3C apítulo. Técnicas de identificación. J. L. López-Hontangas, F. J. Castillo y M. Salavert. 1. Introducción

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1 3C apítulo Técnicas de identificación J. L. López-Hontangas, F. J. Castillo y M. Salavert 1. Introducción El propósito fundamental del diagnóstico microbiológico clínico es optimizar la asistencia que se presta al paciente. Para alcanzar este objetivo es esencial obtener y comunicar, lo antes posible, al médico responsable del mismo resultados útiles para su manejo y tratamiento, usando eficientemente los recursos disponibles. Conjugar estos objetivos, con el máximo rigor científico y una creciente demanda asistencial, es lo que se persigue en los Servicios de Microbiología Clínica. El diagnóstico etiológico directo de las enfermedades infecciosas pretende demostrar la presencia del microorganismo causal en productos patológicos adecuados obtenidos del paciente e incluye, entre otros procedimientos, el cultivo, el cual persigue el aislamiento del microorganismo causante de la infección. Cuando es factible, el cultivo se considera el método diagnóstico de elección, porque permite la identificación del microorganismo implicado, el estudio de su sensibilidad a los antimicrobianos apropiados y facilita la aplicación de marcadores epidemiológicos. Una vez aislado el microorganismo de la muestra, se procede a su identificación, es decir, a clasificarlo dentro de un grupo o taxón ya establecido, con el que tenga la mayor semejanza. La complejidad de este proceso depende del nivel de precisión o discriminación que se pretende conseguir. Aunque en los últimos años se ha asistido a un crecimiento importante en la oferta de métodos genotípicos aplicados al diagnóstico microbiológico, en la mayor parte de los procesos de identificación se siguen utilizando métodos fenotípicos, puesto que su realización, lectura y coste los hacen más asequibles. En este capítulo se revisan las técnicas de identificación de las bacterias patógenas. Los métodos clásicos para la tipificación de las bacterias se basan en sus características morfológicas y metabólicas. Las pruebas diagnósticas se seleccionan en una base empírica, con el fin de proporcionar información sufi- 3

2 28 Microbiología aplicada al paciente crítico ciente para hacer posible la discriminación entre los géneros y especies. Además, hoy en día, las técnicas de biología molecular (basadas en la caracterización de genes específicos o segmentos de ellos) son cada vez más comunes y utilizadas en Microbiología Clínica. 2. Objetivos Y utilidad DE LAS TÉCNICAS DE identificación La identificación de una bacteria sospechosa de ser la causa de una infección es uno de los instrumentos principales del diagnóstico y tratamiento de las enfermedades infecciosas. Diferenciar un microorganismo patógeno per se, potencialmente patógeno o contaminante, y deducir sus posibles mecanismos de resistencia, facilita el tratamiento de la enfermedad infecciosa con la mayor eficiencia posible. También permite realizar un seguimiento y control de las infecciones hospitalarias, detectar un posible brote infeccioso y establecer una política de antibióticos coherente y apropiada en concordancia con el centro hospitalario o el área asistencial, lo que traerá consigo una disminución de las infecciones nosocomiales y/o comunitarias, y una menor generación de resistencias en los microorganismos. Para poder ser clínicamente útil, la identificación de un microorganismo debe ser lo más rápida posible. La economía y la práctica dictan el uso de un número mínimo de pruebas diagnósticas. Por necesidad, la identificación en Microbiología Clínica representará siempre un compromiso entre la exactitud y precisión, por una parte, y la rapidez y la economía por otra. Cómo se logra este compromiso es lo que determina la calidad diagnóstica en Microbiología. 3. Identificación BACTERIANA La taxonomía bacteriana tiene como objetivo la construcción de sistemas que permitan clasificar a las bacterias. Dentro de la clasificación taxonómica, las categorías y definiciones más utilizadas son familia (un grupo de géneros relacionados entre sí), género (un grupo de especies relacionadas entre sí), especie (un grupo de cepas relacionadas entre sí), tipo (grupos de cepas interrelacionados dentro de las especies; por ejemplo, biotipo, serotipo) y cepa (aislamiento concreto de una especie en particular). Uno de los factores clave para identificar a las bacterias como agentes patógenos depende de su aislamiento en cultivo puro. Una colonia en cultivo puro está compuesta por un solo tipo de microorganismo y procede de una sola célula original. Las pruebas de identificación se deben hacer siempre con colonias únicas procedentes de cultivos puros.

3 Técnicas de identificación 29 La taxonomía bacteriana convencional permite la identificación de géneros y especies mediante la aplicación de diversos criterios, como los que se resumen a modo de ejemplo en la tabla Métodos rápidos de identificación bacteriana El término de método rápido en microbiología engloba una amplia variedad de procedimientos y técnicas que permiten obtener resultados en menos tiempo que las pruebas diagnósticas convencionales. Existen métodos rápidos aplicables a la microscopía, técnicas de identificación bioquímicas, pruebas de detección de antígenos y de anticuerpos. Incluso en las técnicas de diagnóstico molecular existe una gradación de celeridad, siendo algunas de estas pruebas tan rápidas como la PCR a tiempo real. Los procedimientos microscópicos que utilizan tinciones estándar y/o anticuerpos fluorescentes para detectar microorganismos específicos se consideran métodos rápidos y se utilizan para la diferenciación inicial o la identificación presuntiva de ciertos grupos de microorganismos. La identificación rápida de los cultivos clínicos también incluye equipos de identificación comerciales e instrumentos o sistemas robóticos e informáticos completamente automatizados. Los equipos comercializados son habitualmente sistemas de pruebas miniaturizadas que utilizan sustratos cromogénicos o fluorogénicos para estudiar las enzimas preformadas. Las reacciones buscadas pueden ser obtenidas en un Tabla 1. Criterio Criterios y ejemplos metodológicos aplicados a la identificación bacteriana Metodología de ejemplo Observación macroscópica Observación microscópica Metabolismo Otras propiedades Observación e inspección de colonias: disposición, tamaños, textura, formas, pigmentos, etcétera Tinciones: formas, agrupación, esporas, cápsula, flagelos, etcétera Baterías bioquímicas: uso de sustratos (oxidación/fermentación), producción de metabolitos secundarios, etcétera Resistencia a antibióticos: antibiograma y antibiotipos, ribotipos, fagotipos, estudio de las concentraciones mínimas inhibitorias, estudio de sinergias o antagonismos, etcétera

4 30 Microbiología aplicada al paciente crítico tiempo de 2 a 6 horas de incubación, aunque algunas de ellas pudieran requerir una incubación ampliada hasta el día siguiente. Las capacidades y prestaciones de estos equipos y sistemas son muy variables y suelen incorporar sistemas de lectura mecanizada y automatizada mediante espectrofotómetros, códigos numéricos y bases de datos computarizadas, realizando de forma secuencial la incubación, lectura e interpretación de los resultados de las pruebas Tinciones rápidas El examen de las muestras debe iniciarse con la inspección visual ordinaria y proceder al nivel de magnificación necesario para visualizar el patógeno o determinar la ausencia del mismo. En la mayoría de los Servicios de Microbiología se realiza un examen macroscópico de la muestra mediante la inspección visual en el momento de realizar la extensión sobre el portaobjetos, la preparación de los cultivos y, posteriormente, un examen microscópico mediante las tinciones elegidas (Tabla 2); por lo tanto, el microscopio es el instrumento más necesario para un microbiólogo, dado que permite la observación de microorganismos que no pueden ser apreciados con detalle a simple vista. Las muestras pueden prepararse de diferentes formas para hacer a los microorganismos más fácilmente visibles y mostrar sus características estructurales. Las suspensiones en fresco permiten valorar algunos elementos, como motilidad bacteriana, recuento de leucocitos, detección de parásitos o protozoos o visualización de estructuras fúngicas; por otra parte, las tinciones microbiológicas permiten observar a los microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener, o no, determinados colorantes (Tabla 3). Las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos, siendo las más usadas las tinciones diferenciales, que permiten distinguir a los microorganismos por alguna de sus características tintoriales peculiares: Tinción de Gram: es de gran importancia en Microbiología, ya que permite hacer diferenciaciones taxonómicas, separando dos grandes grupos de bacterias (gram-positivas, de color violeta azulado, y gram-negativas, de color granate o rojo-rosado), según se comporten ante esta tinción. Tinción ácido-alcohol resistente: se basa en que ciertos microorganismos no pierden la coloración por una mezcla de ácido y alcohol si han sido previamente teñidos con fucsina fenicada. Se dice que son microorganismos ácido-alcohol resistentes. Otras: hematoxilina férrica, tricrómica, May Grunwald-Giemsa, Wright- Giemsa.

5 Técnicas de identificación 31 Tabla 2. Sistemas de observación de los microorganismos patógenos Herramienta Magnificación (x) Aplicación Ojo humano 0 Examen visual ordinario Lupa o gafa-lupa 5 Examen visual ordinario con precisión Microscopio de disección 2,5-30 Microscopio óptico: De campo claro Células teñidas De campo oscuro Examen y manipulación visual precisa y detallada Células no fácilmente teñidas para visualización en campo claro Contraste de fases Células vivas y/o no teñidas Microscopio de fluorescencia Microscopio electrónico: De transmisión 150 a 100 millones De barrido Preparaciones usando tinciones con fluorocromos, los cuales pueden teñir directamente las células o pueden acoplarse a anticuerpos que se fijan a las células Determina la ultraestructura de los orgánulos celulares Determina las formas y estructuras de la superficie celular La tinción más utilizada en microbiología es, sin lugar a dudas, la tinción de Gram, que proporciona información sobre los siguientes aspectos: Taxonómico: permite la clasificación inicial de las bacterias usando criterios morfológicos (tamaño, forma, agrupación, carácter tintorial). Clínico: permite un diagnóstico presuntivo de bacteriuria significativa, también un diagnóstico etiológico orientativo del líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente con sospecha de meningitis, etcétera. Control de calidad y validez de la muestra remitida para cultivo, como sucede con los esputos y otras muestras del tracto respiratorio. Guía para el procesamiento de la muestra: orienta sobre la elección de los medios de cultivo, temperaturas y atmósferas de incubación, requerimientos nutricionales adicionales, etc. más apropiados según los microorganismos observados en la tinción.

6 32 Microbiología aplicada al paciente crítico Tabla 3. Tinciones y métodos microscópicos para la detección rápida de microorganismos en muestras y materiales infectados Tinción o método Aplicación Resultados esperados Comentarios Wright-Giemsa Azul de metileno Gram Ziehl-Neelsen, Kinyoun Microscopía de campo oscuro Tinta china KOH 10% LBA, preparaciones de Tzanck, muestras con fondo celular complejo Gránulos metacromáticos de corinebacterias Permite hacer diagnóstico presuntivo, sobre todo, en neumonía y meningitis bacteriana Tinciones de muestras (esputos, LBA, LCR, orina, etc.) para identificar bacterias ácido-alcohol resistentes (AAR) y para diferenciación de micobacterias y algunos actinomicetales aerobios (AAR parcial) Examen directo de lesiones con sospecha de sífilis primaria Examen directo de la extensión de LCR, sangre y orina para Cryptococcus Examen directo de las extensiones de piel, pelos y uñas para ver dermatofitos Morfología general de las estructuras ce lulares Permite visualizar bacterias, levaduras, parásitos e inclusiones virales Morfología general y seleccionada Corynebacterium diphteriae Detección de leucocitos, reconocimiento de la morfología de bacterias comunes Los microorganismos AAR muestran un color rojo granate, contrastado sobre un fondo azulado; permite detectar también parásitos como Cryptosporidium y Cyclospora Requiere experiencia para valoración adecuada; no incluye otros agentes in - fecciosos, pero puede diferenciar levaduras Las micobacterias son ba cilos rectos, cortos o largos y las nocardias, bacilos arboriformes y ramificados Se ven espiroquetas móviles Requiere experiencia Los criptococos poseen una cápsula de polisacáridos que aparece como un halo sobre un fondo oscuro Tinción inversa, la cápsula no se tiñe; requiere experiencia para diferenciar leucocitos de levaduras Visualiza elementos fúngicos Digiere las proteínas de las muestras y facilita la visualización

7 Técnicas de identificación 33 Tabla 3. Tinciones y métodos microscópicos para la detección rápida de microorganismos en muestras y materiales infectados (continuación) Tinción o método Aplicación Resultados esperados Comentarios Naranja de acridina Blanco calcoflúor Auramina-rodamina Es eficaz para diferenciar verdaderos mi - cro organismos de artefactos, especialmente en hemocultivos Examen directo de LCR, LBA y otros líquidos corporales para detectar estructuras fúngicas y algunos quistes parasitarios Es útil para búsqueda de AAR en una variedad de muestras clínicas, especialmente, las más contaminadas con flora normal Tinción de fluorocromo fijada a los nú cleos de las bacterias, que muestran fluorescencia naranja sobre un fondo oscuro; fluorescen tanto bacterias viables como no viables Las levaduras y mohos muestran una fluorescencia blanquecina suave Extensiones concentradas de sedimentos de micobacterias Requiere el uso de microscopio de fluorescencia Tinción fluorescente que se fija a la pared celular de hongos y levaduras, pero no a bacterias o células inflamatorias; se prefiere a la tinta china y a preparaciones de KOH Requiere el uso de microscopio de fluorescencia Tinción preferida para microorganismos AAR, por su rendimiento en el cribado de gran número de muestras Requiere el uso de microscopio de fluorescencia

8 34 Microbiología aplicada al paciente crítico Puede indicar la conveniencia de aplicar otras técnicas de diagnóstico rápido (detección de antígenos o de anticuerpos, técnicas de biología molecular). Guía la calidad del proceso que exige concordancia entre los microorganismos que se observan en la visión directa y los que se obtienen, recuperan o aislan por cultivo. Puede proporcionar ayuda para orientar la asistencia, tanto en pautas terapéuticas empíricas de antimicrobianos, como en la adopción precoz de medidas preventivas y de control epidemiológico. El aspecto de las bacterias en el microscopio permite plantear las siguientes cuestiones clave para el diagnóstico microbiológico: Qué características tintoriales presentan las imágenes o elementos visualizados en las preparaciones?: se trata de bacterias gram-positivas o gram-negativas?, son bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR), o no, o sólo parcialmente? Cuál es la morfología de las células bacterianas visualizadas?: bastones o bacilos, cocos, cocobacilos, difteromorfos o corinebacteriformes, espirales o helicoidales, pleomórficas (forma variable), Cuál es su disposición y estructura individual o integrada?, aparecen las células en forma separada o configurando cadenas, parejas, tétradas, racimos, agrupamientos ordenados o desordenados, etc.? y De qué tamaño son las células?: grandes, pequeñas, de dimensiones bacterianas o de aspecto fúngico (levaduriforme o filamentoso micelial)? 3.3. Identificación presuntiva por la morfología de las colonias Gracias al cultivo microbiológico se obtiene información adicional que es muy valiosa para aislar e identificar a los microorganismos. Los medios de cultivo sólidos pueden clasificarse en: 1. Medios no selectivos (agar sangre y agar chocolate): posibilitan el crecimiento de muchas especies diferentes de bacterias, pero no permiten el aislamiento de una sola especie bacteriana a partir de muestras propensas a la contaminación con un gran número de microorganismos comensales. 2. Medios selectivos : ayudan en el aislamiento de especies de importancia médica en presencia de especies comensales, mediante la adición de sustancias inhibidoras, sistemas indicadores y tampones que ayudan a la

9 Técnicas de identificación 35 detección diferencial (agar MacConkey, agar CLED, agar XLD, agar VCAT o VCN). Se utilizan para sembrar diferentes tipos de muestras contaminadas (intraabdominales, heces, orina o exudados genitourinarios). Es posible hacer una identificación preliminar de muchas bacterias importantes en la clínica, basándose en unas pocas y sencillas características macroscópicas de las células apreciables en su disposición en forma de colonias sobre los medios de cultivos en que crecen y se aislan. La interpretación de los cultivos primarios, después de h de incubación, requiere una evaluación de las colonias con una sistemática bien estructurada. Características macroscópicas de las colonias: Después de un examen visual del desarrollo en la superficie de las placas de agar, se deben apreciar las principales características de las colonias: tamaño (en general, las bacterias gram-positivas producen colonias algo más pequeñas que las gram-negativas), forma, grado de elevación, borde, color, superficie, densidad, consistencia y olor. Reacciones en el medio de agar usadas para la identificación de bacterias: 1. Tipo de hemólisis en el medio de agar sangre. La hemólisis es una reacción observada en el medio circundante o subyacente a la colonia; sirve de ayuda para la identificación presuntiva, particularmente, de los estreptococos, y debe valorarse frontalmente y por transiluminación. a-hemólisis: eliminación parcial de la sangre en torno a la colonia, originando una decoloración verduzca en el medio (ej.: S. pneumoniae, estreptococos del grupo viridans). b-hemólisis: eliminación completa de la sangre circundante o subyacente a las colonias por lisis completa de los hematíes (ej.: Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes). 2. Producción de pigmentos en medio de agar: es una de las características inherentes de cada microorganismo específico y pueden estar confinados a la propia colonia o colorear el medio: verde, a veces, con brillo metálico (P. aeruginosa), rojo-rosado (Serratia marcescens), azul (Kluyvera spp.), púrpura (Chromobacterium violaceum) o marrón negruzco (Prevotella melaninoge nica). Cambios en medios diferenciales: en los medios de cultivo diferenciales se incluyen diversos colorantes, indicadores de ph y otros componentes meta-

10 36 Microbiología aplicada al paciente crítico bólicos, que actúan como indicadores de las actividades enzimáticas y ayudan a identificar a las bacterias aisladas, muy útiles en determinados tipos de muestras, como los coprocultivos y urocultivos. Crecimiento en medios líquidos: hay claves importantes para la identificación de los microorganismos que pueden ser detectadas observando el crecimiento en los medios líquidos, especialmente, en el caldo de tioglicolato o en otros como el Brain-Heart-Infusion (BHI). La capacidad de la morfología colonial para hacer una identificación presuntiva permite: Realizar un diagnóstico presuntivo rápido en un momento de necesidad crítica basado en el juicio razonado del microbiólogo. Incrementar la calidad de los cuidados del paciente a través de la comunicación rápida de los resultados, aumentando el coste-efectividad de las pruebas microbiológicas (diferenciación de patógenos potenciales de la flora normal). Tener un papel significativo en el control de calidad, especialmente, de los procedimientos automatizados y de otros sistemas de identificación comercial disponibles (evitar interpretaciones erróneas, debidas a inóculos mixtos que alterarían la identificación), valorando la correlación de los resultados generados con la identificación esperada Pruebas bioquímicas rápidas Existen varias pruebas bioquímicas de realización fácil y rápida sobre colonias aisladas a partir de medios de cultivo que permiten la diferenciación presuntiva rápida entre grupos de microorganismos o entre especies bacterianas. Además, estas pruebas pueden orientar sobre las técnicas adicionales necesarias para hacer una identificación definitiva. En la tabla 4 se resumen los principios, los modos de acción y las aplicaciones de algunos de estos procedimientos Baterías y pruebas adicionales En la práctica, la identificación bacteriana se puede realizar con métodos convencionales o con métodos semi o totalmente automatizados. Los métodos convencionales se suelen llevar a cabo en forma de cascada decisoria, con un algoritmo de identificación consensuado o estandarizado (Fig. 1) o usando una batería de pruebas simultáneas que permita la identificación aproximada o defi-

11 Técnicas de identificación 37 Tabla 4. Principios, modos de acción y aplicaciones de algunas pruebas bioquímicas rápidas Prueba Enzima bacteriana Aplicaciones Indol Triptofanasa Reacción positiva (color rojo) identifica a E. coli, Proteus vulgaris ONPG b-galactosidasa Determina la fermentación de lactosa (color amarillo) en fermentadores lentos de la lactosa. Diferencia, por ej., Neisseria lactamica de especies patógenas de Neisseria Oxidasa Citocromo C oxidasa Diferenciación entre los no-fermentadores (reacción +, color azul-morado); también ayuda a la identificación de Neisseria, Aeromonas, Vibrio y Campylobacter Catalasa Catalasa Diferenciación de estafilococos (reacción + con burbujeo) de estreptococos (reacción -) y de Listeria de los estreptococos Solubilidad en bilis PYR (L-pirrolidonil-Bnaftilamida) L-pirroglutamilamino-peptidasa Identificación presuntiva de Streptococcus pneumoniae (colonias lisadas) en cultivos de esputo, sangre o LCR Identificación de estreptococos del grupo A de Lancefield. Diferencia Enterococcus de los es - treptococos del grupo D (reacción +, color rojo brillante) Ureasa (rápida) Ureasa Prueba de cribado (positiva, color rojo) para Cryptococcus, Proteus, Klebsiella y Yersinia enterocolitica Hipurato (rápido) Plasmocoagulasa Especiación de Streptococcus agalactiae, Campylobacter jejuni y Listeria Diferencia S. aureus de estafilococos coagulasa negativos nitiva. Siempre se parte de una identificación preliminar (basada en la tinción de Gram, morfología colonial, etc.) que permite simplificar la batería a un mínimo de pruebas necesarias y apropiadas.

12 38 Microbiología aplicada al paciente crítico Gram y morfología Coco gram-positivo No coco gram-positivo Catalasa Negativa Positiva Coagulasa Negativa ECN Positiva Staphylococcus aureus Figura 1. Ejemplo de identificación por algoritmo en cascada. ECN: estafilococos negativos para la coagulasa. Para la identificación de los bacilos gram-negativos (BGN) aerobios, del tipo de las enterobacterias, se realiza una batería de pruebas bioquímicas con la que se identifica a los que se aíslan más frecuentemente en nuestro medio. Además, conocer el fenotipo de sensibilidad antibiótica de una determinada especie ayuda de forma determinante a la identificación final. En la identificación de los cocos gram-positivos catalasa positivos es muy importante diferenciar a Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de los estafilococos coagulasa negativos (ECN). Por otra parte, para la identificación de los cocos gram-positivos catalasa negativos, la identificación preliminar es esencial, ya que existe una gran variedad de géneros. Por ello, se aconseja una identificación en cascada con unas pocas pruebas convencionales, que permitan identificar el género, y en algún caso, la especie (patrón hemolítico, crecimiento en forma de satélite con una cepa de S. aureus hemolítica, piracinamidasa, hidrólisis del hipurato, prueba del CAMP, solubilidad en bilis y optocina). Si interesa la identificación de la especie, lo más habitual es utilizar galerías comerciales (API rapid ID 32 STREP, Vitek2, MicroScan Walk-Away, Phoenix o Wider ).

13 Técnicas de identificación 39 Para la identificación de los bacilos gram-positivos de los géneros Corynebacterium y Bacillus, la diferenciación preliminar debe hacerse por la morfología de la colonia, color, hemólisis, características al microscopio, presencia de esporas, etc. Aunque para una mayor seguridad en la identificación se puede utilizar también un sistema de galerías para los bacilos corineformes (API Coryne), o el API 50 CHB para el género Bacillus o mediante métodos automáticos, como el sistema Phoenix. Para la identificación de bacterias anaerobias es importante realizar una identificación preliminar, que permite, en algunos casos, conocer el género, en función de la morfología, tinción de Gram, disposición y patrón de hemólisis. Una identificación definitiva se puede realizar con galería de pruebas como el API rapid ID 32 A Métodos semi o completamente automatizados En el mercado existen varios métodos de identificación semiautomáticos y automáticos que superan a los métodos convencionales por su fácil realización y el menor tiempo que requieren para alcanzar una identificación definitiva de la especie. Además, muchos de estos sistemas permiten realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos al mismo tiempo. En general, los métodos automáticos se deberían utilizar para la identificación sistemática en el laboratorio de microbiología; pero estos métodos no permiten siempre la identificación de todas las bacterias. Por lo tanto, el microbiólogo debe comprobar que los resultados de los métodos automáticos se corresponden con los de otras pruebas y con su sospecha diagnóstica; además, estos sistemas requieren controles de calidad estrictos. Entre los métodos de identificación automáticos comercializados se encuen tran Vitek2 (bio-mérieux), MicroScan Walk-Away (Dade), Phoenix (Becton-Dickinson) y Wider (Soria Melguizo). La principal característica de estos métodos es su fácil y cómoda realización, permitiendo conseguir la identificación de la especie, dado que en su base de datos incluyen a la gran mayoría de las bacterias clínicamente importantes. En general, identifican bien a los BGN del tipo de las enterobacterias y a los BGN no fermentadores, a los estreptococos beta-hemolíticos, a los enterococos, a algunos estreptococos alfa-hemolíticos y a los estafilococos. Algunos sistemas disponen de paneles especiales para Streptococcus pneumoniae, BGP (como los de los géneros Listeria, Corynebacterium y Bacillus) y levaduras. Todos los sistemas automáticos actuales son parecidos en cuanto a rendimiento de porcentajes de identificación. La diferencia fundamental se encuentra

14 40 Microbiología aplicada al paciente crítico en las pruebas de sensibilidad y en el sistema experto que utilizan. Unos emplean simples reglas que aplican a los resultados y otros, como el Vitek2, utiliza el AES (sistema experto avanzado) que está basado en el reconocimiento fenotípico del mecanismo de resistencia de la bacteria deducido a partir de la CMI y aplicando la comparación con una base de datos que incorpora los resultados de las CMI publicadas en la bibliografía, o en documentos de consenso, y que son actualizadas periódicamente. Resumen El aislamiento, identificación y análisis de las bacterias que causan enfermedades en los seres humanos es una de las principales funciones del microbiológo clínico. El conocimiento de la estructura, fisiología y metabolismo bacteriano es muy importante, al menos, para tres de las áreas fundamentales de la microbiología médica: Cultivo de los microorganismos a partir de las muestras de los pacientes. Clasificación e identificación de los microorganismos después de haber sido aislados. Predicción e interpretación de su posible papel patógeno, colonizante o contaminante, así como de sus fenotipos, patrones y mecanismos de resistencia. El conocimiento de los requerimientos nutricionales de una bacteria concreta permite al microbiólogo seleccionar los medios apropiados de cultivo primario y optimizar las posibilidades de aislamiento del patógeno. La determinación de las características tintoriales, basadas en las diferencias de la estructura de la pared celular, es el primer paso hacia la clasificación taxonómica de la bacteria. Las diferencias bioquímicas y metabólicas entre microorganismos conforman la base de la mayoría de los sistemas de identificación bacteriana actualmente en uso. La capacidad de las bacterias para cambiar rápidamente, adquirir nuevos genes y sufrir mutaciones plantea continuos retos diagnósticos al microbiólogo en relación con el aislamiento y caracterización de los microorganismos asociados a las infecciones en humanos.

15 Técnicas de identificación BIBLIOGRAFÍA 1. Gobernado M, López-Hontangas JL. Identificación bacteriana. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2003;21(Supl. 2): Gobernado S, López Hontangas JL, Córdoba J. Métodos microbiológicos en el diagnóstico de infecciones. En: Enfoque clínico de los grandes síndromes infecciosos, 2ª ed. Madrid; Koneman EW, Allen SD, Janda EM. Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas Color, 5ª ed. Editorial Médica Panamericana; Mahon CR, Manuselis G Jr. Textbook of diagnostic microbiology. Philadelphia, Pennsylvania, USA: W.B. Saunders Company; Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, et al., editors. Manual of Clinical Microbiology. 8ª ed. Washington: ASM Press; 2003.