Mycoplasma pneumoniae-iga-elisa medac. Castellano 361-VPS/110305
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- Pedro Ortiz de Zárate Blanco
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1 Mycoplasma pneumoniaeigaelisa medac Castellano 361VPS/110305
2 FABRICANTE medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg DISTRIBUCION medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel./Phone: ++49 / 4103 / Fax: ++49 / 4103 / DIRECCION DE PEDIDOS: Tel./Phone: ++49 / 4103 / Fax: ++49 / 4103 / VPS/110305
3 Mycoplasma pneumoniaeigaelisa medac Enzimoinmunoensayo para la determinación cuantitativa de anticuerpos IgA frente a Mycoplasma pneumoniae en suero humano Cat.no.: 361 PARA USO EXCLUSIVO DE DIAGNOSTICO IN VITRO INTRODUCCIÓN: El micoplasma es una bacteria sin pared celular (Clase Molicutes = de pared blanda, Orden Micoplasmatales) con un genoma particularmente pequeño. Se caracterizan por ser de pequeño tamaño ( nm) y por su capacidad de adquirir una gran diversidad de formas (pleomorfismo). Hasta el momento se conocen unas 100 especies del orden Micoplasmatales. La mayoría de estas especies aparecen exclusivamente en animales. Se han aislado 14 especies en humanos. Colonizan las membranas mucosas de los tractos respiratorio y urogenital, siendo patógenos solamente unos pocos. El Mycoplasma pneumoniae se encuentra entre las especies que son patógenas para el hombre, y se conocen 2 variantes. M. pneumoniae es un parásito extracelular de la mucosa del tracto respiratorio. El patógeno se distingue por su elevado nivel de especificidad con el huésped. Una adhesina específica es la responsable de la adherencia del patógeno a la superficie de la célula huésped. Esta adhesina constituye también el factor de virulencia frente al que se dirige la crucial respuesta humoral. La transmisión de M. pneumoniae tiene lugar por microgotas, pero el periodo de incubación de 10 a 20 días es relativamente largo. La infección por M. pneumoniae es endémica, teniendo lugar picos estacionales durante la primavera y el otoño. No es inusual la aparición de epidemias en intervalos de 3 4 años. Las infecciones por M. pneumoniae se encuentran entre las causas más frecuentes de traqueobronquitis adquirida en comunidad y de neumonía atípica en niños y jóvenes. La incidencia más elevada se encuentra en las edades comprendidas entre los 5 y los 15 años. De entre todos los casos de neumonía atípica, entre el 5 10% son atribuibles a infecciones por M. pneumoniae. También son los causantes de otras afecciones como son la faringitis, laringitis, otitis media y miringitis. 361VPS/
4 Tras la infección por M. pneumoniae, la cual comienza con una infección del tracto respiratorio, pueden ocurrir varias otras manifestaciones clínicas en otros órganos y sistemas: estas incluyen pericarditis y miocarditis, artritis reactiva, meningitis, meningoencefalitis, y polineuritis junto con una amplia variedad de afecciones de la piel. Aunque al principio parezca una infección de carácter leve puede conducir a serias consecuencias finales. La enfermedad puede cursar de forma particularmente severa en pacientes inmunodeficientes e inmunosuprimidos. En niños menores de 5 años la enfermedad cursa predominantemente de forma asintomática. En algunos casos la enfermedad se desarrolla con gravedad media. En niños mayores, en jóvenes y en adultos, sin embargo la infección está acompañada de postracción, dolor de cabeza, fiebre y sed, y tos seca. Ya que estas características clínicas son completamente inespecíficas no proporcionan ninguna evidencia sobre la causa de la infección. Se considera por lo tanto necesario un ensayo diagnóstico eficaz. En la fase aguda de la enfermedad el método de elección es la demostración del patógeno causante. Los ensayos para la detección del patógeno pueden realizarse en muestras de garganta recogidas con torundas, en muestras de esputo y en muestras de lavado broncoalveolar. La técnica clásica para demostrar la presencia de M. pneumoniae por cultivo celular requiere un largo periodo de tiempo (10 14 días). Además el aislamiento del microorganismo tiene lugar con éxito únicamente en el 40 60% de los casos. El ensayo por ELISA para detección del antígeno requiere un material rico en células, ya que la sensibilidad del ensayo es relativamente baja. Hasta el momento no existe ningún ensayo disponible comercialmente que sea eficaz para la determinación cualitativa de DNA. La serología constituye el método de elección para los pacientes con infecciones crónicas, reinfecciones o enfermedades extrapulmonares ocasionadas por M. pneumoniae. Los sistemas de análisis comerciales incluyen los ensayos por fijación de complemento(cft), los ensayos de hemaglutinación (HAT) y los enzimoinmunoensayos (ELISA). A diferencia de los ensayos por CFT y por HAT, las técnicas de ELISA hacen posible la diferenciación entre las clases IgG, IgA e IgM de inmunoglobulina, lo que permite que las infecciones agudas puedan ser distinguidas de las infecciones crónicas y de las infecciones pasadas. El ensayo Mycoplasma pneumoniaeigaelisa medac utiliza una mezcla de antígenos recombinante para los ensayos serológicos. Esto asegura que los resultados tendrán una alta especificidad y sensibilidad. Además la cuantificación en un punto de medac (AU/ml) ofrece las mejores condiciones posibles para obtener resultados reproducibles y como consecuencia, para la cuantificación de cambios importantes en el título VPS/110305
5 Además de Mycoplasma pneumoniaeigaelisa medac Cat.no.: 361 para 96 determinaciones También se distribuyen los siguientes productos: Mycoplasma pneumoniaeiggelisa medac Cat.no.: 360 para 96 determinaciones Mycoplasma pneumoniaeigmelisa medac Cat.no.: 362 para 96 determinaciones, 361VPS/
6 PRINCIPIO DEL ENSAYO La placa está recubierta con un antígeno recombinante específico de M. pneumoniae Los anticuerpos específicos frente a Mycoplasma presentes en las muestras, se unen selectivamente al antígeno. Anticuerpos anti IgA humana conjugados con peroxidasa se unen a los anticuerpos IgA (P = peroxidasa). Incubación con el substrato TMB(*). La reacción, se para por la adición de ácido sulfúrico. La absorbancia se lee fotométricamente. Ventajas del ensayo Las tiras de la microplaca contienen pocillos separables, permitiendo un uso eficiente del test. Apropriado para la automatización en procesadores abiertos de ELISA. Cuantificación en un único punto, no se requiere curva estándar VPS/110305
7 COMPONENTES DEL KIT Cat. nº : MTP Microplaca: 12 x 8 pocillos, codificación en amarillo (con el soporte y el desecante, sellado al vacío en bolsa de aluminio), divisibles, formau, recubiertos con antígeno recombinante específico de M. pneumoniae y FCS, listo para usar. 2. CONTROL Control negativo: 2 viales, cada uno con 0,75 ml de suero humano listos para usar, teñidos en azul, conteniendo NBCS, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina 3. CONTROL + Control positivo: 2 viales, cada uno con 0,75 ml de suero humano listo para usar, teñidos en azul, conteniendo BSA, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 4. CAL Calibrador: 2 viales, cada uno con 0,75 ml de suero humano, listo para usar, teñidos en azul, conteniendo BSA, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 5. WB Solución de lavado: 1 botella con 100 ml de PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, conteniendo ProClin TM BACDIL Diluyente de la muestra: 1 botella con 110 ml de PBS/Tween/NBCS, ph 7,0 7,2, listo para usar, teñido en azul, conteniendo ProClin TM CON Conjugado: 3 viales, cada uno con 5,0 ml de inmunoglobulina de cabra anti IgA humana conjugado con peroxidasahrp, listo para usar, teñidos en amarillo, conteniendo BSA, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 8. TMB SubstratoTMB: 1 vial con 10 ml, listo para usar. 9. STOP Solución de parada: 2 viales, cada uno con 14 ml de ácido sulfúrico 0,5 M (H 2 SO 4 ), listo para usar. 361VPS/
8 1. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD MATERIAL/REACTIVO ESTADO ALMACENAMIENTO ESTABILIDAD Kit sin abrir 2 8 C fecha de caducidad Microplaca abierto 2 8 C en bolsa con 12 semanas desecante Controles/calibrador abierto 2 8 C 12 semanas Solución de lavado diluida 2 8 C 12 semanas Diluyente de la muestra abierto 2 8 C 12 semanas Conjugado abierto 2 8 C 12 semanas SubstratoTMB abierto 2 8 C 12 semanas Solución de parada abierto 2 8 C fecha de caducidad No utilizar estos reactivos después de la fecha de caducidad. 2. REACTIVOS Y MATERIALES REQUERIDOS QUE NO SE PROPORCIONAN 2.1. Agua bidestilada. La utilización de agua desionizada puede alterar el procedimiento de la técnica Micropipetas ajustables Contenedores de cristal o de plástico limpios para la dilución de la solución de lavado y de las muestras Sistemas apropiados para el lavado de la microplaca (e.j. pipeta multicanal o lavador de ELISA) Incubador de 37 C 2.6. Lector de microplaca con filtros para 450 nm y nm. 3. PREPARACION DE LOS REACTIVOS Antes de comenzar con el procedimiento de la técnica, todos los componentes del kit deben alcanzar la temperatura ambiente. Calcular el número de pocillos que se necesiten Microplaca La bolsa de aluminio debe cerrarse herméticamente junto con el desecante cada vez que se separen pocillos. El almacenamiento y la estabilidad de los pocillos se indican en punto VPS/110305
9 3.2 Solución de lavado Mezclar un volumen de solución de lavado (10 x) con 9 volúmenes de agua bidestilada (p. ej., 50 ml de solución de lavado (10 x) con 450 ml de agua). Para 8 pocillos, se requieren 10 ml de solución de lavado diluida. Si se observan cristales en la solución de lavado (10 x), deberán de disolverse por calentamiento (max. a 37 C), y /o agitación a temperatura ambiente. No mezclar los reactivos específicos del kit (microplaca, controles, calibrador, conjugado) procedentes de diferentes lotes del kit. Por el contrario, el diluyente de la muestra, el tampón de lavado, el substrato TMB y la solución de parada son generalmente intercambiables en todos los kits de ELISA de Chlamydia y Mycoplasma de medac. En general, no deben utilizarse reactivos procedentes de otros fabricantes. Solamente se obtienen resultados válidos y reproducibles si se procede tal y como se ha descrito. 4. MUESTRAS 4.1. El ensayo es apropiado para muestras de suero No se necesita pretratamiento del suero, como p. ej. inactivación. Sin embargo, no debería estar contaminado con microorganismos ni contener glóbulos rojos Los sueros deben diluirse 1:100 con el diluyente de la muestra. 5.A. PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA: 5.1. Cortar la bolsa de aluminio por la parte superior del cierre en cremallera y extraer el número de pocillos de la microplaca que se requieran (ver 3.1.). Los pocillos de la microplaca están listos para usar y no necesitan prelavado Pipetear 50 µl del diluyente de la muestra en el pocillo A1 como blanco (ver 6.A.). Añadir 50 µl de cada una de las muestras diluidas así como del control negativo, del control positivo y del calibrador, por duplicado, en sus pocillos correspondientes. 361VPS/
10 Si es necesario, los pocillos de la microplaca pueden almacenarse en una cámara húmeda a temperatura ambiente hasta 30 minutos, antes del inicio de la técnica Incubar los pocillos de la microplaca durante 60 min (± 5 min) a 37 C (± 1 C) en una cámara húmeda o alternativamente cubrir la placa con un adhesivo Transcurrido el tiempo de incubación, lavar tres veces cada uno de los pocillos de la microplaca con 200 µl de solución de lavado por pocillo. Verificar que todos los pocillos estén rellenos. Después del ciclo de lavado, sacudir la microplaca en papel secante. No dejar secar los pocillos. Proceder inmediatamente! 5.5. Añadir el conjugado (teñido en amarillo) a cada pocillo. Si el ensayo se realiza manualmente, pipetear 50 µl del conjugado a cada pocillo. Tener en cuenta: Cuando se trabaja con aparatos automatizados, se deben pipetear 60 µl de conjugado a cada pocillo debido a la alta evaporación que se produce en las cámaras de incubación de estos procesadores. Se ha confirmado la disponibilidad del ensayo con aparatos automatizados durante la evaluación del ensayo. Sin embargo, se recomienda verificar la compatibilidad del ensayo con el instrumento utilizado en el laboratorio Incubar nuevamente durante 60 min (± 5 min.) a 37 C (± 1 C) en una cámara húmeda o alternativamente cubrir la placa con un adhesivo Transcurrido el tiempo de incubación, lavar nuevamente los pocillos de la microplaca (ver 5.4.) Añadir 50 µl de substratotmb a cada pocillo e incubar en oscuridad durante 30 min (± 2 min) a 37 C (± 1 C) en una cámara húmeda o cubierta con un adhesivo. Las muestra positivas viran a azul La reacción se para añadiendo 100 µl de solución de parada a cada pocillo. Las muestras positivas viran a amarillo VPS/110305
11 Limpiar los pocillos de la microplaca por debajo antes de la lectura fotométrica y asegurarse de que no haya burbujas en el interior de los pocillos. La lectura debe realizarse en los 15 minutos siguientes a la adición de la solución de parada! 5.B. TABLA PARA EL PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA Diluyente de la muestra Control negativo Control positivo Calibrador Muestra Blanco (A1) 50 µl Control negativo 50 µl Control positivo 50 µl Calibrador 50 µl Muestra 50 µl Incubar durante 60 min a 37 C, lavar 3 x con 200 µl solución de lavado. Conjugado 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) Incubar durante 60 min a 37 C, lavar 3 x con 200 µl solución de lavado. SubstratoTMB 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Incubar durante 30 min a 37 o C en oscuridad. Solución de parada 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leer fotométricamente a 450 nm (ref nm) *) Procedimiento manual/automático (ver 5.5) 6.A. CALCULO DE LOS RESULTADOS (VALIDACION) La evaluación se lleva a cabo utilizando unidades arbitrarias (AU). Leer los valores de la D.O. a 450 nm (longitud de onda de referencia nm). Restar el valor de la D.O. del blanco (pocillo A1) de todos los demás valores de la D.O. 361VPS/
12 Datos específicos para cada lote El esquema específico para cada lote que se proporciona con el kit contiene la siguiente información: Curva de calibración específica de cada lote Curva de los parámetros a y b Valor nominal de la DO del calibrador Límite inferior de la DO del calibrador Rango nominal de las concentraciones del control positivo (AU/ml). Criterio de validación El valor de la D.O. del blanco, debe de ser < 0,100. El valor de la D.O. del control negativo tiene que ser < 0,100. El valor unitario del control positivo tiene que encontrarse dentro de los valores del rango nominal que se indica en el esquema específico para cada lote. La media del valor de la D.O. del calibrador tiene que ser superior al limite inferior de la DO indicada en el esquema específico para cada lote. Repetir el ensayo si los resultados no cumplen con las especificaciones! Corrección de los resultados Los valores de las medidas de la D.O. del control positivo y de las muestras deben corregirse como se indica a continuación: DO corregida = Valor nominal de la DO del calibrador Valor de la medida de la DO del calibrador x medida de la DO Cuantificación de los resultados Las concentraciones correspondientes a los valores de las DO corregidas en AU/ml pueden extrapolarse de la curva de calibración específica de cada lote (ver esquema específico para cada lote). De forma alternativa, las concentraciones pueden calcularse utilizando la siguiente fórmula: a Concentración [AU/ml] = b/ 1 ODcorregida VPS/110305
13 La mayoría de los lectores de ELISA actuales permiten programar esta fórmula, estando capacitados por lo tanto a realizar automáticamente el procesamiento de los datos. El rango de las medidas fluctúa entre 9 y 125 AU/ml. Las muestras inferiores a este rango deben interpretare como < 9 AU/ml, y las superiores como > 125 AU/ml. Estos valores no deberían extrapolarse. El cutoff se sitúa en 10 AU/ml La zona dudosa = 9 11 AU/ml 6.B.INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS/LIMITACIONES DEL METODO Las muestras con valores de la D.O. por debajo del límite inferior de la zona dudosa, se informan como NEGATIVAS. Las muestras con valores de la D.O. dentro de la zona dudosa, se informan como DUDOSAS. Estas muestras deberían ensayarse nuevamente junto con otra muestra reciente tomada 14 días después, con el objeto de determinar un cambio en el título. Las muestras con valores de la D.O. por encima del límite superior de la zona dudosa, se informan como POSITIVAS. Los resultados deberían interpretarse en relación con los datos clínicos y con el resto de parámetros del diagnóstico. Las concentraciones elevadas de hemoglobina en el suero, no influyen sobre los resultados. Sin embargo, las concentraciones de lípidos elevadas pueden influir en los resultados del ensayo. No pueden excluirse en casos aislados las reacciones cruzadas con anticuerpos heterófilos. 361VPS/
14 6.C. INTERPRETACION ESPECIFICA DE IgM/IgA/IgG Posibles Resultados IgM IgA IgG Interpretación + 1. Indicativo de un estadio de infección temprano o únicamente, persistencia de IgM. Retestar IgM, IgA e IgG transcurridos 14 días. 1, Indicativo de un estadio de infección temprano o únicamente, persistencia de IgA. Retestar IgA e IgG transcurridos 14 días Indicativo de infección aguda. 1,2 Retestar la IgG transcurridos 14 días Indicativo de infección aguda Indicativo de infección aguda Indicativo de infección actual primaria o reinfección Indicativo de infección pasada. En caso de sospecha clínica retestar para anticuerpos IgA e IgG transcurridos 14 días. 8. Sin indicación serológica de infección actual o infección pasada. En caso de sospecha clínica retestar transcurridos 14 días para los anticuerpos IgM, IgA e IgG. Nota: Resultados en la linea divisoria pueden ser indicativos de una infección emergente o en declive. Se recomienda retestar una segunda muestra transcurridos 14 días. 1 Las infecciones actuales, agudas son las mejor detectadas por determinación en paralelo de los anticuerpos IgM e IgA. 2 La detección simultanea de anticuerpos IgM e IgA es particularmente frecuente en niños. 3 En adultos, los anticuerpos IgA constituyen un marcador más fiable para las infecciones actuales que los anticuerpos IgM VPS/110305
15 7. CARACTERISTICAS DEL ENSAYO Durante la evaluación en el diagnóstico, se determinaron las siguientes características del ensayo. 7.A. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD Grupo de pacientes Especificidad IgA Sueros negativos para IgA frente a M. pneumoniae (Referencia ELISA/Ensayo aglutinación) 98% (n=40) Grupo de pacientes Sensibilidad IgA Sueros con anticuerpos IgA frente a M. pneumoniae (referencia ELISA/Ensayo aglutinación) Pacientes con infecciones respiratorias 57% (n=35) 7.B. PRECISION Muestra Variación Intraensayo Muestra Variación Interensayo Media DS CV n Media DS CV n AU (%) AU (%) PC 12,3 0, PC 13 0, N 1 20,6 0, N 4 21,7 1, N 2 21,7 0, N 5 20,8 1, N , N 6 114,7 11, PC = control positivo 361VPS/
16 ADVERTENCIAS GENERALES SOBRE LA MANIPULACION Para evitar contaminaciones entre muestras, no intercambiar los viales y los tapones de muestras diferentes. Los reactivos deben cerrarse herméticamente, inmediatamente después de utilizarse para evitar la evaporación y contaminaciones microbianas. Tras su utilización, los reactivos deben almacenarse como se ha indicado para garantizar su vida media. Tras su utilización, los reactivos deben almacenarse en su envase original para evitar mezclar los reactivos de otros tipo de ensayos o de otros lotes (ver también punto 3). INFORMACION SOBRE SEGURIDAD E HIGIENE Debe cumplirse la normativa sobre seguridad e higiene en el trabajo de cada país. Los reactivos de origen humano han sido testados y se ha encontrado que son negativos para Ag HBs, para anticuerpos frente a VIH1/2 y para VHC. A pesar de ello, está altamente recomendado que estos materiales así como aquellos de origen animal, se manipulen como potencialmente infecciosos y se tomen todas las precauciones necesarias. CONSIDERACIONES SOBRE ELIMINACION DE LOS RESIDUOS Los residuos químicos y de las preparaciones se consideran en general como material peligroso. La eliminación de estos residuos está regulada a través de las leyes nacionales y regionales y de sus normativas. Contactar con las autoridades locales o con las compañías de gestión homologadas, que aconsejarán del modo en el que se deben eliminar los residuos peligrosos. Fecha de revisión: VPS/110305
17 LITERATUR/REFERENCES/LITTERATURE Clyde, WA: Clinical overview of typical Mycoplasma pneumoniae infections. Clin Infect Dis 17 (Suppl 1), S326 (1993). Dionisio D, Valassina M, Uberti M, Fabbri C, Parri F, Saffi EG: Mycoplasma pneumoniae nonpulmonary infection presenting with pharyngitis, polyarthritis and localized exanthem. Scand J Infect Dis 33, (2001). Döller G, Döller PC, Jacobs E, Schuy W: Zur Differentialdiagnostik von Infektionen des Respirationstrakts. Diagnose & Labor 43, 2133 (1993). Drasbek M, Nielsen PK, Persson K, Birkelund S, Christiansen G: Immune response to Mycoplasma pneumoniae P1 and P116 in patients with atypical pneumonia analyzed by ELISA. BMC Microbiol. 4, 7ff. (2004). Ferwerda A, Moll HA, de Groot R: Respiratory tract infections by Mycoplasma pneumoniae in children: a review of diagnostic and therapeutic measures. Eur J Pediatr 160, (2001). Granstrom M, Holme T, Sjogren AM, Ortqvist A, Kalin M: The role of IgA determination by ELISA in the early serodiagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection, in relation to IgG and mucapture IgM methods. Med Microbiol. 40, (1994). Hammerschlag MR: Mycoplasma pneumoniae infections. Curr Opin Infect Dis 14, (2001). Jacobs E: Das Adhäsin von Mycoplasma pneumoniae: Seine Bedeutung als Virulenzfaktor in der Pathogenese und in der Diagnostik. Klin Lab 40, (1994). Kleemola M, Käyhty H: Increase in titers of antibodies to Mycoplasma pneumoniae in patients with purulent meningitis. J Infect Dis 146, (1982). Krause D: Mycoplasma pneumoniae cytadherence: organization and assembly of the attachment organelle. Trends Microbiol 6, 1518 (1998). Seggev JS, Semak GV, Kurup VP: Isotypespecific antibody responses to acute Mycoplasma pneumoniae infection. Ann Allergy Asthma Immunol. 77, 6673 (1996). Sillis M: The limitations of IgM assays in the serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections. Med Microbiol. 33, 2538 (1990). Sotgiu S, Pugliatti M, Rosati G, Deiana GA, Sechi GP: Neurological disorders associated with Mycoplasma pneumoniae infection. Eur J Neurol 10, (2003). 361VPS/
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