TEMA 12. Identificación microbiana (I): métodos convencionales y métodos rápidos (manuales y automatizados)

Transcripción

1 TEMA 12 Identificación microbiana (I): métodos convencionales y métodos rápidos (manuales y automatizados)

2 Tema 15. Identificación microbiana: métodos bioquímicos 1. Esquema general de identificación microbiana 2. Métodos convencionales 2.1. Pruebas bioquímicas 3. Métodos rápidos 3.1. Sistemas manuales API Lectura e interpretación de los resultados Diferentes tipos de galerías API Sistema ATB (API automatizado) Enterotubo Lectura e interpretación de los resultados 3.2. Sistemas automatizados Abac-Abactor II Procedimiento Vitek Procedimiento

3 1. Esquema general de identificación microbiana Muestra Aislamiento (medios selectivos) Microscopio (fresco/tinciones) Pruebas inmunológicas Pruebas genéticas Cultivo puro

4 1. Esquema general de identificación microbiana Cultivo puro Microscopio (fresco/tinciones) Pruebas bioquímicas Pruebas inmunológicas Pruebas genéticas Pruebas de sensibilidad a antibióticos Identificación

5 2. Métodos convencionales 2.1. Pruebas bioquímicas - Algunas pruebas bioquímicas se denominan PRUEBAS RÁPIDAS porque evalúan la presencia de enzimas preformadas y se realizan de forman inmediata: - CATALASA - CITOCROMO C- OXIDASA - COAGULASA - SOLUBILIDAD EN BILIS,.

6 2. Métodos convencionales - La mayoría de las pruebas bioquímicas convencionales de identificación se llevan a cabo cultivando los microorganismos (bacterias) en medios que contienen el sustrato a metabolizar - El medio se incuba generalmente de 18 a 24 horas - La reacción positiva se revela por cambios en el ph a consecuencia del proceso metabólico (el medio debe incluir un indicador) o bien detectándolo directamente mediante reactivos especiales

7 2. Métodos convencionales Pruebas bioquímicas en tubos (medios líquidos) Aceite Fermentación de la lactosa Prueba VP Pruebas en anaerobiosis (O/F)

8 2. Métodos convencionales Pruebas bioquímicas en tubos (medios sólidos) Prueba del citrato Kligler

9 2. Métodos convencionales Pruebas bioquímicas en placas Hidrólisis del almidón Crecimiento en sal y Utilización de manitol Crecimiento en bilis

10 3. Métodos rápidos - Sistemas comerciales: - Manuales: el operador debe realizar la inoculación y la lectura - Automatizados: instrumentos que efectúan la inoculación, la incubación y la lectura de manera automática, evaluando los resultados un ordenador que determina la identificación - Ventajas: - Rapidez de manipulación - Homogeneidad de resultados que permite la comparación entre distintos laboratorios - Disposición de bases de datos computerizadas para interpretar los resultados

11 3.1. Sistemas manuales - En la década de los 60 aparecieron los primeros sistemas comerciales de identificación (Enterotubo) - Los primeros sistemas se diseñaron para enterobacterias (frecuencia en muestras clínicas, rápido crecimiento y buen conocimiento de las pruebas bioquímicas necesarias para su identificación) - Ventajas de estos sistemas - Fiabilidad - Ocupan poco espacio en incubación y almacenamiento - Duración larga (caducan en 6 a 12 meses) - Fácil manejo, inoculación e interpretación de los resultados - Tanto las pruebas como los medios son uniformes

12 3.1. Sistemas manuales - Muchos de estos sistemas incluyen en pequeños pocillos de plástico una mínima cantidad de medio o del sustrato a estudiar, liofilizado o desecado - El medio se inocula directamente o bien el sustrato se rehidrata con un pequeño volumen de una suspensión del microorganismo en agua destilada o en medio de cultivo - El sistema se incuba y transcurrido un tiempo se leen los resultados - Los sistemas suelen incluir entre 10 y 50 pruebas - Existen sistemas dirigidos a la identificación de distintos grupos de bacterias: enterobacterias, bacilos Gram negativos no fermentadores, estafilococos, estreptococos, neisserias, corineformes, bacterias anaerobias; y levaduras - Todos los sistemas manuales comercializados deben manipularse y leerse de acuerdo con las instrucciones del fabricante

13 3.1. Sistemas manuales

14 API (Biomérieux) - Tiras de plástico con 20 minitubos con un orificio en la parte superior para la inoculación y que contienen los sustratos deshidratados de 20 pruebas bioquímicas - Se suministran dentro de sobres de aluminio sellado - La suspensión bacteriana se prepara a partir de colonias aisladas inoculadas en solución salina estéril (NaCl al 0,85%)

15 API (Biomérieux) - Los tubos se rellenan con una pipeta estéril o con una jeringa y aguja, con cuidado de no formar burbujas que impiden el contacto entre el sustrato y la suspensión bacteriana - Algunos tubos se llenan hasta la cúpula y a otros se les añade aceite de parafina para obtener condiciones de anaerobiosis Cúpula Tubo Aceite de parafina

16 API (Biomérieux) - Tras la inoculación se introducen en una bandeja de plástico con tapa para mantener la humedad durante la incubación; la bandeja tiene unos pocillos que se llenan con agua de grifo para mantener la humedad - La tira se incuba de 18 a 24 horas a 37ºC

17 Lectura e interpretación de los resultados - Hay pruebas de lectura directa y otras que necesitan la adición de reactivos - Las pruebas positivas y negativas se identifican por el color que adquieren los medios tras la incubación o tras la adición de reactivos Pruebas negativas Pruebas positivas

18 API STAPH API STREP

19 Lectura e interpretación de los resultados - Los resultados se interpretan en función de la tabla de lectura - A cada prueba se le asigna el valor + ó (según sea positiva o negativa) Código binario de 20 dígitos Obtención de un número binario de 20 dígitos Muy incómodo para trabajar

20 Lectura e interpretación de los resultados - Se convierte el código binario (+ +) en un código octal - Las pruebas se agrupan de tres en tres - A cualquier prueba negativa, ocupe el lugar que ocupe, se le asigna el valor 0 - Si la primera prueba de un triplete es positiva se le asigna el valor 1 - Si es positiva la segunda se le asigna el valor 2 - Si es la tercera, se le asigna el valor 4

21 Lectura e interpretación de los resultados - Al final, las 20 pruebas se transforman en un número o código de 7 dígitos que constituye el NÚMERO DE BIOTIPO etc. Pruebas no incluidas en la galería Código de la muestra: Klebsiella pneumoniae o Serratia liquefaciens

22 Lectura e interpretación de los resultados - Los resultados se anotan en la tarjeta y la identificación se comprueba en un manual o en la base de datos de un ordenador

23 Lectura e interpretación de los resultados API 20E API STAPH API 20 STREP

24 API 20 NE API NH API LISTERIA

25 API CORYNE API CANDIDA API 50 CH

26 Sistema ATB (API semi-automatizado)

27 Enterotubo (Becton Dickinson Diagnostics) - Tubo de polipropileno en forma de lápiz dividido en 12 compartimentos que permite la realización de diferentes pruebas bioquímicas (se pueden leer 15 resultados) 12 medios de cultivo 15 pruebas bioquímicas

28 Enterotubo

29 Enterotubo - El centro del tubo está atravesado por un alambre que sirve para la inoculación y sobresale por los dos extremos que están tapados por sendos tapones de rosca -No necesita preparar suspensión bacteriana - Se inocula directamente desde colonias aisladas

30 Enterotubo Hilo metálico para inocular el Enterotubo Compartimentos del Enterotubo

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32 Enterotubo - El alambre se vuelve a insertar en los 4 primeros compartimentos (para conseguir condiciones anaerobias) y el resto se rompe, colocando a continuación los dos tapones de rosca - Con el alambre roto se agujerean los 8 compartimentos restantes para incubar en aerobiosis - Se incuba horizontalmente de 18 a 24 horas a 37ºC

33 Enterotubo - Pruebas de lectura directa - Pruebas de lectura indirecta: los reactivos se inyectan con una aguja hipodérmica a través del tubo de propileno

34 Lectura e interpretación de los resultados -Tras la incubación se leen las pruebas obteniéndose un número binario de 15 dígitos ( ) según que éstas sean positivas (1) o negativas (0) - Se agrupan las pruebas de tres en tres y se obtienen los números octales (la primera prueba de cada triplete vale 4 si es positiva; la segunda vale 2 y la tercera vale 1; sin son negativas, cualquiera que sea su posición valen 0) - A partir de los números octales se obtiene el NÚMERO DE BIOTIPO DE 5 DÍGITOS - La identificación se comprueba en un registro de perfiles denominado ENCISE (Enterobacteriaceae Numerical Coding and Identification System)

35 Lectura e interpretación de los resultados

36 3.2. Sistemas automatizados Abac Abactor II (Menarini Diagnostics) - Es un sistema automatizado e informatizado para identificación de bacterias gram negativas y realización de pruebas de sensibilidad a antibióticos - Se compone de un conjunto de rotores (Abac) y de un instrumento para la distribución del inóculo y la lectura de las pruebas (Abactor)

37 Abac Abactor II Sirve para: 1. Identificación de bacterias Gram negativas y determinación simultánea de su sensibilidad a 15 antibióticos, basado en técnicas de dilución en medio líquido 2. Determinación de la sensibilidad bacteriana frente a 16 antibióticos, de bacterias Gram negativas, Gram negativas urinarias, estafilococos y estreptococos 3. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

38 Abac Abactor II Abac: son rotores con 32 compartimentos con medios de cultivo deshidratado para la identificación bacteriana y el estudio automatizado de la sensibilidad antimicrobiana. Hay tres tipos: - Abac-Identibiograma II: rotores que incluyen 13 pruebas bioquímicas y 15 antibióticos a una concentración única o doble - Abac-Antibiograma: rotores que incluyen 16 antibióticos a doble concentración - Abac-CMI: rotores que incluyen aminoglucósidos y beta-lactámicos - Vienen empaquetados en bolsas de aluminio al vacío y se pueden conservar hasta 18 meses a temperatura ambiente Código de colores

39 Abac Abactor II Abactor II: instrumento que realiza la distribución del inóculo y la lectura de los rotores de forma automática; interpreta e imprime en una tarjeta los resultados de la identificación bacteriana y las pruebas de sensibilidad

40 Abac Abactor II Descripción de Abactor - En la parte izquierda está el sector destinado a la distribución automática del inóculo y la homogeneización del cultivo después de la incubación, mediante una breve centrifugación Inoculación: 8 ml de suspensión en la cavidad central Se produce una centrifugación breve a baja velocidad que reparte el volumen por igual entre todos los compartimentos del rotor inoculación

41 Abac Abactor II - La incubación se realiza en una estufa, se saca el Abac y se lleva a una estufa a 35-37ºC - En la parte central está el sector que realiza la muestra la lectura de los rotores. El sistema de lectura consta de una fuente de luz que es enfocada por una lente al centro del pocillo - En la parte derecha se encuentra el teclado numérico para la introducción del número de identificación de las muestras y las teclas de función Tarjeta de lectura: son del mismo color que la etiqueta colocada en los rotores y está formada por TRES HOJAS AUTOCOPIABLES DIFERENTES lectura

42 Abac Abactor II La primera hoja es para el microbiólogo e indica: - Resultados de las pruebas bioquímicas - Nombre (probable o exacto) de la bacteria - Posibles pruebas adicionales para confirmar identificaciones probables - Perfil de sensibilidad a los distintos antimicrobianos (resistente, intermedio, sensible) - CMI (en el caso del Abac CMI) - Las otras dos copias se destinan al médico e indican: - Identificación definitiva - Perfil de sensibilidad Interpretación de los resultados - Exacto - Probable - Imposible

43 Abac Abactor II

44 Procedimiento 1. Realizar suspensión bacteriana a partir de colonias aisladas 2. Verter 8 ml del inóculo en la cavidad central del Abac 3. Colocar el rotor en Abactor para que la rotación del aparato durante unos segundos transfiera 0,1 ml de inóculo a cada compartimento 4. Incubar el Abac en recipiente adecuado en la estufa a 37ºC de 18 a 20 horas 5. Colocar el rotor de nuevo en Abactor, esperar y retirar la tarjeta con los resultados impresos

45 Vitek (Biomerieux) - Sistema automatizado e informatizado que permite la identificación de bacterias Gram negativas y Gram positivas incluyendo patógenos de orina, patógenos entéricos, levaduras, anaerobios, Neisseria y Haemophilus, e indica la susceptibilidad a antimicrobianos Incubador y lector Módulo de llenado y sellado Tarjetas Programa Disco duro Impresora

46 Vitek - Las tarjetas son de plástico transparente - Tienen 24 micropocillos con sustratos deshidratados - El llenado de las tarjetas se realiza por succión al vacío (puede llenar 10 a la vez) en el módulo de llenado Pocillo con sustrato Transferencia automática del inóculo por succión al vacío

47 Vitek - La incubación se realiza dentro del mismo aparato, se pueden incubar 240 tarjetas a la vez - El módulo de lectura admite 30, 60, 120 ó 240 tarjetas - Se le pueden pedir resultados en cualquier momento del proceso - La identificación se obtiene en 4-6 horas de media (2 horas en el caso de bacterias de crecimiento rápido)

48 Procedimiento 1. La tarjeta se marca con un número que el sistema puede leer directamente 2. Después de añadir diluyente al tubo que contiene la muestra, se colocan las tarjetas en el soporte con el tubo de transferencia dentro del tubo de muestra 3. Las tarjetas se colocan en el módulo de llenado y sellado donde la muestra será introducida por succión al vacío en los pocillos, sellando después la tarjeta

49 Procedimiento 4. Las tarjetas se colocan en una bandeja y se introducen en el módulo de incubación y lectura 5. Una hora después de cargar la muestra ya se puede pedir un informe preliminar 6. El informe final se imprime automáticamente para cada tarjeta al final del ciclo