Práctica # 8 Pruebas generales para Lípidos

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1 Práctica # 8 Pruebas generales para Lípidos 1. INTRODUCCIÓN Los lípidos existentes en los organismos vivos, varían en su solubilidad, propiedad que es usada para su extracción y purificación a partir de materiales biológicos. En general, los lípidos son insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos no polares tales como Éter, Alcohol, Cloroformo, Hexano. La extracción de los lípidos del tejido o material biológico en consideración se constituye como la primera etapa para el estudio de los mismos, sin embargo, este proceso se ve afectado por las siguientes causas: Algunas veces los lípidos están unidos a proteínas y polisacáridos de los tejidos, formando complejos; para romper estos complejos se emplean en general condiciones que desnaturalicen las proteínas o rompan dicha asociación. En adición, la extracción de lípidos con solventes orgánicos, acarrea material no lipídico por interacciones iónicas, en general. Es importante considerar que los ácidos grasos insaturados sufren una auto oxidación rápida, por lo cual se recomienda su extracción en atmósfera de nitrógeno y el uso de solventes libres de peróxidos. La extracción de lípidos a partir de tejidos húmedos produce emulsiones de manera que es conveniente deshidratar previamente. Por demás, existe el riesgo de que se liberen enzimas hidrolíticas que pueden causar degradación. No existe un método general que supere estas dificultades. Sin embargo, la acetona es un solvente útil ya que proporciona un método rápido y relativamente suave de deshidratación del tejido al mismo tiempo que extrae grasas, esteroles y lípidos simples. Los lípidos complejos son relativamente insolubles en acetona por lo que se requieren de extracciones adicionales con otros solventes tales como Éter y el Hexano que permiten la extracción de glicerofosfátidos y de Alcoholes que permiten extraer esfingolípidos. 2. OBJETIVOS Determinar la solubilidad de diferentes tipos de lípidos frente a varios solventes de distinta polaridad Comprobar la solubilidad de varios productos grasos comerciales 2.3. Observar la formación de emulsiones. 3. CONSULTAS PRELIMINARES 3.1. Cuales son las características estructurales de los fosfolípidos? 3.2. Cuales son las funciones principales para las denominas ceras? Indique al menos 3 ejemplos para ello. 3.3 Consultar las frases R y S de los reactivos a manipular en la práctica 3.4 Consultar las fichas de seguridad de los reactivos a manipular en la práctica.

2 4. MATERIALES y REACTIVOS MATERIALES (Cantidad) Pipeta graduada de 5 ml (2) Pipeta graduada de 1 ml (1) Pipeta graduada de 10 ml (1) Pipeta volumétrica de 25 ml (1) Vaso de precipitados de 250 ml (2) Vaso de precipitados de 100 ml (1) Erlenmeyer de 200 ml (1) Erlenmeyer de 500 ml (2) Bureta de 50 ml (1) Varilla de vidrio (1) Plancha de calentamiento (1) Tubos de ensayo (20) Gradilla (1) Pinza (3) Pinza de madera (1) Goteros (2) Termómetro (1) Vidrio reloj (1) Espátula (1) Propipeta (2) REACTIVOS Cantidad Glicerol C 3 H 8 O ml Acetona C 3 H 6 O (R11, S ) 100 ml Alcohol Etílico C 2 H 6 O (R11, S7-16) 100 ml Éter Dietílico C 4 H 10 O (R12-16, S ) 100 ml HCl 5N (R34-37, S26-36/37/39-45) 100 ml Fenolftaleína 0.5 % 5 ml C 20 H 14 O 4 (R11-23/25, S ) 5 ml Solución alcohólica de KOH 1N; (R11-36/38, S ) 100 ml Almidón soluble al 1% (C 6 H 10 O 5 ) n 10 ml Cloroformo CHCl 3 (R /20/22, S36/37) 20 ml KOH 0.05N (R11-36/38, S ) 100 ml Etanol Neutro C 2 H 6 O (R11, S7-16) 400 ml Agua de Bromo (R26-35, S7/ ) 10 ml Solución diluida de Yodo en Cloroformo (R20/21, S ) 5 ml Aceite de Oliva, Manteca vegetal, Cebo de res, Manteca de coco, Aceites vegetales. 30 ml o 10g Ácido Butírico C 4 H 8 O 2 (R34, S ) 5 g Ácido Palmítico C 16 H 32 O 2 5 g Ácido Oleico C 18 H 34 O 2 20 ml Lecitina comercial 20 ml Colesterol C 27 H 46 O 3.5 g Agua Destilada 1 Galón *Remitir al manual de protocolo de riesgo/ seguridad y fichas técnicas de seguridad. 5. EQUIPOS EQUIPOS CANTIDAD Condensador para balón de 100 ml 1 Balón de 100 ml 1 Pinza para bureta 1 Bureta de 25 ml 1 Plancha de calentamiento 1 Baño maría con termostato a 60ºC 1 Balón fondo plano 250 ml #24/40 1 Condensador bolas o recto #24/40 1 Pinzas para balón 2 Mangueras 2 Nota: Uno de los grupos debe realizar el blanco para la saponificación.

3 6. METODOLOGÍA 6.1. Pruebas de solubilidad de lípidos. Para examinar la solubilidad de los productos mencionados (Aceite vegetal, grasa, colesterol, lecitina, ácido oleico y ácido palmítico), utilizar 2 ml para las muestras líquidas, y 0,5 g para las sólidas. Rotular los tubos y realizar las pruebas de solubilidad con cada uno de los siguientes solventes: Éter etílico, Acetona y Glicerol. Emplear 2 ml de cada uno de los solventes por muestra. Describir los resultados. Poner 3 ml de agua en dos tubos de ensayo. Agregar tres gotas de aceite vegetal en cada uno de los tubos y observar la solubilidad. Adicionar dos gotas de lecitina (o 4 gránulos) a uno de ellos, mezclar fuertemente y comparar la solubilidad de las emulsiones formadas. Qué efecto tiene la lecitina y por qué? 6.2. Hidrólisis de un aceite vegetal: saponificación Pesar exactamente 1 g de grasa en un balón de 100 ml. Añadir 10 ml de solución alcohólica de KOH. Poner a reflujo en un baño de agua a ebullición lenta y agitar cada 30 o 60 segundos (No debe haber presencia de gotas de grasa). El final de la saponificación, se obtiene cuando no se observa turbidez en la solución. Enfriar y titular el exceso de KOH con HCl 5 N en presencia de Fenolftaleína (si la coloración final es muy intensa, valorar en frio con ayuda de un potenciómetro hasta ph = 8.20). Simultáneamente se efectúa un blanco con 10 ml de KOH alcohólico sin la adición de la grasa, operando en iguales condiciones. Durante este procedimiento es necesario evitar el contacto de la solución con el aire ya que la solución alcalina absorbe CO 2. Esta es la razón por la cual debe hacerse un blanco Índice de acidez de un aceite Medir 5 ml de aceite vegetal y pesar 5 g de grasa en 2 erlenmeyer de 250 ml, agregar a cada uno 20 ml de etanol neutro. Calentar la soluciones en un baño de agua a 60 C. Cuando las soluciones se encuentren a la temperatura del baño, titularlas manteniendo el erlenmeyer en el baño a 60 C de la siguiente manera: Adicionar 3 gotas de fenolftaleína al 0.5% y titular rápidamente las mezclas calentadas con solución de KOH 0.05N hasta un color rosa permanente durante al menos 15 segundos. Repetir el mismo procedimiento con la segunda muestra y finalmente con 15mL de agua en lugar de aceite. Sustraer el valor obtenido en ésta última titulación (agua) de los valores alcanzados utilizando aceite y grasa Pruebas de insaturación de grasas Tomar dos gotas de cada una de las siguientes muestras (Aceite vegetal, Ácido Oléico, y 0,2 g de colesterol) y depositarlas en tubos de ensayo. Agregar 1 ml de cloroformo a cada uno y mezclar. Posteriormente, adicionar 3 gotas de solución yodada y mezclar. Anotar los cambios y el tiempo de aparición de los mismos. Observar a los a los 12 minutos las muestras y anotar los colores de

4 cada uno de los tubos al final de este tiempo. Repetir los anteriores pasos, empleando 4 gotas de agua de Bromo en lugar de solución yodada. Agregue a la muestra el agua de Bromo gota a gota. Agitar después de cada adición que el Bromo se decolore completamente. 7. DATOS Y RESULTADOS - Pruebas de solubilidad: Elaborar una tabla en la cual se describa la solubilidad relativa de los diferentes lípidos frente a los solventes utilizados. Marque así: Insoluble (-), Poco soluble (+), Soluble (++) y muy soluble (+++). - Hidrólisis de un aceite vegetal: Saponificación: El exceso de KOH es el que se valora con el HCl. KOH + HCl KCl + H 2 O El número de equivalentes de KOH consumidos en la reacción de saponificación se obtiene restando el número total de equivalentes de KOH agregados inicialmente, menos el número de equivalentes de KOH que no se consumieron (los valorados con HCl). Equivalentes de KOH valorado (exceso) = (Vb Vn) x N (HCl). Equiv.KOH consumidos x 56 Donde: Vb = ml de KOH gastados en el blanco. Vm = ml de KOH gastados en la muestra. N (HCl) = Normalidad del HCl. PM = Peso en gramos de la muestra. IS = Índice de saponificación. Calcule el IS de la muestra de grasa empleada. Índice de acidez de un aceite: El índice de acidez (IA) puede calcularse así: IA = V x 5.61 / G Donde: V = ml de hidróxido de potasio 0.1N empleados. G = gramos de grasa utilizados. 5.61= g/litro de KOH (0.1N = 5.61g/L). mg de KOH/g grasa Pruebas de instauración de grasas: Elaborar una tabla en la cual se muestre la capacidad de los diferentes glicéridos ensayados para decolorar tanto el bromo como el yodo. Formular las conclusiones pertinentes con respecto a la instauración relativa de las muestras.

5 8. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 8.1. Escribir las reacciones de hidrólisis de triglicéridos en medio: a) ácido, b) alcalino, c) enzimático. Anote las características de cada tipo de hidrólisis. Ventajas y desventajas En qué consiste el proceso de saponificación?, Cuáles son los productos de este proceso?, En qué forma dichos productos son transformados en ácidos grasos? 8.3. Qué factores influencian el índice de saponificación de una grasa? 8.4. Qué alteraciones produce el enranciamiento en un alimento? 8.5. Cuál es el mecanismo químico de enranciamiento o formación de peróxido con ácidos grasos? 8.6. Cómo varía la acidez de una grasa respecto a la edad de la misma?, Con los resultados obtenidos en el experimento de acidez, podría decirse si el aceite era viejo o fresco? 8.7. Comente sobre los posibles errores que pueden cometerse en estos experimentos y cómo evitarlos. 9. RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS QUÍMICOS 9.1 RECUPERACIÓN No aplica 9.2 DESACTIVACIÓN No aplica 9.3 ALMACENAMIENTO TEMPORAL Los residuos generados en el procedimiento 7.1 se deben depositarse en el recipiente para solventes orgánicos; los de las pruebas 7.2 y 7.3 en el recipiente para ácidos y bases y los residuos de la parte 7.4 deben depositarse en el recipiente de hidrocarburos halogenados. 10. BIBLIOGRAFÍA LOZANO, J. A and TUDELA, J.; Practicas de Bioquímica: Experimentación y simulación 1ed Ed Síntesis, Madrid, ISBN: PLUMMER, D. T. "Bioquímica Practica" 2da. Ed. Mc Graw-Hill Latinoamericana, Bogotá, ISBN:

6 1. INTRODUCCIÓN Práctica # 9 DETERMINACIÓN DE COLESTEROL La medición del contenido de colesterol sanguíneo es una prueba muy útil en la bioquímica clínica. El contenido normal de colesterol en el hombre varía entre 100 a 250 mg/100 ml. El valor medio para varones adultos es de 200 mg/200 ml, sin embargo, este valor aumenta entre los 40 y 50 años. Un valor de colesterol sanguíneo por encima de 300 mg/100 ml en jóvenes es indicio de una seria enfermedad coronaria. En esta práctica se usará el método de Liebernan-Burchard según el cual una solución clorofórmica de Colesterol se trata con Anhídrido Acético, produciéndose un color azul verdoso cuya intensidad depende de la concentración de colesterol. El colesterol se extrae del suero mediante una mezcla de Alcohol-Acetona que a su vez precipita la proteína, el solvente orgánico se remueve por evaporación en un baño de agua hirviendo y el residuo seco se disuelve en cloroformo. 2. Objetivo 2.1. Determinar la concentración del colesterol sanguíneo en muestras de sangre de los estudiantes Comparar con los valores obtenidos con los normales reportados. 3. CONSULTAS PRELIMINARES 3.1. Cuales son las funciones del colesterol en nuestro organismo? 3.2. A que se le denomina colesterol bueno y malo? 3.3. Consultar las frases R y S de los reactivos a manipular en la práctica 3.4. Consultar las fichas de seguridad de los reactivos a manipular en la práctica 3.5. En qué consiste la reacción de Lieberman Burchard? 3.6. Qué otros métodos se utilizan para determinar colesterol sanguíneo, explique en detalle? Que metabolitos de colesterol podría determinar en sangre? 3.8. Indique las reacciones químicas que ocurren en la práctica.

7 4. MATERIALES MATERIAL CANTIDAD Pipeta graduada de 1 ml 1 Pipeta graduada de 10 ml 1 Propipeta 1 Tubos de ensayo 20 Tubo para centrifuga 2 Gradilla 1 Jeringa plástica de 5 ml* 1 *La jeringa la debe traer cada grupo (el estudiante donante deberá estar en ayunas). 5. REACTIVOS* SUSTANCIA Cloroformo seco CHCl 3 (R /20/22, S36/37) Mezcla anhídrido acético/ácido sulfúrico (30:1) Mezclar suavemente antes de usar. C 4 H 6 O 3 (R10-34, S26-45) H 2 SO 4 (R35, S ) Soluciónes de colesterol patrón en cloroformo 0.25 ppm, 0.5 ppm, 0.75 ppm, 1.0 ppm, 1.25 ppm y 1.50 ppm C 27 H 46 O (a partir de solución madre de colesterol de 100 ppm) Alcohol Etílico anhidro C 2 H 6 O (R11, S7-16) Acetona anhidro C 4 H 10 O (R12-16, S ) Muestra de Sangre CANTIDAD 40 ml 10 ml 40 ml 40 ml 1 ml *Remitir al manual de protocolo de riesgo/ seguridad y fichas técnicas de seguridad. 6. EQUIPOS Espectrofotómetro UV-Vis Baño maría con termostatado Centrifuga 3000 r.p.m Vortex

8 7. METODOLOGÍA 7.1. Poner 5 ml del solvente alcohol-acetona (1:1) en un tubo de centrífuga seco (tenerlo listo con anterioridad para evitar la coagulación de la muestra de sangre) y una vez tomada la muestra de sangre agregar cuidadosamente 0.5 ml de esta en el tubo Sumergir el tubo en un baño de agua hirviendo hasta que el solvente comience a hervir Retirar el tubo y agitar fuertemente por 3 minutos Dejar en reposo, enfríar y luego centrifugar a 3500 r.p.m durante 3 minutos Verter el sobrenadante en un tubo de ensayo seco. Evaporar el líquido a sequedad en un baño maría Enfriar y resuspender el residuo con 1 ml de cloroformo Al mismo tiempo, alistar una serie de tubos que contengan 1 ml de los patrones de colesterol y un blanco con 1 ml de cloroformo. (patrones de 0.05 ppm, ppm, 0.1 ppm, 0.15 ppm, 0.2 ppm y 0,25 ppm) Añadir a cada tubo (los de 7.6 y 7.7) 1 ml de la mezcla anhídrido acéticoácido sulfúrico y mezclar fuertemente Dejar los tubos en oscuridad por 10 minutos a temperatura ambiente. Leer los valores de absorbancia a 625 nm. 8. DATOS Y RESULTADOS MUESTRA Muestra Problema Patrón de colesterol 1 Patrón de colesterol 2 Patrón de colesterol 3 Patrón de colesterol 4 Patrón de colesterol 5 Patrón de colesterol 6 VALOR DE ABSORBANCIA 9. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 9.1. Elabore la gráfica de la absorción vs concentración de los patrones y determine la cantidad de colesterol en la muestra Calcules el % de colesterol sanguíneo y compárelo con los valores considerados normales.

9 10. RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS QUÍMICOS 10.1 RECUPERACIÓN No aplica 10.2 DESACTIVACIÓN Quitar los émbolos de las jeringas con las que se toman las muestras de sangre y dejar todo el conjunto (émbolo + tubo de la jeringa) en solución de hipoclorito concentrada durante al menos 1 hora 10.3 ALMACENAMIENTO TEMPORAL Todos los residuos serán depositados en el recipiente para hidrocarburos halogenados, las jeringas se depositarán en el recipiente empleado para desecho de materiales biológicos de biología. 11. BIBLIOGRAFÍA LOZANO, J. A and TUDELA, J.; Practicas de Bioquímica: Experimentación y simulación 1ed Ed Síntesis, Madrid, ISBN: PLUMMER, D. T. "Bioquímica Practica" 2da. Ed. Mc Graw-Hill Latinoamericana, Bogotá, ISBN:

10 Práctica # 10 RECONOCIMIENTO DE VITAMINAS 1. INTRODUCCIÓN La vitamina E participa en las reacciones de oxidaciones reducción en el tejido de músculos, es un antioxidante de los ácidos grasos no saturados evitando, de esta manera, la aparición de unos productos tóxicos de su oxidación que causan la muerte de los embriones, participa en la estabilización de las membranas de lisosomas. La vitamina E se aplica como preparado medicinal para curar la distrofia de músculos, esclerosis coronaria, esterilidad. Indicios del la ausencia o déficit de vitamina E en el organismo de las hembras son la esterilidad, los abortos espontáneos, la resolución del feto y en los machos, la alteración de la espermatogénesis. En el caso de la hipovitaminosis por vitamina E se observa la distrofia de los músculos y las alteraciones nerviosas. En la naturaleza la vitamina E se sintetiza solo en las plantas. La vitamina E, al combinarse con ácido nítrico concentrado, se oxida con la formación de una o quinona, compuesto de color rojo anaranjado, el tocorojo. La vitamina D interacciona con disolución de Tricloruro de Antimonio en cloroformo con la formación de un compuesto coloreado de color rojo anaranjado, cuya reacción no está estudiada. La vitamina K regula el proceso de coagulación de la sangre, participando en la síntesis de ciertas proteínas necesarias para la formación del coágulo (protrombina). En el caso de déficit de la vitamina K en el organismo, la sangre pierde su capacidad de coagular, y una herida en los tejidos produce hemorragias. Al déficit de vitamina K son especialmente sensibles los pájaros. En los animales, la vitamina K no se sintetiza, esto solo ocurre en plantas y microorganismos. En medio alcalino la vitamina K se hidroliza con formación de phthiocol que se combina con el éster dietilmalónico. C 2 H 6 O CO CH 2 CO OC 2 H 6 El producto de condensación de éster dietilmalónico con los grupos carbonilo de phthiocol tiene color violeta rojo. Las vitaminas del grupo B y la vitamina C son sustancias orgánicas muy solubles en agua. Estas sustancias son muy diversas en cuanto a su composición y propiedades, sin embargo, pero lo que tienen en común es que su papel biológico es muy similar ya que todas ellas, siendo componentes de enzimas, influyen en los procesos de metabolismo celular de proteínas, hidratos de carbono y lípidos. Indicios del déficit de la vitamina B3 en el organismo pueden ser las dermatitis, lesiones de la mucosa en la cavidad bucal y alteraciones de la digestión y del

11 sistema nervioso. La vitamina B3 se sintetiza por las plantas y los microorganismos, así como también en los tejidos de algunos animales (a partir de un aminoácido, el triptófano). La amida de ácido nicotínico es un constituyente (NAD) de las enzimas de oxidación reducción, las dehidrogenasas anaeróbicas. Bajo la acción de hidrosulfato sódico tiene lugar una reducción parcial de la amida de ácido nicotínico (o ácido nicotínico) con la fermentación de una derivada de 1.4 Dihidropiridina de color amarillo. Indicios de hipovitaminosis por vitamina B 12 pueden afectar el crecimiento, producir dermatitis, alterar la función reproductiva, y padecimiento de anemia perniciosa entre otras (en la sangre disminuye la cantidad de eritrocitos). Esta vitamina no es sintetizada por los animales monogástricos, pero a diferencia de los anteriores, en poligastricos la necesidad de vitamina B 12 se satisface gracias a la actividad de la microflora intestinal. La vitamina B 12 cumple su función biológica siendo un constituyente de una serie de enzimas que participan en la biosíntesis de los ácidos nucléicos y las proteínas, como también en la transferencia de los grupos metilo. La vitamina B 12 es la única de las vitaminas conocidas que contiene en su composición un metal, el cobalto; que está ligado muy establemente en un complejo cianocobalamínico. La determinación del cobalto es posible solo tras la destrucción de toda molécula de vitamina. Después de la mineralización de la cianocobalamina por ácido sulfúrico concentrado, el cobalto se descubre mediante el calentamiento del mineralizado con disolución de tiourea. Esto lleva a la formación de un complejo coloreado verde azulado que tiene la siguiente composición: [CO 2 (CSN 2 H 4 ) 3 ](SO 4 ) 2. El déficit de la vitamina C origina en el organismo animal la alteración del metabolismo de proteínas, baja resistencia contra las enfermedades del tracto gástro intestinal y de las vías respiratorias, hemorragias en la piel y en los órganos internos, hemorragias en las encías y la caída de los dientes (escorbuto). La vitamina C se sintetiza en las plantas y los tejidos de mayoría de los animales (a excepción del hombre, mono y el conejillo de Indias). El papel biológico de la vitamina C está relacionado con su participación en los procesos de oxidación reducción, la regulación de la biosíntesis de proteínas, ADN, hidratos de carbono y hormonas esteroidales. El ácido ascórbico o vitamina C reduce el hierro en el ión complejo de ferricianuro, transformándolo en ferrocianuro. En presencia de cloruro férrico se forma el ferrocianuro férrico de color azul (azul de Berlín): 2. OBJETIVO. Reconocer diferentes vitaminas por medio de reacciones químicas características de las mismas.

12 3. CONSULTAS PRELIMINARES 3.1. Cuál es la clasificación de las vitaminas? 3.2. De que tipo son las vitaminas que se trabajarán en la práctica? 3.3. Consultar las frases R y S de los reactivos a manipular en la práctica 3.4. Consultar las fichas de seguridad de los reactivos a manipular en la práctica 3.5. Consultar y reportar la solubilidad de cada una de las muestras comerciales con las que va a trabajar. 4. MATERIALES MATERIAL CANTIDAD Tubos de ensayo con tapa rosca 20 Pipeta de 5 ml graduada. 2 Pipetas de 1mL graduada. 2 Vaso de precipitados de 100 ml 2 Vaso de precipitados de 250 ml. 2 Varilla de vidrio 1 Pinza de madera 2 Goteros 3 Gradilla 1 5. REACTIVOS SUSTANCIA Tricloruro de Antimonio, sol. en cloroformo. SbCl 3 (R34-37, S26-45) Cloroformo. CHCl 3 (R /20/22, S36/37) Solución de Vitamina D en aceite (preparado comercial). Acido Nítrico concentrado. HNO 3 (R35, S /37/39-45) Vitamina E, solución en aceite (preparado comercial). Vitamina K, solución en alcohol (preparado comercial). C 31 H 46 O 2 Ester Dietilmalónico, solución al 1% en alcohol. 30 ml Hidróxido potásico, 1%. KOH (R11-36/38, S ) Vitamina B 12 en ampollas (200 µg/ml.).c 63 H 88 CoN 14 O 14 P Vitamina C en pastillas Carbón activo 3 g CANTIDAD 14 ml 60 ml Cantidad del Lab 30 ml Cantidad del Lab Cantidad del Lab 30 ml 20 ml Cantidad del Lab Cantidad del Lab *Remitir al manual de protocolo de riesgo/ seguridad y fichas técnicas de seguridad. El estudiante debe llevar al laboratorio muestras comerciales, como patrón de cada vitamina.

13 6. EQUIPO EQUIPOS CANTIDAD Baño maría (termostato) 1 Agitador mecánico 1 Centrifuga de Tubo 1 *Cada grupo debe traer una vitamina comercial de las relacionadas en la introducción. 7. METODOLOGÍA 7.1. REACCIÓN DE RECONOCIMIENTO DE LA VITAMINA D CON TRICLORURO DE ANTIMONIO. Adicionar 3 gotas de solución de vitamina D en dos tubos de ensayo. En el primer tubo de ensayo añadir 2 ml de cloroformo y en el segundo 2 ml de solución de tricloruro de antimonio (10 %). En el segundo tubo de ensayo aparecerá una coloración roja anaranjada cuya intensidad crece con el tiempo REACCIÓN DE RECONOCIMIENTO DE LA VITAMINA E CON ACIDO NÍTRICO. Adicionar 2 o 3 gotas de solución de vitamina E en aceite en dos tubos de ensayo. En el primer tubo de ensayo, añadir de 1 a 2 ml de agua; en el segundo, igual cantidad de ácido nítrico concentrado. Calentar ambos tubos de ensayo en el baño María hirviendo durante 10 min. En el tubo de ensayo con ácido nítrico la capa de aceite que contiene vitamina tomará una coloración roja anaranjada. DEBE TRABAJAR EN LA CAMPANA REACCIÓN DE RECONOCIMIENTO DE LA VITAMINA K. Verter 2 ml de solución de vitamina K en un tubo de ensayo, y añadir 0.2 g de hidróxido potásico y 1 ml de solución de éster dietilmalónico. En el tubo de ensayo aparecerá una coloración violeta roja, que indicará que la prueba es positiva REACCIÓN DE RECONOCIMIENTO DE LA VITAMINA B 3. Poner una pequeña cantidad de polvo de vitamina B 3 (ácido nicotínico o su amida) en un tubo de ensayo y añadir de 1 a 2 ml de solución de bicarbonato sódico. Mezclar y después añadir de 1 a 2 ml de disolución de hidrosulfito sódico (10 %). El líquido en el tubo de ensayo tomará un color amarillo. Aquellas muestras de carácter comercial que requieran de un tratamiento de decoloración, deberán tratarse antes de realizar la prueba con carbón activado con el fin de eliminar esta interferencia.

14 7.5 REACCIÓN DE RECONOCIMIENTO DEL Co CONTENIDO EN LA VITAMINA B 12 En un tubo de ensayo se traslada el contenido de un ampolla de vitamina B 12, se añaden 10 gotas de acido sulfúrico concentrado y se calienta sobre baño de arena durante 15 a 20 minutos, luego se añade una gota de perhidrol. Después de la decoloración del líquido del tubo de ensayo y su enfriamiento se añade 1 ml de agua. Sobre filtro sin cenizas se aplican 3 gotas de disolución de tioúrea y el filtro se seca sobre la llama del mechero con rejilla, luego en este mismo lugar del filtro se añaden 3-4 gotas del mineralizado obtenido. Después de secarlo de nuevo en el filtro debe aparecer una coloración verdeazulada que indica la presencia de cobalto. 7.6 REACCIÓN DE RECONOCIMIENTO DE LA VITAMINA C En un tubo de ensayo coloque 3 ml de agua, en otro 3 ml de vitamina C, en ambos tubos de ensayo se añaden 5 gotas de disoluciones de ferricianuro potásico y de cloruro férrico. En el tubo de ensayo con vitamina C debe aparecer una coloración azul. Consultar en que son solubles las muestras comerciales, traídas por su grupo. 8. OBSERVACIONES, CÁLCULOS Y RESULTADOS Pruebas Muestras Vitamina D Vitamina K Vitamina E Vitamina B 5 Vitamina C Vitamina B 12 Muestra P-1 Muestra P-2 Muestra P-3 Muestra P-4 9. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 9.1. Indicar las reacciones que ocurren en cada caso Justificar los casos en que las reacciones no den los resultados esperados Desde el punto de vista bioquímico, compare los resultados obtenidos con los esperados.

15 10. RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS QUÍMICOS 10.1 RECUPERACIÓN No aplica 10.2 DESACTIVACIÓN No aplica 10.3 ALMACENAMIENTO TEMPORAL Los residuos de la prueba 7.1 se depositarán en el recipiente para hidrocarburos halogenados. Para la prueba 7.2, los residuos del tubo número 1 deben depositarse en el recipiente para solventes orgánicos y los residuos del tubo número dos en el recipiente para ácidos y bases. Los residuos de las pruebas 7.3; 7.4 y 7.5 en el recipiente para ácidos y bases. Los residuos de la prueba 7.6 en el recipiente de Metales Pesados. 11. BIBLIOGRAFÍA LOZANO, J. A and TUDELA, J.; Practicas de Bioquímica: Experimentación y simulación 1ed Ed Síntesis, Madrid, ISBN: PLUMMER, D. T. "Bioquímica Practica" 2da. Ed. Mc Graw-Hill Latinoamericana, Bogotá, ISBN: