhibir directamente el crecimiento de las células tumorales. También inhibe la expresión de oncogenes y activa a los linfocitos T, las células natural killer (NK) y a los macrófagos. Además el IFN-β es capaz de inhibir el crecimiento tumoral y el desarrollo de metástasis indirectamente, a través de la activación del óxido nítrico (NO) (49, 50). El IFN-β también contribuye a la regulación al alza de los receptores androgénicos en el CaP (51). Estos estudios apoyan firmemente el potencial efecto terapéutico del IFN-β en el CaP metastásico hormono-refractario. Estos datos apoyan la hipótesis de que la presencia sostenida del IFN-β en las lesiones tumorales, puede inducir la regresión de las mismas. También implica que el IFN-β o el gen que lo codifica, tiene un gran potencial en el tratamiento del CaP. 8.2 IL- 1β La familia de la IL-1 está compuesta por dos factores (IL-1α e IL-1β), dos receptores transmembrana (IL-1RI e IL-1RII) y el receptor antagonista IL-1Ra. La IL-1α se localiza en la membrana celular o en el citosol, y se cree que regula el medio intracelular. Por otra parte, la IL-1β es utilizada por la enzima convertidora de IL-1β (ICE) para transformarla en 16

25 Introducción su forma activa madura, y posteriormente secretarla de forma extracelular. Se ha observado, que los pacientes con enfermedades inflamatorias e infecciosas mostraron mayores concentraciones plasmáticas de IL-1β, pero no de IL-1α, lo que sugiere la función sistémica de la IL-1β (52). La IL-1 es una citoquina pluripotente responsable del funcionamiento fisiológico normal, que puede ir desde la permeabilidad vascular, la aparición de fiebre durante una sepsis, hasta la secreción de citoquinas adicionales en enfermedades autoinmunes. Otras funciones de la IL-1 incluyen la producción y secreción de prostaglandinas, hormonas pituitarias y colagenasas. La IL-1 también estimula el sistema inmunológico para impulsar la producción de los linfocitos. Por lo tanto, existe un importante equilibrio entre los efectos beneficiosos y perjudiciales de la Il-1 (52). La expresión de la familia de IL-1 ha sido estudiada en diferentes tumores, entre ellos el CaP, en el que Ricote y cols. proponen que la familia de la IL-1 podría estar relacionada con la proliferación celular, pues la expresión de IL-1α e IL-1Ra es característica en CaP comparado con próstata normal y HBP (53). Las células tumorales producen directa o indirectamente IL-1β (54). Diferentes estudios han documentado que la proteína Il-1β produce, tanto en humanos como en animales, diferentes líneas celulares que incluyen sarcomas, tumores ováricos, y células carcinomatosas transicionales (55). Ejemplos de tumores sólidos en los cuales la expresión de IL-1β se encuentra elevada son los de mama, colon, pulmón, cabeza, cuello y melanomas. Además, estos pacientes con sobre-expresión de IL-1β tumoral, tienen peor pronóstico. 17

26 Introducción 8.3 NFkB El factor nuclear kappa (NFkB), es un factor de transcripción, una proteína identificada por primera vez por Sen y Baltimore (56). Su correcto funcionamiento interfiere en la transcripción de multitud de genes, incluyendo múltiples citoquinas, factores del crecimiento, moléculas de adhesión, inmunorreceptores y proteínas de fase aguda (57). En la tabla 2, se muestran las citoquinas reguladas por el NFkB. Tabla 2: Citoquinas humanas reguladas por NFkB. Factores Necrosis Tumoral Interleuquinas Quimioquinas Factores Estimuladores de colonias Interferones TNF-α IL-1β IL-8 G-CSF INF-β TNF- β IL-2 Gro α, β, γ GM-CSF IL-6 MIP-1 IL-12 MCP-1 RANTES G-CSF (factor estimulador de colonias granulocíticas); GM-CSF (factor estimulador de colonias granulocíticas y macrófagos); Gro α (péptido α regulador del crecimiento); MCP (proteina-1 quimiotáctica de macrófagos); MIP (proteína-1 inflamatoria de macrófagos); RANTES (reguladores de la activación, expresión y secreción de las células T). Las vías en las que interviene el NFkB, han sido identificadas como vías críticas en la iniciación y progresión del cáncer en humanos, incluyendo el cáncer de próstata (58). 18

27 Hipótesis y Objetivos 19

28 Hipótesis y Objetivos Los factores inflamatorios que actúan sobre la glándula prostática se han relacionado con un mayor riesgo de malignización de la misma. Un mejor conocimiento de los biomarcadores que intervienen en la HBP y en el CaP, así como el mejor conocimiento de su patogenia, constituyen procesos necesarios para llegar a una correcta estratificación del riesgo de estas patologías entre los hombres con enfermedad localizada, y la revelación de posibles dianas terapéuticas. El objetivo de este estudio ha sido establecer el patrón diferencial de expresión del IFNβ, la IL-1β y el NFkB, en el tejido hiperplásico y tumoral prostático. Para ello, hemos realizado un estudio inmunohistoquímico usando arrays de tejido y anticuerpos específicos contra los factores a estudio. Más de determinaciones, han sido realizadas, en muestras prostáticas de intervenciones quirúrgicas y biopsias diagnósticas de 118 pacientes con carcinoma prostático y de 50 pacientes con hiperplasia prostática. Los objetivos concretos han sido los siguientes: 1. Determinar la expresión global de los factores a estudio (IFNβ, IL-1β y NFkB) en el tejido prostático tumoral y en el hiperplásico. 2. Determinar la expresión de los distintos factores de inflamación por las células epiteliales, los fibroblastos y las células mononucleares inflamatorias, presentes en la HBP y en el tejido tumoral prostático. 3. Determinar la relación en la expresión simultánea de los distintos factores a estudio, tanto en la HBP como en el CaP. 20

29 Hipótesis y Objetivos 4. Relacionar la expresión de estos factores de inflamación de la HBP y del tejido tumoral con las características clínico-patológicas de los pacientes. 5. Relacionar la expresión de las proteínas relacionadas con el proceso inflamatorio en el CaP con la recurrencia bioquímica y la supervivencia. 21

30 Pacientes y Métodos 22

31 Pacientes y Métodos 1. Consideraciones éticas El estudio ha sido aprobado por el Comité de Ética e Investigación de la Fundación Hospital de Jove. 2. Selección de pacientes En este estudio se analizan las muestras procedentes de la biopsia prostática de 50 pacientes afectos de HBP, entre los años 2003 y También se analizan las muestras procedentes de la intervención quirúrgica prostática de 118 pacientes afectos de CaP, entre los años 1999 y Los pacientes proceden de la Fundación Hospital de Jove, Gijón. Las historias clínicas se obtuvieron de los archivos de Historias Clínicas, de los archivos de Anatomía Patológica, y de los archivos del Servicio de Urología. En la tabla 3 están representadas las características clínico-patológicas de los pacientes con HBP, así representamos la edad y el PSA previo a la biopsia diagnóstica en estos pacientes. 23

32 Pacientes y Métodos Tabla 3: Características basales de los 50 pacientes con HBP. Características Pacientes Nº (%) Edad (años) 67 < (50%) 25 (50%) PSA (ng/ml) 10 > (90%) 5 (10%) 24

33 Pacientes y Métodos Las principales características de los pacientes con CaP, respecto a edad, estadío tumoral, score de Gleason y nivel de PSA (ng/ml) previo a la biopsia diagnóstica, están representadas en la Tabla 4. Tabla 4: Características basales de los 118 pacientes con carcinoma prostático. Características Edad (años) 67 > 67 Estadío tumoral T2 T3-4 Score de Gleason PSA (ng/ml) 10 > 10 No recurrencia bioquímica (n= 78) Nº (%) 45 (57,7) 33 (42,3) 72 (92,3) 6 (7,7) 27 (34,6) 40 (51,3) 11 (14,1) 59 (75,6) 19 (24,4) Recurrencia bioquímica (n= 40) Nº (%) 16 (40) 24 (60) 24 (60) 16 (40) 12 (30) 18 (45) 10 (25) 24 (60) 16 (40) 25

34 Pacientes y Métodos 3. Elaboración de mallas de tejido y tinción inmunohistoquímica Con el objetivo de determinar la expresión del IFNβ, la IL-1β y el NFkB, en las muestras de tejidos de los pacientes a estudio, hemos elaborado mallas de tejido, bloques o arrays de tejido, lo que nos ha permitido procesar las 118 y 50 muestras de pacientes a la vez. A pesar de partir de 122 casos de pacientes con CaP, hemos sufrido la pérdida de 4 de ellos, debido fundamentalmente, a que la zona tumoral era demasiado pequeña para poder realizar un punch de la misma. Las muestras de los tejidos se fijaron en formol tamponado al 4% durante un mínimo de 24h. Tras esto, se realizó un estudio macroscópico, incluyendo en parafina las secciones representativas para el diagnóstico anatomopatológico. Para su inclusión se llevó a cabo el siguiente proceso: Formol 15 - Alcohol 70ºC 30-96ºC 30-96ºC ºC ºC ºC 45 - Xilol 60 - Xilol 60. Tras la obtención de bloques de tejido y con la ayuda de un microtomo (Leica Micosystems GMBH, Wetzlar, Alemania), se cortaron muestras a un grosor de 3µm, siendo posteriormente teñidos con hematoxilina-eosina para seleccionar las zonas hiperplásicas y tumorales más representativas. Usando éstos como mapa en los bloques de parafina correspondientes, elaboramos el array mediante manual tissue microarray (Modelo MTA-1, Beecker instruments, Sun Prarie, Wisconsisn, USA). El procedimiento consiste en que se extrae un cilindro de parafina del bloque receptor, que es rellenado por otro cilindro con el tejido extraído del bloque donante, en nuestro caso con tejido hiperplásico y tumoral prostático. De forma paralela a la realización del array, se va cubriendo una plantilla previamente elaborada, en la que se escribe la situación de cada 26

35 Pacientes y Métodos cilindro y su número de biopsia correspondiente. Cada uno de los casos es introducido en el array por duplicado. Una vez han sido introducidos todos los casos, el bloque se coloca en una estufa a 60ºC, lo que favorece una correcta unión de los cilindros al resto del bloque de parafina, realizándose un posterior enfriamiento de éste, y dando como resultado secciones de 3 µm de espesor. Los cortes son recogidos en portaobjetos pretratados específicos para su uso en el inmunoteñidor. Figura 1: (a) Elaboración de array mediante manual tissue array ; (b) Tinción inmunohistoquímica realizada sobre un array. Sobre estas secciones, se ha realizado el estudio inmunohistoquímico utilizando para ello anticuerpos específicos frente a IFNβ, IL-1β y NFkB. Previo a la inmunotinción se ha realizado el desparafinado y desenmascaramiento antigénico de los anticuerpos. El pretratamiento con calor se realizó mediante un sistema automatizado denominado PT- Link (Dako, Glostrup, Dinamarca), el cual consta de dos tanques, uno de ellos con una solución de recuperación antigénica Tris-EDTA, ph9 (Target Retrieval Solution, Dako), 27

36 Pacientes y Métodos mientras el otro contiene como solución de recuperación antigénica tampón citrato, ph6 (Target Retrieval Solution, Dako) usando uno u otro dependiendo de las características del anticuerpo primario. Este sistema provocó el calentamiento de las muestras a 95ºC durante 20 minutos, atemperándolas posteriormente hasta 65ºC. Finalmente, las secciones se mantuvieron un mínimo de 5 minutos en tampón de lavado, en ambos casos. Los cortes se introdujeron en las bandejas especiales del Auto-Stainer Dako (teñidor automático), donde se realizó la técnica de inmunohistoquímica siguiendo estos pasos: a) lavado en tampón; b) bloqueo de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 min; c) incubación con anticuerpos primarios (tiempo dependiente del anticuerpo usado) (Tabla 5); d) lavado en tampón (Wash Buffer, Dako) para eliminar el exceso de anticuerpo; e) incubación de los cortes con el sistema de polímeros de dextrano durante 30 min (EnVisionTM Detection Kit, Dako). El sistema de polímeros de dextrano se basa en la utilización de un polímero de alto peso molecular, al que se conjugan covalentemente un gran número de moléculas de peroxidasa y anticuerpo secundario (inmunoglobulinas antiratón/conejo); g) lavados con tampón; h) la visualización del marcaje inmunohistoquímico se realiza con tetraclorhidrato de diaminobencidina (DAB) (Dako) durante 7 min y 30 seg.; i) contratinción con hematoxilina de Harris durante 2 min.; j) las muestras se lavaron, se deshidrataron con alcoholes crecientes y xilol, y se montaron con la ayuda de un montador automático para posteriormente ser observadas al microscopio óptico Olympus BX51. Se incluyeron controles negativos y positivos conocidos para asegurar la especificidad de la técnica. 28

37 Pacientes y Métodos Tabla 5: Anticuerpos primarios utilizados para la detección de proteínas mediante imnunohistoquímica. Anticuerpo primario Recuperación antigénica Dilución del anticuerpo Tiempo incubación Referencia Linker Guardado IFNβ ph9 1: T3236 EPITOMICS IL-1β Ph6 1: NB Bionova NFkB ph9 1: EPITOMICS NO NO NO -20ºC -20ºC -20ºc 4. Análisis de la tinción tisular Se ha estudiado la localización de la inmunoreactividad en la muestra, el porcentaje de células teñidas y la intensidad de la tinción de las mismas, para cada anticuerpo. Se ha utilizado un sistema de análisis de imagen que consta de un microscopio (Olympus BX51) acoplado a una cámara fotográfica, y un programa adaptado (analysis, Soft Imaging System, Münster, Alemania), para poder cuantificar el área teñida en cada caso. En un principio, cada tinción fue teñida con el anticuerpo a estudio y contrastada con la tinción con hematoxilina, puesto que cada tipo de tinción tiene umbrales ópticos diferentes. Cada una de las dos muestras de cada paciente se analizó con un objetivo de 400X, estudiando dos áreas que fueron seleccionadas buscando las zonas que representaban tinción positiva para la proteína estudiada. El programa traza una línea alrededor de las áreas teñidas con el anticuerpo (áreas con mayor umbral óptico), quedando el resto de 29

38 Pacientes y Métodos áreas sin teñir como un fondo azulado (tejido teñido con hematoxilina, con menor umbral óptico). De la relación entre el área teñida, en amarillo, y el área no teñida por el anticuerpo, rosa, (tinción de núcleos) (Figura 2), se ha obtenido un porcentaje de área teñida de cada campo. Este porcentaje de área teñida para cada muestra fue la media de la obtenida en los dos campos analizados. Para cuantificar la intensidad de tinción se ha utilizado una escala numérica del cero al tres, reflejando el 0 la ausencia de tinción, el 1 una tinción débil, el 2 una tinción moderada, y el 3 una tinción intensa. Se ha calculado el valor de tinción; es decir, la expresión global o score, mediante una hoja de cálculo, multiplicando la intensidad de la misma por el porcentaje de área teñida. Figura 2: Sistema de tinción y análisis de imagen. 30

39 Pacientes y Métodos 5. Análisis estadístico Los resultados obtenidos de las inmuno-tinciones, han sido analizados estadísticamente mediante el programa PASW statistics 18. Las diferencias en porcentajes fueron calculadas con la prueba del Chi-cuadrado. Los valores de tinción para cada proteína han sido expresados en forma de mediana, con un intervalo mínimo y máximo. La comparación de los valores de tinción entre los grupos ha sido realizada con las pruebas no paramétricas de Mann-Whitney o de Kruskal-Wallis para muestras independientes. La correlación entre la expresión de los factores a estudio y los niveles de PSA, ha sido llevada a cabo mediante el coeficiente de correlación de Spearman. Por último, para la estimación de probabilidad de recurrencia bioquímica y el análisis de la supervivencia en pacientes con CaP, se ha utilizado el método no paramétrico de Kaplan-Meier. Las diferencias entre grupos se consideraron significativas cuando el valor de p, fue igual o inferior a 0,05. 31

40 Resultados 32

41 Resultados 1. Casos perdidos A lo largo de la realización de este estudio, en unos pocos casos, no hemos podido obtener resultados de las tinciones inmunohistoquímicas para los tres factores analizados. Ello ha sido debido a la ausencia de muestra tisular suficiente para realizar todas las determinaciones. A estos resultados los hemos denominado casos perdidos. Hemos de recordar que las muestras obtenidas para el estudio provenían de biopsias e intervenciones quirúrgicas, y no hemos podido tener acceso a todo el material necesario, puesto que ha sido utilizado por el Servicio de Anatomía Patológica para su correcto diagnóstico. En la tabla 6 se enumeran los casos perdidos para cada determinación. Tabla 6: Casos perdidos del estudio. HBP Cáncer Próstata Válidos Perdidos Válidos Perdidos IFNβ IL-1β NFkB

42 Resultados 2. Expresión global de IFNβ, IL-1β y NFkB en la HBP y en el CaP Uno de los objetivos de este estudio ha sido determinar la expresión global (score) de los factores cuyo análisis hemos llevado a cabo, tanto en tejido hiperplásico prostático como en tejido tumoral. En la Figura 3, podemos observar de formar comparativa la diferente expresión de tinción del IFNβ, IL-1β y NFkB, tanto en pacientes con HBP como en pacientes con CaP. En estas imágenes apreciamos la expresión global, que aparece teñida en color marrón, de las células epiteliales, los fibroblastos y las células mononucleares inflamatorias, en ambos grupos de pacientes. En azul observamos teñidos los núcleos de los distintos tipos celulares. 34

43 Resultados A) IFNβ en HBP (200x) B) IFNβ en CaP (200x) C) IL-1β en la HBP (200x) D) IL-1β en el CaP (200x) E) NFkB en la HBP (200x) F) NFkB en el CaP (200x) Figura 3: Tinción de tejido prostático hiperplásico y tumoral para el IFNβ, la IL-1β y el NFkB. 35

44 Resultados En la Tabla 7, hemos definido la expresión global de los tres factores a estudio en función de su mediana, describiendo también un intervalo mínimo y máximo de su expresión. Podemos observar que la expresión de la tinción de IFNβ es notablemente superior en los pacientes con HBP, mientras que la de IL-1β es mayor en aquellos con CaP. Sin embargo, la expresión de la tinción del NFkB resulta similar tanto en la HBP como en el CaP. Este hallazgo nos ha llevado a la utilización de test estadísticos no paramétricos (U de Mann Whitney para muestras independientes), que nos han establecido una diferencia estadísticamente significativa a través del valor de p que observamos en la tabla, para la distribución de la expresión de la tinción de IFNβ e IL-1β, entre el tejido prostático hiperplásico y el tumoral. Como podemos observar en la tabla 7, resulta llamativo el hecho de que existen muestras tisulares de tumores en los que no ha habido expresión alguna de los factores a estudio; mientras que en todas las muestras de tejido hiperplásico siempre hemos encontrado cierta expresión de los mismos. 36

45 Resultados Tabla 7: Expresión global de IFNβ, IL-1β y NFkB en tejido inflamatorio prostático y en tejido tumoral prostático. HBP Cáncer Próstata Valor de p Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo IFNβ 254,01 151,9 285,06 187, ,76 0,047 IL-1β 103,98 43,58 159,58 152, ,23 < 0,0001 NFkB 254,58 166,52 279,99 252, ,11 0,686 37

46 Resultados 3. Expresión de IFNβ, IL-1β y NFkB por los distintos tipos celulares Otro objetivo de nuestro estudio, ha sido evaluar el porcentaje de expresión de los diferentes factores en función del tipo celular; es decir, la expresión de cada uno de ellos por las células epiteliales (hiperplásicas o tumorales), los fibroblastos y las células mononucleares inflamatorias; tanto en el tejido hiperplásico prostático como en el tumoral. Como podemos observar en la tabla 8, la expresión para cada factor en función del tipo celular resulta muy similar, tanto en la HBP como en el CaP, no pudiendo establecerse diferencias estadísticamente significativas. Asimismo, hemos comprobado que, de los 118 pacientes con CaP, existen 12 casos en los que, de forma conjunta y simultánea, ningún tipo celular expresa ninguno de los factores a estudio (IFNβ, IL-1β, NFkB). 38

47 Resultados Tabla 8: Expresión de IFNβ, IL-1β y NFkB por las células epiteliales, los fibroblastos y las células mononucleares inflamatorias (C.M.I.). HBP Cáncer Próstata C. Tumoral Fibroblasto C.M.I. C. Tumoral Fibroblasto C.M.I. Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) IFNβ 44 (100) 44 ( 100) 43 (97,7) 102 (97,1) 103 (98,1) 101 (97,1) IL-1β 41 (100) 41 (100) 39 (95,1) 106 (100) 101 (95,3) 101 (95,3) NFkB 43 (100) 43 (100) 43 (100) 106 (100) 101 (95,3) 101 (95,3) 39

48 Resultados 4. Relación de la expresión simultánea de IFNβ, IL-1β y NFkB En un siguiente objetivo del estudio, hemos intentado relacionar la expresión de los diferentes factores (IFNβ, IL-1β, NFkB), cuando se expresan de forma simultánea, tanto en el tejido hiperplásico como en el tumoral. Para ello hemos utilizado test no paramétricos, a través del coeficiente de correlación de Spearman. En el tejido hiperplásico prostático analizado (Figura 4), nuestros resultados muestran una correlación directa entre la expresión del IFNβ y la IL-1β (p= 0,044). Del mismo modo, hemos obtenido una correlación directa entre los valores de score de la tinción del IFNβ y del NFkB (p= 0,016). Sin embargo, no hemos podido establecer una correlación significativa entre la expresión de la IL-1β y del NFkB (p= 0,097). 40

49 NFkB (valores de score) IL-1β (valores de score) Resultados A n: 41 r: 0,316 p: 0,044 IFNβ (valores de score) B n: 43 r: 0,364 p: 0,016 IFNβ (valores de score) 41

50 NFkB (valores de score) Resultados C n: 41 r: 0,263 p: 0,097 IL-1β (valores de score) Figura 4: A) Relación entre la expresión de IFNβ y la expresión de IL-1β en la HBP. B) Relación entre la expresión de IFNβ y la expresión de NFkB en la HBP. C) Relación entre la expresión de IL-1β y la expresión de NFkB en la HBP. Siguiendo el mismo procedimiento, hemos analizado la correlación de la expresión de los factores de forma simultánea en el tejido prostático tumoral (Figura 5); así, hemos obtenido una correlación directa entre la expresión del IFNβ y la IL-1β (p= 0,001); y del IFNβ con el NFkB (p< 0,0001). Sin embargo, no hemos encontrado una correlación significativa entre la expresión de la IL-1β y del NFkB (p= 0,169). 42

51 NFkB (valores de score) IL-1β (valores de score) Resultados ore) A n: 104 r: 0,315 p: 0,001 B n: 104 r: 0,501 p: <0,0001 IFNβ (valores de score) IFNβ (valores de score) 43

52 NFkB (valores de score) Resultados C n: 104 r: 0,136 p: 0,169 IL-1β (valores de score) Figura 5: A) Relación entre la expresión de IFNβ y la expresión de IL-1β en el CaP. B) Relación entre la expresión de IFNβ y la expresión de NFkB en el CaP. C) Relación entre la expresión de IL-1β y la expresión de NFkB en el CaP. 44

53 Resultados 5. Relación de la expresión de los factores con las características clínico-patológicas de los pacientes Continuando con los objetivos iniciales planteados en nuestro estudio, hemos intentado establecer una correlación significativa entre la expresión de IFNβ, IL-1β y NFkB, con las diferentes características clínico-patológicas de nuestros pacientes tanto en HBP como en CaP (Tabla 9). Para la determinación de la relación entre la distribución del score de los factores y la mediana de la edad de los pacientes, así como con el estadío tumoral y los niveles de PSA previos, hemos utilizado la prueba U de Mann-Whitney para muestras independientes. Sin embargo, para la determinación de la relación entre el score de los factores y el score de Gleason tumoral, hemos utilizado la prueba de Kruskal-Wallis para muestras independientes. 45

54 Resultados Tabla 9: Relación entre la expresión global (score) de los factores a estudio y las características clínico-patológicas de los pacientes con HBP o con CaP (valores de p). HBP Cáncer próstata IFNβ IL-1β NFkB IFNβ IL-1β NFkB Mediana 0,860 0,835 0,752 0,049 0,880 0,484 Edad Estadío 0,247 0,550 0,559 Tumoral Score de 0,157 0,072 0,369 Gleason PSA 0,111 0,135 0,900 0,468 0,920 0,697 previo En el tejido prostático hiperplásico analizado para nuestro estudio, los resultados muestran una correlación estadísticamente negativa, entre la expresión de IFNβ e IL-β1, y los niveles de PSA previo (p= 0,009 y p=0,01, respectivamente). Esto quiere decir que cuanto mayor sea la expresión de estas citoquinas en el tejido prostático hiperplásico, menor será el nivel de PSA previo (Figura 6). 46

55 PSA (ng/ml) PSA (ng/ml) Resultados A n: 44 r: -0,391 p: 0,009 IFNβ (valores de score) B n: 41 r: -0,399 p: 0,010 IL-1β (valores de score) Figura 6: Correlación de los niveles de expresión del IFNβ (A) y la IL-1β (B) con los niveles de PSA previo en HBP. 47

56 Resultados En cuanto a los valores analizados en los carcinomas prostáticos, nuestros resultados muestran una correlación significativamente negativa entre la expresión de IFNβ y el nivel de PSA (p= 0,035). Sin embargo, existe una correlación positiva entre la expresión de la IL-1β y el PSA previo en pacientes con CaP (Figura 7). Esto quiere decir que cuanto mayor sea la expresión de IFNβ, menor será el nivel de PSA previo; pero cuanto mayor sea la expresión de IL-1β, también aumentará el nivel de PSA. 48

57 PSA (ng/ml) PSA (ng/ml) Resultados A n: 104 r: -0,166 p: 0,035 IFNβ (valores de score) B n: 106 r: 0,199 p: 0,012 Figura 7: Correlación de los niveles de expresión del IFNβ (A) y la IL-1β (B) con los niveles de PSA previo en CaP. IL-1β (valores de score) 49

58 Resultados Por otro lado, los valores de expresión del NFkB no muestran correlación alguna con los niveles del antígeno prostático, ni en el tejido hiperplásico analizado ni en el tumoral (Figura 8). 50

59 PSA (ng/ml) PSA (ng/ml) Resultados A n: 43 r: -0,083 p: 0,597 NFkB (valores de score) B n: 106 r: -0,628 p: 0,776 NFkB (valores de score) Figura 8: Correlación de los niveles de expresión del NFkB en la HBP (A) y en el CaP (B), con los niveles de PSA previo. 51

60 Recurrencia bioquímica Resultados 6. Relación de la expresión de los factores a estudio con la recurrencia bioquímica No se ha encontrado relación entre la expresión de IFNβ, IL-1β, y NFkB; con la recurrencia bioquímica en aquellos pacientes con CaP que se sometieron al tratamiento correspondiente. Las figuras 9, 10 y 11, muestran la probabilidad de recurrencia bioquímica en los pacientes con CaP, dicotomizada en función del valor de la mediana de los scores correspondientes a los distintos factores relacionados con la inflamación. Score IFNβ 187,38 Score IFNβ > 187,38 p: 0,854 Tiempo de seguimiento (meses) Figura 9: Curvas de probabilidad de recurrencia bioquímica en función de los valores de la mediana del score del IFNβ. 52

61 Recurrencia bioquímica Recurrencia bioquímica Resultados Score IL-1β 152,27 Score IL-1β > 152,27 p: 0,331 Figura 10: Curvas de probabilidad de recurrencia bioquímica en función de los valores de la mediana del score de la IL-1β. Tiempo de seguimiento (meses) Score NFkB 252,45 Score NFkB > 252,45 p: 0,139 Figura 11: Curvas de probabilidad de recurrencia bioquímica en función de los valores de la mediana del score del NFkB. Tiempo de seguimiento (meses) 53

62 Supervivencia total Resultados 7. Relación de la expresión de los factores a estudio con la supervivencia de los pacientes No se ha encontrado relación entre la expresión de IFNβ, IL-1β, y NFkB; y la supervivencia de los pacientes con CaP. La figuras 12, 13 y 14 muestran las curvas de supervivencia de los pacientes con CaP, dicotomizadas de acuerdo al valor de la mediana de los scores correspondientes a los distintos factores estudiados. Score IFNβ 187,38 Score IFNβ > 137, 38 p: 0,515 Tiempo de seguimiento (meses) Figura 12: Curvas de supervivencia total en función de los valores de la mediana del score del IFNβ. 54