Laboratorio 9: Familia Enterobacteriaceae Métodos de Identificación Rápida. Biol: 3725L

Transcripción

1 Laboratorio 9: Familia Enterobacteriaceae Métodos de Identificación Rápida Biol: 3725L

2 Objetivos Conocer los métodos rápidos para la identificación de bacterias (API 20E, Enterotubo II, Biolog y Vitek). Inocular un desconocido en varias pruebas bioquímicas Tomar datos de las reacciones bioquímicas después de 24 horas de inoculación.

3 Características generales de la familia Enterobacteriaceae Bacilos (o coco-bacilos) Gram negativos No producen esporas Temperatura óptima entre C. Anaerobios facultativos. Flora normal del intestino de animales de sangre caliente. Catalasa positivos Oxidasa negativos Causantes de enfermedades nosocomiales. Algunos producen cápsula. Patógenos humanos más comunes. Algunos fermentan lactosa. Pueden ser mótiles (flagelo).

4 Miembros de la Familia Enterobacteriaceae Citrobacter sp. Enterobacter sp. Escherichia sp. Klebsiella sp. Morganella sp. Proteus sp. Providencia sp. Salmonella sp. Serratia sp. Shigella sp. Yersinia sp. Salmonella typhimurium Shigella dysenteriae Serratia marcescens Salmonella enteritidis Yersinia pestis Klebsiella pneumoniae

5 Miembros de la Familia Enterobacteriaceae Los géneros patogénicos más comunes se clasifican en tres grupos Coliformes: bacilo, Gram -, fermentan lactosa a gas y acido, microbiota normal, pueden ser patógenos oportunistas. No coliformes oportunistas: no fermentan lactosa. Patógenos verdaderos

6 Enfermedades Gastrointestinales Tracto urinario Meningitis Septicemia Pneumonia

7 Modo de Transmición Alimentos contaminados Persona a Persona Agua contaminada Contacto con animal Ruta Oral

8 Propiedades virulentas de E.coli Enterohemorrágico Diarrea en humanos, bovinos, gatos y perros. Escherichia coli O157:H7 Clasificada de acuerdo a sus antígenos somáticos (O) y flagelares (H). Tolerancia acídica (ph bajo) Tolerante a muchos antibióticos

9 Escherichia coli O157:H7 Causa principal de colitis hemorrágica o diarrea con presencia de sangre. Puede progresar a Síndrome Urémico Hemolítico. Afecta riñones Puede causar Púrpura Trombocitopenia Trombótica Moretones Disminución de plaquetas (trombocitos) Trombos (coágulos en los vasos sanguíneos

10 Métodos rápidos de identificación de la Familia Enterobacteriaceae

11 Métodos rápidos de identificación API 20E (Analytical Profile Index) Provee muchos resultados de una sola inoculación. 20 microtubos con sustratos deshidratados (rehidratación con suspensión de bacteria) Se pueden identificar 127 géneros y 550 spp. diferentes Bacterias oxidasa-negativo Gram-negativo de la familia Enterobacteriaceae y otros Gram - API 20E Incubar a 35-37ºC hrs

12 API 20E Provee lectura de 22 pruebas bioquímicas Utilización Se genera anaerobiosis con aceite mineral estéril en pruebas cuyas siglas están subrayadas: Ej. ADH, LDC, ODC, etc Las pruebas marcadas con un recuadro inferior, se deben llenar completamente: Ej. CIT, VP, etc.

13 Procedimiento de API 20E Preparación de la suspensión Inocule una colonia (2-3mm diámetro) del cultivo puro de su bacteria en solución salina 0.85% Asegúrese que la suspensión sea homogénea.

14 Procedimiento de API 20E Luego de hacer la suspensión inocular los microtúbulos de API 20E Añadir 5 ml de agua en la bandeja de incubación para proveer atmósfera húmeda.

15 Como llenar los microtúbulos

16 Como se lee el API 20E? Aminoácidos analizados son (en orden) arginina, lisina y ornitina. Decarboxilación: reacción alcalina (cambio de color a rojo) Carbohidratos analizados son glucosa, manitol, inositol, sorbitol, ramanosa, sacarosa, melibiosa, amygdalina y arabinosa. Fermentación: reacción ácida (cambio de color a amarillo) Producción de H 2 S e hidrólisis de gelatina (cambio a color negro en todo el microtubo).

17 Interpretación del API 20E Apuntar los resultados en la tabla de tabulación (1, 2, o 4 puntos para reacciones +, 0 puntos para reacciones -). La prueba de oxidasa debe ser negativa. Tres pruebas son añadidas a la vez para dar un código de 7 dígitos (profile index number), el cual es interpretado en el manual de códigos.

18 Ventajas de API 20E Rápido Eficaz Permite realizar numerosas pruebas a la vez Desventajas de API 20E Solo para microorganismos no fastidiosos. Cepas Gram negativas y oxidasa negativa. Bacterias de la Fam. Enterobacteriaceae. De encontrarse Salmonella o Shiguella spp., es necesario llevar a cabo pruebas serológicas para confirmar la identificación.

19 API 20E Resultados para diferentes miembros de la Familia Enterobacteriaceae

20 Sistema de Enterotubo II Identificar miembros de la familia Enterobacteriaceae, fermentadoras de glucosa y que son oxidasa negativa. (Salmonella, Yersinia, Escherichia etc.) Algunas de las pruebas usadas en este sistema son: Simmon Citrate, Triple Sugar-iron agar, ureasa entre otros.

21 Sistema de Enterotubo II Tubo con 12 compartimentos, cada uno con un medio de cultivo sólido diferente. 15 pruebas estándar preformadas: Aerobia y anaerobias Se inocula con una aguja, que se pasa por el centro de los compartimentos Incubación: horas a 37ºC (oscuridad) Desventajas Poco preciso Riesgos de contaminación de las pruebas Se diagnosticaban erróneamente géneros de bacterias

22 Sistema Enterotubo II Lectura Observar cambios de color Identificación: Estructurar un código de 5 dígitos (Biocode) Consultar con el manual ENCISE (Enterobacteriaceae Numerical Coding and Identification System for Enterotube)

23 Sistemas Computarizados VITEK Identificación y/o determinación de reacción antibiótica de bacterias y levaduras anaerobias (más de 300 especies). 30 pozos con pruebas bioquímicas deshidratadas. Identificación en 2 a 7 hrs. La automatización aporta mayor seguridad, suprimiendo las manipulaciones repetitivas. Una vez inoculada, queda herméticamente cerrada y por lo tanto es manipulable sin riesgo de contaminación. No es necesario añadir ningún reactivo, lo cual evita cualquier riesgo de olvido o error.

24 Sistemas Computarizados Inoculador / Sellador El cual permite la inoculación de las tarjetas en pocos minutos. Incubador / Lector Asegura simultáneamente la incubación y la lectura de las tarjetas para una capacidad que varía de 32 a 480 tarjetas según el modelo. Ordenador Efectúa un control permanente de las operaciones en curso, memoriza los valores, trata e interpreta los resultados. Impresora

25 BIOLOG: Sistemas Computarizados Identificación de 1900 bacterias, levaduras y hongos en base a su capacidad enzimática. Sistema de microplacas de 96 fosas cada una conteniendo una fuente única de carbono, nutrientes básicos y un indicador colorimétrico. El indicador colorimétrico que utiliza este sistema es una sal de tetrazolium que en su forma oxidada es incolora. Cuando el organismo es introducido en la gran variedad de sustratos de carbono en la microplaca se produce una huella con un patrón característico. Los resultados bioquímicos de la muestra son leídos y guardados en segundos automáticamente, eliminando la subjetividad visual de la interpretación.

26 Sistemas Computarizados BIOLOG: Posteriormente son comparados con la extensa base de datos para su identificación final. Los resultados se interpretan y se registran automáticamente. Especie identificada se exhibe en un monitor de la pc junto con su patrón de la reacción. También una lista de 10 especies con los patrones relacionados más cercanos y otra estadística útil. La tecnología de Biolog es tan sensible que puede detectar cultivos mezclados o contaminados.

27 Práctica

28 Instrucciones Escoja una colonia de la placa de MSA o de MacConkey Seguir instrucciones del instructor. Haga las inoculaciones y actividades que le sugieren los flujogramas. Incubar a 37ºC/24hrs. Observar sus resultados y anotarlos. Recuerden traer su vaso de recolección de orina para la próxima semana!!

29 MacConkey Lab # 9: Familia Enterobactericeae e identificación de desconocidos coco morfología bacilo Neisseria Facultativo Veillonella - Pseudomonas Alcaligenes Halobacterium Flavobacterium - Shigella Klebsiella Métodos rápidos de identificación API 20E Enterotube Vitek Biolog + motil + Escherichia Enterobacter Citrobacter Proteus Providencia Erwinia Salmonella Morganella

30 MSA morfología bacilo Esporas coco Catalasa - Acid Fast + Aeróbico - 6.5% NaCl + Staphylococcus - Clostridium + Mycobacterium - + Bacillus Regular Pleomorfo - Streptococcus + Enterococcus Lactobacillus Listeria Corynebacterium Kurthia Propionibacterium

31 Fermentación de carbohidratos

32 Bile Esculin Agar

33 M S A Fermentación del mannitol.

34 SIM Sulfide Indole Motility

35 Urease Recuerden traer su vaso de recolección de orina para la próxima semana!!