Revista CENIC. Ciencias Biológicas ISSN: Centro Nacional de Investigaciones Científicas Cuba

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1 Revista CENIC. Ciencias Biológicas ISSN: Centro Nacional de Investigaciones Científicas Cuba Díaz Pérez, Marilyn; Rodríguez Martínez, Claudio; Zhurbenko, Raisa; Hernández Robledo, Ernesto; Muñoz del Campo, Jorge Luis; Bello Rodríguez, Olga Evaluación del Desempeño de un Nuevo Medio de Cultivo en la Búsqueda de Enterococcus en Muestras Clínicas Revista CENIC. Ciencias Biológicas, vol. 36, 2005 Centro Nacional de Investigaciones Científicas Ciudad de La Habana, Cuba Disponible en: Cómo citar el artículo Número completo Más información del artículo Página de la revista en redalyc.org Sistema de Información Científica Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

2 Evaluación del Desempeño de un Nuevo Medio de Cultivo en la Búsqueda de Enterococcus en Muestras Clínicas Marilyn Díaz Pérez 1, Claudio Rodríguez Martínez 1, Raisa Zhurbenko 1, Ernesto Hernández Robledo 2, Jorge Luis Muñoz del Campo 3, Olga Bello Rodríguez 4 1 (Centro Nacional de Biopreparados (BioCen), Carretera a Beltrán Km 1½ Bejucal; CP: 32600, La Habana, Cuba; Departamento de Investigaciones de Medios de Cultivo, marilin.diaz@biocen.cu, Teléf: , Fax: ) 2 (Hospital Pediátrico Juan Manuel Márquez, Laboratorio de Microbiología) 3 (Hospital Pediátrico Leonor Pérez, Laboratorio de Microbiología) 4 (Centro de Investigaciones Médico-Quirúgicas CIMEQ, Laboratorio de Microbiología) RESUMEN: Las especies de Enterococcus han cobrado una gran importancia desde el punto de vista clínico en los últimos años por su elevada incidencia en las enfermedades nosocomiales y por la adquisición de resistencia a muchos antimicrobianos. El objetivo del presente trabajo consistió en la evaluación del desempeño de un nuevo medio de cultivo cromogénico desarrollado en el Centro Nacional de Biopreparados (BioCen) con muestras clínicas, buscando Enterococcus como principales patógenos. Se evaluaron un total de 236 muestras de Urocultivos, Vaginales, Hemocultivos, Coprocultivos, Uretrales y endocervicales procedentes de 3 instituciones hospitalarias de Ciudad de la Habana. En cada muestra analizada se aislaron e identificaron colonias con características típicas de Enterococcus, así como colonias diferentes a las de estos microorganismos, empleando un conjunto de pruebas bioquímicas. A partir de los datos de la identificación microbiana se determinaron los principales indicadores de calidad. En el medio de cultivo fue posible la identificación correcta de las colonias de Enterococcus de otros microorganismos por la coloración de las colonias. Del total de muestras evaluadas se obtuvieron sólo 8 resultados falsos positivos que correspondieron a las muestras de urocultivos y vaginales y un resultado falso negativo en una de las muestras vaginales. El diagnosticador fue capaz de promover el crecimiento microbiano de todas las especies de Enterococcus en un período de incubación de sólo 24 horas, lográndose un grado de inhibición elevado de los microorganismos no deseados. Los principales indicadores de calidad reflejaron valores elevados resultando ser la Sensibilidad de 100 %, Especificidad de 96,19 % y la Exactitud Diagnóstica de 93 % para el total de muestras evaluadas. ABSTRACT: Enterococcus species have charged a great importance from the clinical point of view in the last years for their incidence in the nosocomial illnesses and for the resistance acquisition to many antimicrobians. The objective of the present work consisted on the evaluation of the acting of a new chromogenic medium developed in the National Center of Bioproducts (BioCen) with clinical samples, looking for Enterococcus like main pathogens. A total of 236 samples of urine, vaginals, blood culture, coproculture, urethrals and endocervicals coming from 3 hospitals institutions of Havana city were evaluated. In each analyzed sample were isolated and identified colonies with typical characteristic of Enterococcus, as well as different colonies to those of these microorganisms, using a group of biochemical tests. Starting from the data of the microbial identification the main indicators were determined. In the culture medium was possible the correct identification of the colonies of Enterococcus of other microorganisms for the coloration of the colonies. Of the total of evaluated samples they were only obtained 8 positive false results that corresponded to the urine samples and vaginals and a negative false result in one of the vaginals samples. The diagnostician was able to promote the microbial growth of all enterococcus species in a period of incubation of only 24 hours, being achieved a high inhibition degree of the not wanted microorganisms. The main quality indicators reflected high values turning out to be the sensibility of 100 %, specificity of 96,19 % and the accuracy diagnostic of 93 % for the total of evaluated samples. Palabras claves: Enterococcus, cultivo, muestras clínicas. Key words: Enterococcus, culture, clinical samples.

3 INTRODUCCIÓN El diagnóstico rápido y exacto de bacterias Gram-positivas reviste una importancia crucial para la salud del hombre y de los animales debido a que estos microorganismos son los agentes causales de muchas enfermedades. Dentro de este grupo de microorganismos Enterococcus han cobrado gran importancia desde el punto de vista clínico en los últimos años, por su elevada incidencia en enfermedades nosocomiales y además por la adquisición de resistencia a muchos antimicrobianos (1). Las anteriores razones explican la urgente necesidad de lograr la detección e identificación rápida de estos microorganismos, así como la profundización en el estudio de los mismos. Los medios con sustratos cromogénicos y fluorogénicos constituyen una poderosa herramienta en el diagnóstico microbiológico ya que se basan en la detección de actividades enzimáticas específicas de ciertos microorganismos, eliminando la necesidad de subcultivos y pruebas bioquímicas adicionales para lograr una correcta identificación microbiana. Constituyen métodos sensibles que permiten mejorar la exactitud y rapidez en la obtención de los resultados (2,3,4). El objetivo del presente trabajo consistió en la evaluación del desempeño de un nuevo medio de cultivo cromogénico desarrollado en BioCen con muestras clínicas, buscando Enterococcus como principales patógenos. MATERIALES Y MÉTODOS Se evaluaron un total de 236 muestras de Urocultivos, Vaginales, Hemocultivos, Coprocultivos, Uretrales y endocervicales en 3 centros hospitalarios de Ciudad de la Habana (Hospital Pediátrico Juan Manuel Márquez, Hospital Pediátrico Leonor Pérez, Hospital CIMEQ). Del total de las muestras, 56 correspondieron a cepas aisladas, 14 fueron muestras de Urocultivos, 136 correspondieron a muestras vaginales, 1 fue de hemocultivo, 16 muestras correspondieron a Coprocultivos, 13 muestras fueron uretrales y 2 endocervicales. En cada muestra analizada se aislaron e identificaron colonias con características típicas de Enterococcus y colonias con características diferentes a las de estos microorganismos, en cada medio de cultivo, empleando un conjunto de pruebas bioquímicas (Tinción de Gram, Crecimiento en Caldo con NaCl al 6,5 %, Bilis-esculina, Hidrólisis de L-Pirrolindonil-β-Naftilamida (PYR), Sorbosa, Arabinosa, Catalasa, crecimiento en Agar Sangre y Serología del grupo D) (5). Como medios control se emplearon el Agar Chocolate, medio C.L.E.D. y Agar Sangre. El medio evaluado fue CromoCen ENT Listo para el Uso (LPU) (Lote Piloto). Para la inoculación de las muestras se empleó el método de siembra por inundación de la superficie y el método de siembra por estriado en la superficie. A partir de los datos de la identificación se determinaron en el medio CromoCen ENT los principales indicadores de calidad: Sensibilidad (S), Especificicidad (E) y Exactitud (ED) diagnósticas, así como los valores predictivos de los positivos (Vp+) y los valores predictivos de los negativos (Vp-). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Resultados de la evaluación del CromoCen ENT en el Hospital Pediátrico Leonor Pérez Se evaluaron un total de 52 cepas aisladas de Enterococcus y todas ellas crecieron en el medio a las 24 horas, obteniéndose colonias rosadas que se confirmaron por medio de pruebas bioquímicas resultando ser todas Enterococcus faecalis. Resultados de la Evaluación del CromoCen ENT en el hospital CIMEQ Se evaluaron un total de 13 muestras de Urocultivos. En 6 de estas muestras se obtuvieron colonias rosadas, pequeñas, en el medio CromoCen ENT. A ellas se les realizaron pruebas bioquímicas, obteniéndose los resultados que aparecen reflejados en la tabla 1.

4 Tabla 1 Resultados de la evaluación del medio CromoCen ENT con muestras de Urocultivo Muestra CromoCen ENT Medio Control Microorganismo identificado 1 Colonias rosadas Creció sólo K. pneumoniae K. pneumoniae 2 Colonias rosadas - Enterococcus sp. 3 Colonias rosadas - Enterococcus sp. 4 Colonias rosadas - Enterococcus faecalis 5 Colonias rosadas - Enterococcus faecalis 6 Colonias rosadas - Streptococcus β-hemolítico En 1 de estas muestras se obtuvieron colonias rosadas oscuras, pequeñas, en el medio CromoCen ENT, resultando ser una cepa de Enterococcus faecalis En 1 de estas muestras se obtuvo un crecimiento incoloro en el fondo del medio identificándose como Escherichia coli. Las 5 muestras restantes no crecieron en el medio CromoCen ENT, sin embargo, crecieron en el medio C.L.E.D. empleado como control, siendo en todos los casos microorganismos gram negativos. Igualmente se evaluaron 4 cepas aisladas de Enterococcus en el medio CromoCen ENT resultando ser todas cepas de Enterococcus faecalis. Se evaluaron un total de 41 muestras vaginales. De ellas, 27 muestras no crecieron en el medio CromoCen ENT, sin embargo, crecieron en el medio control Agar Chocolate, resultando ser microorganismos gram negativos. En una de las muestras se obtuvieron colonias rosadas oscuras, pequeñas, en forma de flor en el medio CromoCen ENT, resultando ser Streptococcus β-hemolítico. En dos de las muestras se obtuvieron colonias rosadas, pequeñas en el medio CromoCen ENT, identificándose por medio de pruebas bioquímicas. Una de ellas resultó ser Enterococcus faecalis y la otra Streptococcus viridans. En 7 muestras se obtuvieron colonias rosadas oscuras, pequeñas que fueron identificadas por medio de pruebas bioquímicas. Seis de ellas resultaron ser Enterococcus faecalis y una fue Streptococcus α-hemolítico. Igualmente en 3 de las muestras vaginales fueron identificadas colonias incoloras (o blancas) a las que se le realizaron pruebas bioquímicas de identificación. Los resultados aparecen reflejados en la tabla 2. Tabla 2 Resultados de la evaluación del medio CromoCen ENT con muestras de vaginales Muestra Microorganismo identificado Pruebas Bioquímicas realizadas 1 Enterococcus faecalis PYR, Catalasa, DNasa, Coagulasa y pase a Agar Sangre 2 Streptococcus β-hemolítico PYR, Catalasa, Serología y pase a Agar Sangre 3 Streptococcus β-hemolítico (Grupo PYR, Catalasa, Serología y pase a Agar Sangre B) En una de las muestras vaginales se identificaron colonias rosadas, pequeñas, que fueron identificadas por medio de pruebas bioquímicas como Enterococcus faecalis. Resultados de la evaluación del CromoCen ENT en el hospital pediátrico Juan Manuel Márquez En este centro hospitalario se evaluaron un total de 126 muestras. De ellas: 93 muestras fueron vaginales, 1 de Urocultivo, 1 de Hemocultivo, 16 muestras de Coprocultivo, 13 muestras Uretrales, y 2 muestras Endocervicales. Los resultados de la evaluación del medio CromoCen ENT con las muestras vaginales aparecen reflejados en la tabla 3.

5 Tabla 3 Resultados del medio CromoCen ENT con muestras vaginales 1 No creció Staphylococcus 2X Staphylococcus sp. 2 No creció Staphylococcus 1X Staphylococcus sp. 3 No creció Streptococcus viridans Streptococcus viridans 1X 4 Colonias rosadas Staphylococcus 3X Enterococcus faecium* V:S 5 No creció Staphylococcus 1X Staphylococcus sp. 6 No creció Staphylococcus 1X Staphylococcus sp. 7 Colonias rosadas Staphylococcus 1X Enterococcus faecalis* V:S 8 No creció Staphylococcus 1X Staphylococcus sp. 9 No creció Streptococcus γ hem 4X Streptococcus γ hemolítico 10 No creció Staphylococcus 4X Staphylococcus Coag: (-) 11 No creció Gram negativo 3X - 12 No creció Staphylococcus 1X Staphylococcus sp. 13 Colonias rosadas Gram negativo 2X Enterococcus faecium* V:S 14 Colonias blancas, Staphylococcus 1X Staphylococcus sp. transparentes 15 Colonias rosadas No creció Enterococcus faecium* V:S 16 Colonias rosadas Gram negativos Staphylococcus γ-hem Enterococcus faecium* V:S 17 No creció Creció en medio - p/anaerobios 18 Colonias rosadas - Enterococcus faecium Colonias blancas - Staphylococcus sp. 19 Colonias blancas - Staphylococcus β-hemolítico 20 Colonias blancas - Staphylococcus β-hemolítico 21 Colonias blancas - Staphylococcus β-hemolítico 22 Colonias rosadas Staphylococcus sp. Enterococcus faecium 23 No creció Staphylococcus 1X Staphylococcus sp. 24 No creció Staphylococcus 1X Enterobacterias 1X Staphylococcus sp. Enterobacterias 25 Colonias rosadas Staphylococcus 1X Enterococcus faecalis* V:S 26 Colonias blancas Staphylococcus 1X Staphylococcus saprophyticus* 27 No creció Actinomyces Actinomyces sp. 28 No creció Escherichia coli 2X Escherichia coli 29 Colonias rosadas Candida sp. Enterococcus faecium* V:S 30 No creció Proteus 4X Proteus sp. 31 No creció Staphylococcus 2X Staphylococcus coag: (-) 32 No creció No creció - 33 Colonias rosadas Staphylococcus 2X Enterococcus faecium* V:S 34 Colonias rosadas Gram negativos 2X Enterococcus faecium* V:S 35 Colonias blancas Staphylococcus 2X S. epidermidis* 36 No creció Staphylococcus 1X Escherichia coli 2X Staphylococcus sp. Escherichia coli sp. 37 No creció No creció - 38 No creció No creció - 39 No creció No creció - 40 No creció Staphylococcus Staphylococcus sp. 41 No creció Pseudomonas Pseudomonas sp. 42 No creció Staphylococcus 1X Staphylococcus sp.

6 Tabla 3 (Continuación) Resultados del medio CromoCen ENT con muestras vaginales 43 No creció No creció - 44 No creció Gram negativo 4X Gram negativo 45 No creció No creció - 46 No creció Staphylococcus 1X Staphylococcus sp. 47 No creció Streptococcus β- Streptococcus β-hem Coag: (-) hemolítico 48 No creció No creció - 49 No creció Escherichia coli 4X Escherichia coli 50 No creció Streptococcus 2X Streptococcus sp. 51 No creció Gram negativo 3X Gram negativo 52 No creció Escherichia coli 4X Escherichia coli 53 No creció Staphylococcus 4X Staphylococcus sp. 54 Colonias rosadas Streptococcus 2X No enterococcus 55 No creció Streptococcus 1X Streptococcus sp. 56 Colonias rosadas Streptococcus 4X Enterococcus faecium 57 No creció Streptococcus 3X Streptococcus sp. 58 No creció Staphylococcus 2X Staphylococcus sp. 59 No creció Gram negativo 1X Gram negativo 60 No creció Streptococcus 4X Streptococcus sp. 61 No creció Staphylococcus 3X Staphylococcus Coag: (-) 62 No creció Staphylococcus 1X Staphylococcus sp. 63 No creció Staphylococcus 2X Staphylococcus sp. 64 No creció Staphylococcus 2X Staphylococcus sp. 65 No creció Streptococcus 2X Streptococcus sp. 66 No creció Streptococcus 2X Staphylococcus 1X Streptococcus sp. Staphylococcus sp. 67 No creció Staphylococcus 2X Staphylococcus sp. 68 No creció Staphylococcus 2X Gram negativo 2X Staphylococcus sp. Gram negativo 69 No creció Gram negativo 3X Pseudomonas sp. 70 No creció Staphylococcus 2X Gram negativo 1X Staphylococcus 2X Gram negativo 1X 71 No creció Staphylococcus 1X Staphylococcus sp. 72 No creció No creció - 73 No creció Staphylococcus 1X Staphylococcus sp. 74 No creció Streptococcus grupo B Streptococcus agalactiae 4X 75 No creció No creció - 76 No creció Staphylococcus 4X Staphylococcus sp. 77 No creció Staphylococcus 4X Staphylococcus sp. 78 No creció No creció - 79 No creció Levaduras Candida sp. 80 No creció Serratia 4X Serratia sp. 81 No creció Candida 4X Candida sp. 82 No creció Streptococcus γ- Streptococcus γ-hemolítico hemolítico 83 No creció Staphylococcus Staphylococcus sp. 84 No creció Staphylococcus 4X Staphylococcus sp. 85 No creció Staphylococcus Staphylococcus sp. 86 No creció Staphylococcus Staphylococcus sp. 87 No creció Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae 2X 88 No creció Gram negativo 4X Gram negativo

7 Tabla 3 (Continuación) Resultados del medio CromoCen ENT con muestras vaginales 89 Colonias rosadas Staphylococcus 2X Staphylococcus sp. 90 Colonias rosadas Candida 4X Candida sp. 91 No creció Staphylococcus 1X Staphylococcus sp. 92 No creció Staphylococcus sp. Staphylococcus sp. 93 No creció Haemophillus 2X Haemophillus sp. En la muestra de urocultivo se obtuvieron colonias rosadas resultando ser Enterococcus faecium. En la muestra de hemocultivo se obtuvieron también colonias rosadas siendo Enterococcus sp. En las siguientes tablas aparecen reflejados los resultados de la evaluación de medio CromoCen ENT con diferentes tipos de muestras. Tabla 4 Resultados de la evaluación de medio CromoCen ENT con las muestras de Coprocultivo 1 Colonias rosadas - Enterococcus faecium 2 Colonias rosadas - Enterococcus faecium Colonias blancas Staphylococcus epidermidis 3 Colonias rosadas - Enterococcus faecium 4 Colonias rosadas - Enterococcus faecium 5 Colonias rosadas - Enterococcus faecium 6 Colonias rosadas - Enterococcus faecium 7 Colonias rosadas - Enterococcus faecium 8 Colonias blancas Cocos gram (+) Staphylococcus epidermidis 9 Colonias rosadas - Enterococcus faecium 10 Colonias rosadas - Enterococcus faecium 11 Colonias rosadas - Enterococcus faecium 12 Colonias rosadas - Enterococcus faecium 13 Colonias rosadas - Enterococcus gallinarum 14 No creció Gram negativo Gram negativo 15 No creció Gram negativo Gram negativo 16 No creció Gram negativo Gram negativo Tabla 5 Resultados de la evaluación de medio CromoCen ENT con las muestras Uretrales 1 Colonias rosadas Colonias γ-hemolíticas Enterococcus faecium* V: S 4X Staphylococcus coag: (-) 2 No creció No creció - 3 No creció Gram negativo 2X Gram negativo 4 No creció Streptococcus β- Streptococcus β-hemolítico hemolítico 5 No creció Streptococcus 1X Streptococcus sp. 6 No creció Escherichia coli 4X Escherichia coli 7 No creció Colonias pequeñas, Ox: - (-) 8 No creció Staphylococcus 3X Staphylococcus sp. 9 No creció Staphylococcus y Streptococcus 2X Staphylococcus sp. y Streptococcus sp. 10 No creció Gram negativo 1X Gram negativo 11 No creció Gram negativo 4X Proteus mirabilis 12 No creció Streptococcus 4X Streptococcus sp. 13 Colonias blancas (4) Colonias pequeñas 4X Neisseria gonohorroeae * Identificado en el medio CromoCen ENT

8 En las dos muestras endocervicales ensayadas no creció ningún microorganismo ni en el medio CromoCen ENT ni en el medio control. De las 236 muestras evaluadas en los hospitales, se obtuvieron sólo 8 resultados falsos positivos y un resultado falso negativo. Los resultados falsos positivos pertenecieron a las muestras de urocultivos y vaginales. El resultado falso negativo se obtuvo en una de las muestras vaginales. Resultados obtenidos de los Indicadores de Calidad Se calcularon los principales indicadores de calidad por hospital y por total de muestras. Los resultados obtenidos aparecen reflejados en los siguientes gráficos. Gráfico No. 1 Resultados de los indicadores de calidad 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% Urocultivos Vaginales 30% 20% 10% 0% S ED E S: Sensibilidad, ED: Exactitud Diagnóstica, E: Especificidad Diagnóstica Fig. 1 Resultados obtenidos de los indicadores de calidad en el Hospital Clínico Quirúrgico CIMEQ 100% 98% 96% 94% 92% Uretrales Vaginales Coprocultivos 90% 88% S E ED Fig. 2 Resultados obtenidos de los indicadores de calidad en el Hospital Pediátrico Juan Manuel Márquez

9 Gráfico No. 3 Resultados de los indicadores de calidad por total de muestras 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% Urocultivos Vaginales 30% 20% 10% 0% S ED E S: Sensibilidad, ED: Exactitud Diagnóstica, E: Especificidad Diagnóstica Fig. 3 Resultados de los Indicadores de Calidad por Total de Muestras Los principales indicadores de calidad de este medio de cultivo reportaron valores por encima del 90 % ya que de forma general la sensibilidad fue de 100 %, la exactitud diagnóstica fue de 93 % y la especificidad fue de 96,19 %. CONCLUSIONES El medio de cultivo fue capaz de promover el crecimiento microbiano de todas las especies de Enterococcus presentes en cada una de las muestras en sólo 24 horas, siendo capaz de suprimir en alto grado el crecimiento de otros microorganismos presentes en ellas. BIBLIOGRAFÍA 1. Koneman, E. W.; Allen, S. D.; Janda, W. M.; Schrekenberger, P. C.; Winn, W. C. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Fifth Edition. Lippincott. Philadelphia. New York, Manafi, M.; Kneifel, W. Fluorogenic and Chromogenic Substrates used in Bacterial Diagnostics. Microbiol. Reviews, Sept, , Manafi, M. Fluorogenic and chromogenic substrates in culture media and identification test. Int. J. Food Microbiol., 31, Manafi, M. New developments in chromogenic and fluorogenic culture media. Int. J. Food Microbiol., 60, , O'Leary, W. Practical Handbook of Microbiology. CRC Press, Boca Ratón Ann Arbor Boston, 581, Holt, J. G; Krieg, N. R.; Sneath, P. H. A.; Staley, J. T; Williams, S. T. Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Philadelphia, Williams &Wilkins., 528, 1994.