CONCLUSIONES DE LA REUNIÓN DE CITOMETRISTAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE HEMOGLOBINURIA PAROXÍSTICA NOCTURNA
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- María del Rosario Camacho García
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1 CONCLUSIONES DE LA REUNIÓN DE CITOMETRISTAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE HEMOGLOBINURIA PAROXÍSTICA NOCTURNA Participantes: Marta Morado (H.U. La Paz), José M. Bosch (H. Insular Las Palmas), Mª Ángeles Cuadrado (H. U. Marqués de Valdecilla), Angelina Lemes (H.U. Gran Canaria), Amparo Sempere (H.U. La Fe), Dolores Subirá (Fundación Jiménez Díaz), Mª Belén Vidriales (H.U. Salamanca) y Montserrat López Rubio (H. Príncipe de Asturias, Coordinadora del Registro Español de HPN). Madrid, 27 Enero 2009 INTRODUCCIÓN La Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN) es un trastorno clonal, no maligno y adquirido, de la célula madre hematopoyética pluripotente, que origina un clon de células que adquieren una mutación somática en el gen PIG-A, condicionando así, la carencia total o parcial de la expresión de proteínas ancladas a la membrana a través del GPI (Glicosil- Fosfatidil-Inositol). Es una enfermedad rara y grave, que presenta una incidencia de 0,05-0,13 casos por habitantes y año, con una prevalencia calculada de 0,7 casos por habitantes, en la que el 50% de los pacientes mueren de su enfermedad, con una mediana de supervivencia de 10 años 1,2. Clínicamente se clasifica en 1,3 : HPN Clásica: HPN con evidencia clínica de hemólisis intravascular, con un clon de granulocitos HPN cercano al 50% y sin otra patología medular. HPN asociada a otra patología medular: Clínica de hemólisis pero con historia previa o actual de patología medular asociada (anemia aplásica y síndromes mielodisplásico). El tamaño del clon de granulocitos HPN es generalmente <30% HPN subclínica: Existen células HPN sin evidencia clínica ni analítica de hemólisis. Se asocia típicamente a aplasia medular. El clon de granulocitos HPN es <1%. Para su diagnóstico se han empleado técnicas clásicas como el test de Ham o el de la Sucrosa, cuyas sensibilidades requieren la existencia de un 5% de células tipo III (ausencia total de proteínas asociadas a GPI) o un 20% de tipo II (ausencia parcial). Los test basados en tarjetas de gel tiene una sensibilidad similar al test de Ham. Por todo ello, la citometría de flujo multiparamétrica (CFM) es la técnica de elección para el diagnóstico de HPN 1,4,5. REGISTRO DE HPN El Registro Internacional de HPN (PNH Registry: surge por indicación de la FDA (EEUU) y la EMEA (CEE) tras la aprobación de Eculizumab (Soliris ) para el tratamiento de pacientes afectos de HPN. Este registro recoge información sobre seguridad y eficacia del fármaco, dado que, debido a la rareza de esta enfermedad, su indicación se ha basado en estudios con un número escaso de pacientes. Todos los pacientes con HPN que sean tratados con dicho fármaco, deberán ser incluidos en el registro. El registro permite recoger datos sobre la enfermedad tanto de pacientes tratados con Eculizumab, como en pacientes diagnosticados de HPN (clásica o no) que no sean tratados con este fármaco. Los datos básicos que se deben incluir son los referentes a la clínica, alteraciones analíticas y tipo de HPN (clásica, asociada o subclínica), especificando si la carencia de moléculas asociadas a GPI es total o parcial (tipo III o II) y el tamaño del clon en hematíes y granulocitos medido por citometría de flujo.
2 CITOMETRÍA DE FLUJO APLICADA AL DIAGNÓSTICO DE HPN Necesidad de consenso La HPN es una enfermedad rara y son pocos los casos que un citometrista tiene probabilidad de diagnosticar. Se diagnostica por "ausencia" de determinados antígenos celulares y no por la habitual "presencia", siendo preciso estudiar leucocitos y hematíes, lo que requiere una técnica especial. La ausencia de recomendaciones nacionales e internacionales hace que cada laboratorio adopte una técnica distinta, lo que complica la estandarización de los resultados 2,5,6. La puesta en marcha de un registro obliga a que los datos incluidos sean lo más homogéneos posible. El objetivo principal de este grupo de citometristas es intentar llegar a un consenso en los puntos esenciales del diagnóstico de HPN por CFM, para tratar de disminuir, en lo posible las diferencias de técnicas y homogeneizar los resultados entre distintos laboratorios. Consideraciones generales Existe acuerdo general en el grupo sobre determinados aspectos generales: El estudio de la expresión de moléculas asociadas a GPI debe realizarse en al menos dos líneas celulares, con al menos dos antígenos celulares 4,5. Con esto se evitan problemas derivados de la ausencia congénita de expresión de algún antígeno, de polimorfismos proteicos (especialmente CD16), o de la influencia de la intensidad de hemólisis o efecto de la transfusión sobre la población de hematíes. La práctica habitual es realizar el estudio en neutrófilos (± monocitos) y hematíes. No se recomienda el estudio de linfocitos ni plaquetas de forma rutinaria. El estudio de HPN debe hacerse en muestra de sangre periférica a fin de evitar interpretaciones erróneas debido a la presencia de formas mieloides inmaduras, con expresión variable de moléculas asociadas a GPI debido al estadio de madurez 4,5,7. Se puede confirmar la ausencia de formas inmaduras en sangre (por ejemplo, en los casos asociados a mielodisplasia), mediante citología convencional o valorando la madurez inmunofenotípica de la serie granulocítica (CD13/CD11b, etc.). El estudio en Médula ósea debe evitarse por la presencia de formas mieloides en varios estadios madurativos 4,5,7. En caso de sospechar HPN (por ejemplo, déficit de CD14 en monocitos o CD16 en granulocitos maduros), se recomienda solicitar una muestra de sangre para confirmar o no el diagnóstico de HPN. El estudio de HPN debe hacerse en muestras anticoaguladas con EDTA (no con heparina). Se recomienda la realización del estudio de HPN en una muestra de sangre control normal de forma paralela 5. Se recomienda realizar el estudio de granulocitos en las primeras 24h para evitar marcajes inespecíficos. Los hematíes pueden estudiarse hasta dos semanas después de su extracción, si se mantienen a 4ºC 3,5. Técnicas disponibles o Técnica de la Aerolisina-FLAER: La aerolisina procedente de la Aeromonas hydrophila es una toxina que reconoce al GPI. Las células carentes de GPI son resistentes a la lisis por dicha toxina. La variante no hemolítica de esta toxina marcada con fluoresceína (Flourescein-Labelled Aerolysin, FLAER) se ha utilizado para el estudio de HPN. Es capaz de detectar leucocitos tipo HPN con una sensibilidad del 0,5%, pudiendo asociarse a otros marcajes leucocitarios 8.
3 o o o La experiencia en el grupo con esta técnica es escasa, limitada a estudios puntuales, por lo que no se pueden hacer recomendaciones al respecto. Red-Quant y Cell-Quant : Este sistema de bolas precalibradas permite el diagnóstico de células HPN en hematíes y leucocitos. El principal inconveniente de la técnica es que considera como "normal" detectar hasta un 3% de células HPN 8,9. Dada la imposibilidad de detectar clones HPN menores de un 3% de células HPN, el grupo no utiliza de forma rutinaria esta técnica. Estudio de todas las poblaciones en un solo tubo: Está descrita una técnica que permite el estudio simultáneo de hematíes y leucocitos en un solo tubo, mediante un sistema de doble adquisición y realización de ventanas 10. La técnica es sencilla rápida y fácilmente estandarizable, útil para el diagnóstico de HPN clásica. El único inconveniente reseñable es la posibilidad de no poder adquirir suficiente cantidad de leucocitos en la segunda adquisición, necesario si se buscan clones HPN representados en escaso porcentaje. Estudio de hematíes y leucocitos de forma independiente: La mayoría del grupo realiza el estudio de hematíes y leucocitos, procesando y adquiriendo ambas poblaciones por separado. A fin de evitar el procesamiento inicial de hematíes, una opción es procesar y estudiar los leucocitos (neutrófilos y monocitos) como despistaje inicial, y si es compatible con HPN, procesar y adquirir los hematíes a continuación. Anticuerpos Monoclonales» Existe consenso en cuanto a utilizar marcaje directo con anticuerpos monoclonales, siendo preferible elegir anticuerpos frente a moléculas que se expresen de forma intensa y homogénea en células normales de sangre periférica, con poca afinidad por uniones inespecíficas 4,5,11. Los utilizados con más frecuencia son: CD16, CD24, CD66, CD55 y CD59 en Neutrófilos; CD14, CD55 y CD59 en Monocitos; CD59 y CD55 en Hematíes. Otros anticuerpos como CD52 (linfocitos y monocitos), CD87 (neutrófilos, monocitos y linfocitos T activados) o CD48 (linfocitos y monocitos) se utilizan menos frecuentemente.» La concentración de los anticuerpos debe ser la adecuada 5.» La combinación de anticuerpos y la elección de los fluorocromos a los que van asociados depende de cada citometrista.» Debe asegurase que el clon que identifica CD16 marca correctamente el antígeno asociado a GPI de los neutrófilos (FcγRIIIB). El empleo de una muestra de sangre normal como control positivo simultáneo nos permite confirmar que el marcaje es el correcto. Marcaje de Leucocitos» El marcaje multiparamétrico es de elección ya que permite aumentar la sensibilidad al detectar pequeños clones de células HPN 4,5,6.» Tradicionalmente se ha recomendado realizar lisado-marcaje para el estudio de leucocitos en HPN 5, ya que la absorción de los anticuerpos CD55 y CD59 por parte de los hematíes reduce la intensidad de fluorescencia y aumenta el coeficiente de variación (CV) para estos dos marcajes. Esto no ocurre con el resto de anticuerpos asociados a GPI ya que no son expresados por los hematíes, por lo que no hay interferencia. El grupo recomienda seguir la técnica de lisado-marcaje para el estudio de CD55 y CD59 en leucocitos, mientras que se puede realizar la técnica habitual de marcaje-lisado para el resto de anticuerpos.» El grupo recomienda utilizar para el marcaje de neutrófilos CD16, CD24 y CD66 y para el de monocitos CD14 4,5,6. Para screening pueden utilizarse únicamente CD16 y CD14 2,12. Dichos anticuerpos permiten una mejor separación entre las células normales y las HPN y su procesamiento es similar al realizado de forma rutinaria (marcaje-lisado). El estudio de CD55 y CD59 en leucocitos se puede realizar de forma simultánea o una vez analizados los
4 marcadores ya citados, cuando exista un clon de células HPN, y siempre por el método de lisado-marcaje.» La presencia de neutrófilos hipogranulados dificulta la separación ente monocitos y neutrófilos basándonos en tamaño y la complejidad (FSC y SSC). Se recomienda incluir un anticuerpo no asociado a GPI, que permita separar dichas poblaciones. Los más utilizados son CD15 y CD33 en combinación con SSC 5.» El estudio de linfocitos no se recomienda por las discrepancias en el tamaño clonal respecto a granulocitos, debido a la mayor vida media de los linfocitos 4,5.» El estudio de plaquetas, tampoco se realiza de forma rutinaria debido a la expresión débil y variable de CD55 y CD59 en plaquetas de individuos sanos 5. Marcaje de Hematíes» Tradicionalmente se ha recomendado el marcaje único para el estudio de hematíes, alegando el riesgo de aglutinación con un marcaje múltiple. Sin embargo, el marcaje mutiparamétrico permite aumentar el nivel de sensibilidad, reduciendo la tasa de falsos positivos y negativos 4,5,6. El grupo recomienda, pues, el marcaje múltiple para el estudio de hematíes.» Los anticuerpos utilizados son CD55 y CD59, especialmente este último 2,4,5,6.» Puede añadirse un marcaje para CD235 (GlyA) para seleccionar y depurar los hematíes.» La concentración de hematíes debe ser la adecuada (dilución previa al 1 ó 3%, o ajustando el volumen de muestra y anticuerpos).» El tiempo de incubación de los anticuerpos se ha comprobado que influye en la intensidad de fluorescencia y en el CV 10. La técnica de marcaje en un solo tubo recomienda incubar la muestra durante 30 min. La recomendación de grupo es incubar un mínimo de 15 min., con posibilidad de aumentar a 30 min. si la población clonal es escasa o se utiliza la técnica en un solo tubo.» Aunque está descrita una mejor separación entre poblaciones con 2 lavados 6, el grupo recomienda hacer un solo lavado de los hematíes, utilizado siempre un control de sangre normal.» Se recomienda la adquisición de hematíes utilizando FSC/SSC en escala logarítmica 4,5. Cálculo del tamaño del clon HPN El cálculo del tamaño del clon de células HPN es necesario para valorar el riesgo trombótico y hemolítico de cada paciente. Si >50% de granulocitos HPN (tipo II y III), mayor riesgo trombótico. Si >20% de hematíes HPN tipo III, la hemólisis es invariable 1,4,5. En el Registro de HPN debe incluirse el tamaño del clon HPN al diagnóstico. El grupo recomienda para el cálculo del tamaño clonal: o Para granulocitos: Puede calcularse con cualquiera de los antígenos ya descritos, en especial CD16, CD66, CD24 o CD55 (mejor que CD59). Es independiente de transfusión. o Para hematíes: - La clasificación fenotípica de la HPN en los tipos I (expresión similar a células normales), II (déficit parcial de expresión de moléculas asociadas a GPI) y III (déficit total de expresión de dichas moléculas) debe hacerse examinando los hematíes, ya que esta población celular, en pacientes NO transfundidos, permite la mejor definición de cada tipo 2,3,4,5. - En pacientes que han sido transfundidos, es aconsejable repetir el estudio cuando haya transcurrido un mínimo de un mes desde la última transfusión 1,2. - El antígeno CD59 es el que mejor permite identificar las subpoblaciones de hematíes HPN. Puede utilizarse también CD55 y CD59 en marcaje combinado 1,2,4,5.
5 Seguimiento del tamaño del clon HPN Se recomienda seguir las determinaciones secuenciales mínimas que exige el Registro 13 : - En pacientes con HPN tratados con Eculizumab: al inicio del tratamiento, a los 6 meses y posteriormente de forma anual - En pacientes con HPN clásica sin tratamiento y HPN asociada o subclínica: de forma anual. - Siempre que exista cambio en la clínica del paciente. Indicaciones de la técnica Está claramente aceptado que hay que realizar el estudio de HPN en casos de 1 : - Anemia hemolítica no inmune (especialmente si se asocia ferropenia) - Hemoglobinuria Estaría igualmente indicado en pacientes con trombosis en sitios infrecuentes, tipo Síndrome de Budd-Chiari, trombosis de venas abdominales, cerebrales o dérmicas 1. Se ha descrito la detección de pequeños clones de células HPN en pacientes con aplasia medular (AM) o síndromes mielodisplásicos (SMD) aún en ausencia de hemólisis (HPN subclínica). Con técnicas de alta resolución, se han identificado células HPN en SMD tipo AREB o 5q- o Mielofibrosis 1,14,15. Dado que la mayor concentración de casos se centra en AM y SMD con escaso número de blastos (Anemia refractaria simple), el grupo recomienda realizar un estudio de HPN en busca de pequeños clones celulares HPN (<1%) en los pacientes diagnosticados de AM y SMD tipo Anemia refractaria simple, únicos en los que se ha demostrado beneficio con tratamiento inmunosupresor. Podría sugerirse el estudio de HPN en SMD hipoplásicos y en citopenias mantenidas y no explicadas (especialmente si los reticulocitos están elevados). Sensibilidad de la técnica La capacidad de detectar clones pequeños de HPN depende del número de anticuerpos (Ac) utilizados: 2-3% de células HPN con 1 Ac ; ~1% con 2 Ac; 0,01% con 3 Ac. La máxima sensibilidad se consigue con técnicas de alta resolución (0,003% en granulocitos, 0,005% en hematíes), con marcaje múltiple (mínimo 3 anticuerpos), adquiriendo en sistemas de ventanas, mínimo eventos 15,16. Hay que tener en cuenta que se pueden detectar clones de células HPN en individuos sanos, en cantidades muy bajas (10-50 granulocitos/millón; 8 hematíes/millón) sin que ello suponga el diagnóstico de HPN 4,17. El problema de la sensibilidad se plantea por dos razones: 1.- En el registro se pueden incluir, no solo los casos de HPN clásica, sino también los de HPN asociada a otra enfermedad medular en los que el tamaño del clon es relativamente pequeño (<30%), así como los de HPN subclínica (con <1%). 2.- En enfermos con AM y SMD, pueden detectarse clones HPN en un 50-68% y 12-23% de los casos. Las diferencias en los porcentajes publicados dependen de la sensibilidad de la técnica utilizada ya que en el 40 al 80% de los casos, los clones son <1% del total celular. La importancia de identificar este grupo de pacientes radica en que se ha sugerido una mejor respuesta a tratamiento inmunosupresor, con mayor tasa de remisiones completas y supervivencia libre de enfermedad 15,16,18,19. Esto obliga a que la técnica de diagnóstico de HPN permita identificar clones menores del 1% de células 1,3. El grupo recomienda llegar a una sensibilidad del 0,1% adquiriendo eventos con marcaje múltiple. Ya que los casos de HPN clásica tienen clones celulares mayores del 50% de la celularidad, esta sensibilidad se precisaría únicamente en los casos en los que se solicite el estudio de HPN en los síndromes de fallo medular (AM y/o SMD).
6 Control de calidad En EEUU y Reino Unido existen o están en desarrollo programas de control de calidad para el diagnóstico de HNP 6. De forma similar, el grupo consideraría de gran utilidad un control de calidad externo para el diagnóstico de HPN en nuestro país. BIBLIOGRAFÍA 1.- Parker C, Omine M, Richards S, Nishimura J, Bessler M, Ware R et al. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood 2005; 106: Hernández-Campo PM, Almeida J, López A, Orfao A. Hemoglobinuria paroxística nocturna. Med Clin (Barc) 2008; 131: Parker C. Ask the Hematologist: How do I diagnose and treat PNH?The Hematologist Richards SJ, Rawstron AC, Hillmen P. Application of flow cytometry to the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cytometry 2000; 42B: Richards SJ, Barnett D. The role of flow cytometry in the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria in the clinical laboratory. Clin Lab Med 2007; 27: Richards SJ, Whitby L, Cullen MJ, Dickinson AJ, Granger V, Reilly JT et al. Development and evaluation of a stabilized whole-blood preparation as a process control material for screening of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria by flow cytometry. Cytometry 2009; 79B: Hernández-Campo PM, Almeida J, Matarranz S, de Santiago M, Sánchez ML, Orfao A. Quantitative analysis of the expression of Glycosylphosphatidylinositol- anchored proteins during the maturation of different hematopoietic cell compartments of normal bone marrow. Cytometry 2007; 72B: Sutherland DR, Kuek N, Davidson J, Barth D, Chang H, Yeo E et al. Diagnosing PNH with FLAER and multiparameter flow cytometry. Cytometry 2007; 72B: Oelschlaegel U, Besson I, Arnoulet C, Sainty D, Nowak R, Naumann R et al. A standarized flow cytometric method for screening paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) measuring CD55 and CD59 expression on erythrocytes and granulocytes. Clin Lab Haem 2001; 23: Hernández-Campo PM, Martín-Ayuso M, Almeida J, López A, Orfao A. Comparative analysis of different flow cytometry-based immunophenotypic methods for the analysis of CD59 and CD55 expression on major peripheral blood cell subsets. Cytometry 2002; 50B; Hernández-Campo PM, Almeida J, Sánchez ML, Malvezzi M, Orfao A. Normal patterns of expression of Glycosylphosphatidylinositol- anchored proteins on different subsets of peripheral blood cells: a frame of reference for the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cytometry 2006; 70B: Olteanu H, Karandikar NJ, McKenna RW, Xu Y. Differential usefulness of various markers in the flow cytometric detection of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria in blood and bone marrow. Am J Clin Path 2006; 126: Richards SJ, Hill A, Hillmen P. Recent advances in the diagnosis, monitoring and management of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cytometry 2007; 72B: Wang SA, Pozdyakova O, Jorgensen JL, Medeiros J, Stachurski D, Anderson M et al. Detection of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clones in patients with myelodysplastic syndromes and related bone marrow diseases, with emphasis on diagnostic pitfalls and caveats. Haematologica 2009; 94: Wang H, Chuhjo T, Yasue S, Omine M, Nakao S. Clinical significance of a minor population of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria- type cells in bone marrow failure syndrome. Blood 2002; 100: Sugimori C, Chuhjo T, Feng X, Yamazaki H, Takami A, Teramura M. Minor population of CD55-CD59- blood cells predicts response to immunosupressive therapy and prognosis in patients with aplastic anemia. Blood 2006; 107: Araten DJ, Nafa K, Pakdeesuwan K, Luzzatto L. Clonal populations of hematopoietic cells with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria genotype and phenotype are present in normal individuals. Proc Natl Acad Sci 1999; 96: Dunn D, Tanawattanacharioen P, Boccuni P, Nagakura S, Green SW, Kirby MR et al. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria cells in patients with bone marrow failure syndromes. Ann Intern Med 1999; 131: Nakao S, Sugimori S, Yamakazi H. Clinical significance of a small population of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria-type cells in the management of bone marrow failure. Int J Hematol 2006; 84: AGRADECIMIENTOS: El grupo agradece al Laboratorio Alexion Pharma Spain, la colaboración prestada, facilitando la realización de esta reunión. Correspondencia: Marta Morado. Servicio de Hematología. Unidad de Citometría de flujo. Edificio Laboratorios 1ª Planta. Hospital Universitario La Paz. Paseo de la Castellana, 261 Madrid Tel: Mail: mmorado.hulp@salud.madrid.org.
7 RESUMEN DE LAS CONCLUSIONES MUESTRA Sangre Periférica obtenida en EDTA. CONSERVACIÓN: Granulocitos 24h. Hematíes 15días a 4ºC LINEAS CELULARES: LEUCOCITOS: -ANTIGENOS: -MARCAJE: HEMATÍES: -ANTÍGENOS: -MARCAJE: Demostrar pérdida de 2 antígenos en dos líneas celulares Hematíes y Neutrófilos (+/- Monocitos) CD16, CD66, CD24 en Granulocitos; CD14 en Monocitos Marcaje-Lisado Para CD55 y CD59 en Leucocitos: Lisado-Marcaje Usar un Anticuerpo no asociado a GPI para separar poblaciones (CD15, CD33) CD59 (preferente) y CD55 Multiparamétrico (CD55 /CD59). Puede añadirse GlyaA Adquisición con FSC y SSC en escala logarítmica TIEMPO DE INCUBACIÓN: Mínimo 15 minutos ESTUDIO INICIAL: (Screening) En Leucocitos: CD16 en Granulocitos y CD14 en Monocitos. Si es HPN: estudiar Hematíes FENOTIPO HPN (I,II,III): Con CD59 en hematíes TAMAÑO DEL CLON: SEGUIMIENTO: INDICACIONES: SENSIBILIDAD: En Granulocitos: Tipo II + III (riesgo trombótico) En Hematíes: Tipo III (riesgo hemolítico) Tratados con Eculizumab: al inicio, 6 meses y anual No tratados, subclínica o asociada: anual Siempre que cambie la clínica Anemia hemolítica no inmune Hemoglobinuria Trombosis en localizaciones infrecuentes Aplasia Medular SMD tipo Anemia Refractaria Simple o SMD hipoplásicos Citopenias mantenidas no explicables Para los casos de HPN subclínica o asociada: 0.1% (adquirir eventos con marcaje multiparamétrico).
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