11 kn. de publicación: ES kint. Cl. 6 : C12N 15/11

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 kn. de publicación: ES kint. Cl. 6 : C12N /11 A61K 31/70 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Oligonucleótido terapéutico anti-hiv y composición farmacéutica. k Prioridad: US 9813 k 73 Titular/es: Hybridon, Inc. One Innovation Drive Massachusetts Biotechnology Research Park Worcester, Massachusetts 01, US k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Agrawal, Sudhir y Tang, Jin Yan k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Hernández Covarrubias, Arturo ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION Oligonucleótido terapéutico anti-hiv y composición farmacéutica. Campo de la invención Esta invención se refiere al tratamiento de la infección por HIV-1. Más particularmente, esta invención se refiere a agentes quimioterapéuticos denominados oligonucleótidos antisentido y a composiciones farmacéuticas que contienen dichos oligonucleótidos. Esta invención se refiere también a métodos para inhibir la replicación del HIV y para tratar la infección por HIV-1 utilizando dichos oligonucleótidos antisentido. Fundamentos de la invención Se cree que el virus linfotrópico de tipo III de la leucemia de las células T humanas (HTLV-III), conocido más comúnmente ahora como virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1), es el agente etiológico del síndrome de la inmuno-deficiencia adquirida (SIDA). Este virus forma parte de la familia Retroviridae, cuyos miembros contienen un genoma de ARN y actividad de transcriptasa inversa. Durante su ciclo de crecimiento, los retrovirus copian su ARN en ADN provírico. El ADN provírico es susceptible de integrarse en el ADN cromosómico de la célula huésped, en la cual utiliza la maquinaria de transcripción y traducción del huésped para expresar ARN y proteínas víricos. Los virus se liberan de la célula por gemación a través de la membrana citoplásmica. En el caso del HIV-1, la replicación vírica da como resultado la muerte de las células huésped de las células T adyuvantes, lo que conduce a un estado de inmunodeficiencia grave, al desarrollo de diversas enfermedades malignas e infecciones oportunistas, y por último a la muerte del organismo infectado. La incidencia del SIDA ha aumentado hasta proporciones epidémicas en muchos países sin el desarrollo de tratamientos preventivos o terapias que sean satisfactorios a largo plazo. Los pocos agentes terapéuticos que se han prescrito, tales como los análogos de nucleósidos 3 -azido-3 -des-oxitimidina (AZT), didesoxi-inosina (ddi), y didesoxicitosina (ddc), han logrado un éxito limitado. Esto se ha debido en parte a la citotoxicidad de dichos agentes. Adicionalmente, algunos virus escapan debido a mutaciones que los hacen insensibles a estos agentes y a la dificultad de la acción antivírica debido a la capacidad del virus para integrarse en el genoma del huésped. Así, existe una necesidad ampliamente sentida de agentes terapéuticos más eficaces y terapias preventivas contra el SIDA. Recientemente, se han desarrollado nuevos agentes quimioterapéuticos que son capaces de modular la expresión génica celular y extraña. Estos agentes, denominados oligonucleótidos antisentido, se fijan a una molécula de ácido nucleico monocatenario diana de acuerdo con la regla de apareamiento de bases de Watson-Crick o de Hoogstein, y al hacerlo así, desorganizan la función de la diana por uno de varios mecanismos: por prevención de la fijación de los factores requeridos para la traducción o transcripción normales; en el caso de una diana de ARNm, por desencadenamiento de la destrucción enzimática del mensaje por la ARNasa H; o por desorganización de la diana mediante grupos reactivos unidos directamente al oligonucleótido antisentido. Se han diseñado oligodesoxinucleótidos antisentido que inhiben específicamente la expresión de HIV-1 y otros virus(véase, p.ej., Agrawal (1982) Trends in Biotechnology : 2-8; Agrawal et al. en Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Erickson e Izant, compiladores), Raven Press Ltd., Nueva York (1992) pp ; Matsukura et al. en Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, Wiley-Liss, Inc. (1992) pp ; y Agrawal (1991) en Prospects for Antisense Nucleic Acids Therapy for Cancer and AIDS, (Wickstrom, compilador) Liss, Nueva York, pp ). Por ejemplo, se ha demostrado que oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de fosfodiéster sin modificar y secuencias complementarias a porciones de ARN de HIV-1 genómico inhiben la replicación vírica en células infectadas precozmente (Zamecnik et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: ; Goodchild et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 07-11). Sin embargo, estas moléculas son menos capaces de inhibir la replicación vírica en células infectadas crónicamente (Agrawal et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: ), debido principalmente a su susceptibilidad a las nucleasas (Wickstrom (1986) J. Biochem. Biophys. Meth. 13:97-2). Por esta razón, se han desarrollado análogos resistentes a las nucleasas, modificados químicamente, que son eficaces para inhibir la replicación del HIV-1 en cultivo de tejidos (Sarin et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: ; Agrawal et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: ; Matsukura et al. (1988) Gene 72: ). Estos análogos incluyen oligonucleótidos con enlaces internucleotídicos de fosforotioato resistentes a las nucleasas, que se ha demostrado inhiben la replicación de HIV-1 tanto en infección aguda (Agrawal et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: ) como en líneas de 2

3 células infectadas crónicamente (Agrawal et al (1991) en Gene Regulation: Biology of Antisense RNA, compiladores Erickson et al. (Raven Press, Nueva York), pp ; Vickers et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: ; Matsukura et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: ; Agrawal et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: ). Sin embargo, persiste todavía la necesidad de un oligonucleótido anti-hiv más eficaz que tenga efectos terapéuticos que estén acompañados por toxicidad baja o nula para las células. Sumario de la invención De acuerdo con la presente invención, se han diseñado nuevos agentes quimioterapéuticos que inhiben la replicación de HIV-1. Estos agentes son oligonucleótidos sintéticos que tienen enlaces internucleotídicos no fosfodiéster y una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de la región gag conservada del genoma del HIV-1. Gag forma parte del gen estructural de HIV-1 que es común a todos los retrovirus. Se sabe que las secuencias situadas alrededor del codón de iniciación gag son esenciales para el empaquetamiento vírico. El agente oligonucleotídico antisentido actúa por fijación al ADN o ARN diana, inhibiendo de este modo la iniciación de la replicación del ADN y expresión del ADN, e inhibiendo el empaquetamiento vírico por rotura de la estructura secundaria de su ADN. Los oligonucleótidos de la invención son más específicos, menos tóxicos, y tienen mayor resistencia a las nucleasas que muchos otros agentes quimioterapéuticos diseñados para inhibir la replicación de HIV-1. En particular, los compuestos de acuerdo con la invención que tienen enlaces internucleotídicos no fosfodiéster son más resistentes a la degradación nucleolítica que lo son los compuestos que tienen exclusivamente enlaces internucleotídicos fosfodiéster. Adicionalmente, aquéllos son más activos en la inhibición de la replicación vírica que otros oligonucleótidos antisentido conocidos que contengan una secuencia de nucleótidos complementaria para menos que la secuencia gag de HIV a 348. En sus aspectos más generales, la invención es un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia nucleotídicadeanucleótidos que es complementaria para al menos los nucleótidos 324 a 348 de la región gag de HIV-1, en el cual el oligonucleótido antisentido está enlazado por al menos un enlace internucleotídico no fosfodiéster, aumentando el enlace la resistencia del oligonucleótido a la digestión por las nucleasas. En una realización preferida de la invención, los oligonucleótidos tienen también al menos un enlace internucleotídico fosforotioato. Tales enlaces fosforotioato contienen una sustitución de oxígeno por azufre, haciendo con ello el oligonucleótido más resistente a la degradación nucleolítica. Otra realización de la invención es un oligonucleótido que tiene nucleótidos enlazados por al menos un enlace internucleotídico fosforotioato. Se hace referencia a este oligonucleótido como un -mero. La secuencia de nucleótidos de este -mero se representa en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: 1. Otras realizaciones de la invención incluyen oligonucleótidos de fosforotioato que tienen 26, 27, 28, 29 ó nucleótidos, cuyas secuencias son complementarias a los nucleótidos de HIV-1 además de otros nucleótidos flanqueantes. Las secuencias de dos 26-meros preferidos se representan en el Listado de Secuencias como SEQ ID NOS: 2 y 3; la de un 27-mero preferido se encuentra en SEQ ID NO: 4; las de 28-meros preferidos se encuentran en SEQ ID NOS: y 6; la de un 29-mero preferido se representa en SEQ ID NO: 7; y las de -meros preferidos se encuentran en SEQ ID NOS: 8 y 9. La invención proporciona también formulaciones terapéuticas que incluyen un oligonucleótido descrito anteriormente en un vehículo fisiológicamente aceptable, y métodos para inhibir la proliferación de HIV-1 y de tratamiento de la infección por HIV-1 en un mamífero utilizando estas formulaciones. Breve descripción de los dibujos Los objetos que anteceden y otros objetos de esta invención, sus diversas características, así como la invención en sí misma, pueden comprenderse más plenamente a partir de la descripción siguiente, cuando se lee junto con los dibujos adjuntos, en los cuales: la Fig. 1 es una representación esquemática de la región de iniciación gag considerada como diana del genoma de HIV-1 y la complementariedad para ella de nucleótidos de fosforotioato antisentido de la invención; la Fig. 2 es una representación esquemática de la región de iniciación gag considerada como diana y el -mero de la invención; 3

4 la Fig. 3 es una representación esquemática de la región de iniciación gag considerada como diana y el 28-mero de Matsukura et al.; la Fig. 4 es una representación esquemática de la región de iniciación gag considerada como diana y los sitios a cubrir por oligonucleótidos antisentido de la invención; la Fig. es una representación gráfica de la actividad de HIV-1 descrita en las Tablas como % de inhibición de la expresión de p24; la Fig. 6 es una representación gráfica de la actividad de HIV-1 descrita en las Tablas como % de reducción del CPE; y la Fig. 7 es una representación gráfica de un experimento de protección a largo plazo, que demuestra la eficacia del -mero en la inhibición de la expresión de p24 hasta el día 17 y la ausencia de eficacia de ddc. Descripción detallada de las realizaciones preferidas 3 Se describen oligodesoxinucleótidos antisentido con enlaces internucleotídicos no fosfodiéster que son particularmente activos para inhibir la replicación de HIV-1, y que son más resistentes a la digestión por las nucleasas que los oligonucleótidos con enlaces internucleotídicos fosfodiéster, y que son menos citotóxicos que otros agentes quimioterapéuticos anti-hiv. Estos oligonucleótidos (SEQ ID NOS: 1-9) se dirigen deliberadamente a la región situada alrededor del codón de iniciación gag del genoma de HIV- 1. Se ha demostrado que las secuencias situadas en esta región son esenciales para el empaquetamiento vírico. Estas secuencias forman una estructura secundaria estable (Harrison et al., (1991) en RNA Tumor Viruses (Coffin et al., compiladores) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, pp. 23). Los oligonucleótidos de la invención se han diseñado para fijarse a esta región, rompiendo con ello su estabilidad natural y dando finalmente como resultado la inhibición del empaquetamiento vírico y de la traducción del ARNm gag. Los oligonucleótidos son complementarios para al menos la secuencia de la región gag (SEQ ID NO: 11) de HIV (Fig. 2) (Muessing et al. (198) Nature (Londres) 313: -48). La secuencia está muy conservada entre las cepas de HIV-1, como se muestra a continuación en la Tabla 1. TABLA Secuencia de: TCTTCCTCTCTCTACCCACGCTCTC Secuencia de consenso CGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGATGCGAGAGCGTCAGTA Cepas de HIV-1 HTLV3/LLAV G A HIVLAI G A HIVNL43 G G HIVMN G G HIVJH3 G A HIVOYI G A HIVCDC4 G A HIVRF G A HIVMAL G A (Africana) HIVU4 A A CCTCAG (de Uganda) HIVSF2 (GA) 4G G HIVNDK G A El direccionamiento deliberado de un oligonucleótido antisentido a una región conservada de este tipo 4

5 que incluye un gen activo permite la inhibición eficiente de la proliferación de HIV sin la generación de mutantes de escape. Los mutantes de escape surgen cuando se produce una mutación en una región del genoma bombardeada por el oligonucleótido antisentido. Aquéllos ocurren con una frecuencia mayor en regiones no codificantes (como la región SA de HIV-1) que en regiones que codifiquen una proteína. Las secuencias nucleotídicas de los oligonucleótidos de la invención son cada una de ellas complementaria para al menos los nucleótidos del genoma de HIV-1. Un aspecto de la invención es un oligonucleótido constituido esencialmente por esta secuencia y se hace referencia al mismo en esta memoria como un -mero. La secuencia del -mero se representa en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: 1. Otros oligonucleótidos reivindicados con capacidad para inhibir la replicación de HIV-1 contienen la secuencia del -mero flanqueada en la dirección 3 y/o por nucleótidos adicionales complementarios para los nucleótidos que flanquean la región 324 a 348 de HIV-1. La secuencia de estos oligonucleótidos se representa en la Tabla 2 y en el Listado de Secuencias como SEQ ID NOS: 2-9. Se incluye también para comparación la secuencia de un -mero (Agrawal et al. (1992) Gene Regulation: Biology of Antisense DNA and RNA (Erickson e Izant, compiladores) Raven Press, Ltd.; Nueva York, pp (SEQ ID NO: )). TABLA 2 Oligonucleótido Secuencia SEQ ID No. 3 -mero -CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT mero CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTA 2 26-mero GCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT 3 27-mero GCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTA 4 28-mero GCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTAG 28-mero CGCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTA 6 29-mero CGCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTAG 7 -mero CGCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTAGC 8 -mero ACGCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTAG 9 -mero CTCGCACCCA TCTCTCTCCT 4 0 Los oligonucleótidos modificados de la invención son también inhibidores útiles de la proliferación de HIV-1, con inclusión de aquéllos que tienen enlaces internucleotídicos artificiales distintos de enlaces fosforotioato. Otros enlaces artificiales conocidos incluyen metil-fosfonatos, fosforamidatos, ditioatos, fosforotioatos puenteados, fosforamidatos puenteados, sulfonas, sulfatos, cetos, ésteres de fosfato, y fosforobutilaminas (véase, p.ej., van der Krol et al. (1988) Biotech. 6: ; y Uhlmann et al. (1990) Chem. Rev. 90: 43-8). Adicionalmente, los fosforotioatos y otros oligonucleótidos artificiales que tienen estructuras adicionales que confieren resistencia a las nucleasas son también útiles, tales como los extremos 3 y/o protegidos (véase, p.ej., la Solicitud EP N ; Letsinger et al. (1989) Biochem. 86: 63-66, y Reed et al. (1991) Bioconjugate Chem. 2: 217-2) y oligonucleótidos quiméricos (véase la Patente de EE.UU. N ) así como oligonucleótidos híbridos que tienen regiones de ARN y ADN. Otras modificaciones que confieren a los nucleótidos de la invención resistencia a las nucleasas incluyen secuencias terminales 3 que son internamente complementarias unas a otras, formando de este modo un lazo bicatenario en el extremo de la estructura. Por supuesto, pueden realizarse también otras modificaciones de los oligonucleótidos que mejoran la resistencia a las nucleasas, así como la especificidad y la actividad, y que reducen la citotoxicidad. Los oligonucleótidos de la invención pueden sintetizarse por diversos procedimientos conocidos que incluyen métodos en fase sólida que utilizan química de fosforamiditos o de H-fosfonatos (véase, p.ej., Agrawal et al. (1992) Ann. New York Acad. Sci. (en imprenta); Agrawal (1991) TIBTECH : 2-8), y pueden purificarse por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del inglés High Performance Liquid Chromatography) en fase inversa o de cambio de iones o métodos cromatográficos de afinidad de hibridación conocidos (véase, p.ej. Metelev y Agrawal (1992) Anal. Biochem. 0: ). Estudios del mecanismo y la eficiencia de los oligonucleótidos antisentido en la inhibición de la replicación vírica pueden enfocarse eficazmente en varios sistemas in vitro. Un sistema utiliza linfocitos

6 3 4 0 T humanos infectados crónicamente tales como células CEM. En dicho sistema, las células infectadas se cultivan en ausencia y presencia de concentraciones diferentes del oligonucleótido antisentido de la invención durante períodos de tiempo variables. Al contrario que los oligonucleótidos de la invención, análogos nucleotídicos tales como AZT, ddi, y ddc no inhiben la replicación de HIV en este sistema. Sin embargo, debido a que las células infectadas crónicamente son CD4 +, no puede producirse reinfección. Así, un cultivo in vitro de este tipo no es paralelo a las condiciones in vivo presentes en una persona infectada por HIV, en la cual únicamente un pequeño porcentaje de sus células CD4 + están infectadas y producen virus. Un modelo para estudios de fármacos que se aproxima más estrechamente a las condiciones in vivo es un cultivo de células con una multiplicidad de infección (MOI) aguda y baja. En este sistema, únicamente una fracción de la población de células alberga virus mientras que las otras células no están infectadas y son CD4 +.Laslíneas de células T humanas tales como CEM o H9 (ATCC HTB 176) se infectan con HIV durante una o varias horas y se cultivan luego en ausencia o presencia de concentraciones variables del oligonucleótido durante períodos de tiempo diferentes. La capacidad de los oligonucleótidos para inhibir la replicación de HIV-1 puede medirse por determinación del nivel de expresión de HIV y el efecto citotóxico de los oligonucleótidos sobre las células infectadas. La expresión de HIV puede observarse por varios parámetros, que incluyen formación de sincitios, expresión de p24, expresión de p17, y actividad de transcriptasa inversa (véase Agrawal et al. (1991) Adv. Drug Delivery Rev. 6: 1-270; Sarin et al. (198) Biochem. Pharmacol. 34: 7-79; y Sarin et al. (1987) J. Natl. Cancer Inst. 78: ). La inhibición del efecto citopático vírico (CPE) por los oligonucleótidos puede estudiarse por el método de exclusión con MTT o azul tripán. Los oligonucleótidosde la invención se pueden utilizarpara inhibirla proliferación de HIV-1 en células infectadas. En este método, se proporciona una formulación terapéutica que incluyen un oligonucleótido antisentido de la invención en un vehículo fisiológicamente aceptable. Las células infectadas por HIV-1 se tratan luego con la formulación terapéutica en una cantidad suficiente para permitir la fijación del oligonucleótido a la región gag del ADN y/o ARNm provírico del HIV-1 en las células infectadas. De esta manera, la fijación del oligonucleótido al ADN o ARNm de HIV-1 inhibe la expresión y replicación del virus. Los oligonucleótidos de la invención se pueden utilizar también para tratar la infección por HIV-1 en mamíferos. En este método, se proporciona una formulación terapéutica que incluyen un oligonucleótido antisentido de la invención en un vehículo fisiológicamente aceptable. El mamífero se trata luego con la formulación terapéutica en una cantidad suficiente para permitir la fijación del oligonucleótido a la región gag de ADN y/o ARNm provírico de HIV-1 en las células infectadas. De esta manera, la fijación del oligonucleótido inhibe la expresión de ADN de HIV-1 y la replicación del virus. Tal como se utiliza en esta memoria, un vehículo fisiológicamente aceptable incluye cualquiera y la totalidad de nci disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y análogos. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Ingredientes activos suplementarios pueden incorporarse también en las composiciones. Dosificaciones eficaces del oligonucleótido y modos de su administración en el tratamiento del SIDA pueden determinarse por experimentación de rutina. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma farmacéutica tiene que ser estéril. La misma tiene que ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y puede protegerse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión. La prevención de la acción de los microorganismos puede llevarse a cabo por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos. La absorción prolongada de los agentes terapéuticos inyectables puede llevarse a cabo mediante el uso de las composiciones de agentes retardantes de la absorción. El oligonucleótido en el vehículo puede administrarse por inyección intravenosa o intraperitoneal, o por administración intranasal, oral, transdérmica, o subcutánea. Las soluciones inyectables estériles se preparan por incorporación del oligonucleótido en la cantidad requerida en el disolvente apropiado, seguido por esterilización mediante filtración. 6

7 El HIV tiene una tasa mutacional alta y por consiguiente todos los fármacos diseñados para tratar la infección por el virus, con inclusión de los oligonucleótidos antisentido, pueden inducir la formación de mutantes de escape. Para resolver este problema, se ha sugerido la quimioterapia de combinación para el tratamiento de los pacientes infectados por HIV. Esta terapia implica más de un fármaco dirigido contra diferentes dianas, tales como inhibidores de la transcriptasa inversa combinados con inhibidores de las protesas. Alternativamente, puede utilizarse el bombardeo deliberado mediante tratamiento antisentido con diferentes secuencias sea en combinación o en programas de tratamiento secuenciales, dando como resultado presiones de selección diferentes sobre el virus con poco tiempo para desarrollar mutantes de escape. De acuerdo con ello, los primeros tratamientos consisten en la administración de una mezcla de oligonucleótidos de la invención, seguido por administración secuencial de oligonucleótidos dirigidos deliberadamente a otras regiones conservadas del genoma de HIV-1. La invención se comprenderá adicionalmente a partir de los ejemplos no limitantes siguientes. Ejemplo 1 Síntesis de los oligodesoxinucleotido-fosforotioatos 3 Se sintetizan oligodesoxinucleótidos modificados con fosforotioato utilizando química de H-fosfonatos en un sintetizador automático (Millipore 8700, Bedford, MA) en una escala de a milimoles. Después del ensamblaje de la secuencia requerida, el oligonucleótido H-fosfonato fijado a CPG se oxida con azufre en piridina/trietilamina/ disulfuro de carbono para generar enlaces fosforotioato. La desprotección se completa en amoníaco concentrado a C durante 48 h. La purificación se lleva a cabo por cromatografía preparativa en fase inversa seguida por cromatografía de cambio iónico. Finalmente, los oligonucleótidos purificados se dializan contra agua y se liofilizan. Los oligonucleótido-fosforotioatos se comprueban respecto a su pureza por HPLC y PAGE (Agrawal et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: ). El oligonucleótido utilizado para comparación en estos experimentos es el fosforotioato -mero, cuya secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: ) es complementaria para una porción de la región gag (números de nucleótido ) del genoma de HIV-1 (véase SEQ ID NO: 11). Como los oligonucleótidos de la invención, este -mero tiene enlaces internucleotídicos fosforotioato. Sin embargo, como se muestra en los experimentos descritos en los ejemplos que siguen, el mismo tiene menos actividad inhibidora de HIV-1 que los oligonucleótidos de la invención. Ejemplo 2 Especificidad de los oligonucleótidos antisentido y testigos 4 Para determinar la especificidad de los oligonucleótidos antisentido, puede compararse su efecto biológico con el oligonucleótido del mismo tamaño que no es complementario para ningún gen celular ovírico conocido. Se eligen tres de dichos oligonucleótidos testigo inespecíficos, uno de los cuales, que tiene una secuencia aleatoria es teóricamente el óptimo. La secuencia aleatoria se sintetiza como un oligonucleótido degenerado, por acoplamiento de una mezcla de cuatro nucleótidos en cada etapa (teóricamente, la misma contiene 4 28 =7,2x 16 secuencias), y por consiguiente mide la extensión de la inhibición inespecífica de la secuencia. Ejemplo 3 0 Ensayos de inhibición de HIV-1 Se utilizaron los ensayos siguientes para medir la capacidad de los oligonucleótidos de la invención para inhibir la replicación de HIV-1. A. Ensayo de sincitios La capacidad de los oligonucleótidos de la invención para inhibir la replicación de HIV-1, y por consiguiente la formación de sincitios, en cultivo de tejidos se ensaya en cultivos de células T de acuerdo con el método de Agrawal y Sarin (1991), íbid.). Resumidamente, se infectan células CEM con viriones de HIV-1 (0,01-0,1 TCID 0 /célula) durante 1 hora a 37 C. Al cabo de 1 hora, los viriones no adsorbidos se lavan y las células infectadas se dividen entre pocillos de placas de 24 pocillos. Se añade a las células infectadas una concentración apropiada (a partir de solución madre) del oligonucleótido para obtener la 7

8 concentración requerida en 2 ml de medio. Las células se cultivan luego durante 3 días. Al final de los 3días, las células infectadas se examinan visualmente respecto a la formación de sincitios o se tiñen con azul tripán o CTT para determinación del efecto citopático. 3 B. Ensayo de expresión de p24 La expresión de HIV se puede determinar midiendo el nivel de expresión de la proteína vírica p24 en células CEM esencialmente como ha sido descrito por Agrawal y Sarin (Adv. Drug Delivery Rev. (1991) 6: 1-270). De manera resumida, las células se reducen a un sedimento y se resuspenden luego en solución salina fosfatada a una concentración de aproximadamente 6 /ml. Las células se extienden en forma de mancha sobre portaobjetos de toxoplasmosis, se secan al aire, y se fijan en metanol/acetona (1:1) durante min a la temperatura ambiente (TA). Los portaobjetos se incuban a continuación con suero normal de cabra al % a TA durante min y se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se añade anticuerpo monoclonal anti-p24 a cada pocillo, y los portaobjetos se incuban en una cámara húmedaa37 C. Los portaobjetos se marcan con IgG anti-ratón de cabra durante min y se lavan luego en PBS durante la noche. Se compara el porcentaje de células que emiten fluorescencia en las células tratadas con oligonucleótidos y las células sin tratar C. Efecto citopático (CPE) El efecto citopático inducido por HIV se determina midiendo la disminución en el número de células viables después de la infección. Las células se cuentan por adición de colorante MTT o azul tripán a las células y determinación del grado en que muchas de las células (muertas) absorben el colorante. El ensayo se realiza por triplicado. D. Ensayo de transcriptasa inversa Este ensayo se realiza esencialmente como ha sido descrito en Agrawal et al. (Adv. Drug Delivery Rev. (1991) 6: 1-270). Se recogen los sobrenadantes de cultivos infectados por el virus en presencia y ausencia de oligonucleótido y las partículas de virus se precipitan con poli(etilenglicol). El sedimento de virus se suspende en 0 µl detampón que contiene Tris-HCl 0 mm (ph 6,8), ditiotreitol (DTT) mm, KCl 0 mm, y % de Triton X-0. La actividad de transcriptasa inversa en el sedimento solubilizado se ensaya en una mezcla de reacción de 0 µl que contiene Tris-HCl 0 mm (ph 7,8), DTT mm, KCl 0 mm, 0,01% de Triton X-0, µg de(dt) (τa) n como iniciador molde, MgCl 2 mm, [ 3 H]dTTP µm ( Ci/milimol), y µl de la suspensión de virus disgregada. Después de incubación durante 1 h a 37 C y adición subsiguiente de 0 µg de ARNt de levadura, se ensaya la incorporación de los nucleótidos radiactivos en la fracción de ADN insoluble en ácido tricloroacético frío, por cómputo en un contador de centelleo β. Ejemplo 4 Inhibición de la replicación de HIV-1 por un -mero unin vitro 4 La capacidad de los oligonucleótidos antisentido de la invención para inhibir la infección por HIV-1 en varias líneas de células establecidas puede demostrarse por realización de los ensayos a corto plazo (infección aguda) y largo plazo que se describen a continuación. A. Ensayos a corto plazo (infección aguda) 0 1. En células CEM Se infectan células CEM ( x 4 células/ml) con HIV-1 (cepa HTLV IIIB) durante 4 horas a 37 C. Las células infectadas y no infectadas se cultivan luego en presencia y ausencia de oligonucleótido tal como -mero o un oligonucleótido testigo que no tiene actividad alguna (p.ej., un -mero con SEQ ID NO: ) durante hasta 6 días a 37 C (por triplicado). Las concentraciones a las cuales se ensaya el -mero son 0,32 µg/ml (0,04 µm), 1,00 µg/ml (0,1 µm), 3,2 µg/ml (0,4 µm), µg/ml (1, µm), 32 µg/ml (4 µm), y 0 µg/ml (12, µm). La concentración eficaz que causa un 0% de inhibición de la replicación del virus (EC 0 ) se determina gráficamente. Después del experimento, se mide el nivel de expresión de HIV-1 por el ensayo de formación de sincitios (Tabla 3A) y el ensayo de expresión de p24 (Tabla 3B). La citotoxicidad se mide por análisis colorimétrico después de la adición de MTT a los pocillos como se han descrito anteriormente (Tabla 3C). 8

9 TABLA 3A Ensayo de inhibición de sincitios Oligo- Conc. N medio % Inhib. Reducc. EC 0 nucleótido µg/ml sincitios sincitios (%) µg/ml -mero mero El número medio de sincitios formados en el testigo (células infectadas pero sin tratar) era 3. Estos resultados demuestran que un oligonucleótido de la invención, el -mero, inhibe parcialmente (%) la formación de sincitios a una concentración menor (1,00 µg/ml) que lo hace el -mero. Adicionalmente, la concentración eficaz de oligonucleótido para causar 0% de inhibición de la replicación del virus (EC 0 ) era menor para el -mero que para el -mero, lo que indicaba que el -mero tiene más actividad. TABLA 3B Ensayo del antígeno p24 de HIV Oligo- Conc. Expresión de p24, Reducc. de la nucleótido µg/ml % del testigo de expresión de p24 virus (%) 4 0 -mero mero El -mero era capaz de reducir la expresión de p24 aproximadamente en un 0% a una concentración menor que lo era el -mero. Adicionalmente, a concentraciones altas (0 µg/ml) el -mero era aproximadamente dos veces más eficaz en la reducción de la expresión de p24 que el -mero, lo que indicaba queelmismoesaltamenteactivoparainhibirlaexpresión de HIV-1. 9

10 TABLA 3C Ensayo citopático de HIV Reducción en el Oligo- Conc. efecto citopático vírico nucleótido µg/ml (%) EC 0 Experimento 1 -mero mero TABLA 3C Reducción en el Oligo- Conc. efecto citopático vírico nucleótido µg/ml (%) EC 0 Experimento mero mero

11 TABLA 3C Reducción en el Oligo- Conc. efecto citopático vírico nucleótido µg/ml (%) EC EC 0 EC 90 Experimento 3 -mero mero El valor EC 0 del -mero requerido para reducir el efecto citopático vírico era significativamente menor que el del -mero en cada uno de los tres experimentos realizados, lo que indicaba que el mismo tiene menos citotoxicidad que el -mero. 2. En células H9: Se infectan células H9 con HIV-1 (cepas HTLV IIIB o HTLV IIIMN) con 0,01-0,1 TCID /célula durante 1 hora a 37 C. El valor TCID se determina por infección de células H9 con diluciones limitantes de virus y cultivos subsiguientes durante dos semanas. Los cultivos se preparan por cuadruplicado a una dilución de veces de HIV-1. Después de la infección, los viriones no absorbidos se separan por lavado. Las células infectadas se cultivan en presencia de concentraciones de oligonucleótido (0,00, 0,02, 0,13 y 0,6 µm) durante 3 a 4 días a 37 C. El nivel de la expresión de HIV-1 se observa por determinación de p24 en el sobrenadante con un ensayo de captura del antígeno p24 basado en anticuerpos monoclonales (DuPont). Los resultados se resumen en la TABLA 4. La citotoxicidad se determina por cultivo de células no infectadas con el -mero durante 3 a 4 días y cómputo de las células con un contador Coulter. Los resultados se muestran también en la Tabla 4 y en la Fig

12 TABLA 4 Ensayo del antígeno p24 de HIV Inhibición Conc. Supervivencia de p24 Exper. N Oligo. µg/ml µm células % % 1 -mero AZT mero mero Estos resultados muestran que el -mero es más eficaz en la inhibición de la expresión de p24, y por consiguiente la replicación de HIV-1, a concentraciones menores que lo es AZT. 3. En células CEM infectadas crónicamente: 4 Células CEM infectadas crónicamente se cultivan a 37 C en presencia del -mero a concentraciones de 0, 64 y µg/ml. Al cabo de 24 y 48 horas de tratamiento, los sobrenadantes de las células tratadas se retiran y se ensayan respecto al nivel de actividad de transcriptasa inversa como ha sido descrito por Sarin et al. (J. Natl. Cancer Inst. (1987) 78: ). El nivel se compara con el nivel de transcriptasa inversa en células infectadas testigo sin tratar. Los resultados se resumen en la TABLA. TABLA Actividad anti-hiv del -mero en células infectadas crónicamente 0 Oligo. Conc. Tiempo % Inhibición de µg/ml (horas) transcriptasa inversa -mero

13 El -mero era capaz de inhibir la actividad de transcriptasa inversa en este sistema in vivo, incluso al cabo de 2 días, al contrario que los análogos nucleotídicos que parecen no tener efecto alguno en las células infectadas crónicamente. B. Ensayos de infección a largo plazo Se infectan células H9 con HIV-1 (HTLV IIIB) a 0,01-0,1 TCID /célula durante 2 horas, se lavan para separar los viriones no absorbidos, se diluyen a 2 x células/ml y se cultivan a 37 C. Cada 3 a 4 días, las células se diluyen a 2 x /ml y se cultivan luego en medio reciente que contiene µg/ml (0,7 µm) del -mero o ddc. En el momento de la división de las células, se separa el sobrenadante y se mide el nivel de expresión de p24 por el ensayo de captura de antígeno (DuPont). Los resultados se muestran en la Fig. 7 y se resumen en la Tabla 6. TABLA 6 Inhibición de la replicación de HIV-1 por el -mero en cultivo a largo plazo Testigo -mero ddc Concentración (µm) - 0, 0,0 Expresión de p24 (pg/ml) día (9 ) 124 (7 ) día 7 188, (99 ),800 (94 ) día 2,0 380 (99 ) 17,0 (91 ) día 14 1,0 870 (9 ),000 (6 ) día 17 9,0,800 (94 ) 4,000 (44 ) % de inhibición del compuesto p24 comparado con el testigo Estos resultados indican que el -mero puede inhibir la expresión de p24, y por consiguiente la replicación de HIV-1, con mayor eficiencia que puede hacerlo ddc, y es mucho más activo que ddc a largo plazo (> diez días). Esto puede ser debido a que los análogos nucleotídicos son más susceptibles a la digestión por las nucleasas que lo son los oligonucleótidos con enlaces fosforotioato. Así pues, los oligonucleótidos de la invención son más específicos, menos tóxicos, y tienen mayor resistencia a las nucleasas que muchos otros agentes quimioterapéuticos diseñados para inhibir la replicación de HIV-1. Adicionalmente, aquéllos son más activos en la inhibición de la replicación vírica que otros oligonucleótidos antisentido conocidos que contienen menos que la secuencia 324 a 348 gag de HIV-1. Por ejemplo, el -mero representado en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: es menos activo que el -mero de la invención. Adicionalmente, un 28-mero descrito por Matsukura et al. (en Prospect for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, Wiley-Liss, Inc., (1991) pp ) (Fig. 3) que es complementario para una porción de la región gag que se solapa con la región , es también mucho menos activo. Esto puede ser debido a que el sitio de fijación de ribosoma (AUG) y las regiones que lo flanquean son enmascarados de modo seguro por los oligonucleótidos de la invención que tienen al menos una longitud de nucleótidos. Asimismo, cuando se hibridan a esta región, los oligonucleótidos de la invención no pueden ser reemplazados fácilmente por el ribosoma, impidiendo de este modo la infección por HIV. Adicionalmente, la conservación de esta región gag da como resultado la evitación de mutantes de escape. Este efecto puede incrementarse adicionalmente por el empleo de oligonucleótidos de la invención en asociación con otros oligonucleótidos anti-hiv o fármacos anti-hiv. 13

14 Listado de secuencias (1) INFORMACION GENERAL: (i) SOLICITANTE: Hybridon, Inc. (ii) TITULO DE LA INVENCION: Oligonucleótidos Antivíricos Terapéuticos Anti-HIV y Formulaciones Farmacéuticas de los mismos (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 11 (iv) DIRECCION DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Allegretti & Witcoff, Ltd. (B) CALLE: South Wacker Drive, Apartamento 00 (C) CIUDAD: Chicago (D) ESTADO: Illinois (E) PAIS: EE.UU. (F) CODIGO POSTAL: 6 (v) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR: (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible (B) ORDENADOR: PC IBM-compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS 3 (D) EQUIPO LOGICO: Patentin Release #1.0, Versión #1. (vi) DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US (B) FECHA DE PRESENTACION: (C) CLASIFICACION: 4 (viii) INFORMACION DE PROCURADOR/AGENTE: (A) NOMBRE: Kerner, Ann-Louise (B) NUMERO DE REGISTRO: (C) REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE: (ix) INFORMACION DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: (B) TELEFAX: (1) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: pares de bases 14

15 (B) TIPO: ácido nucleico (C) CLASE DE CADENA: simple (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERISTICAS: (A) NOMBRE: GEM 90 (B) LOCALIZACION: complementaria a pb del ADN de HIV-1 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT (2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: 3 (A) LONGITUD: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CLASE DE CADENA: simple (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERISTICAS: 4 (B) LOCALIZACION: complementaria a pb del ADN de HIV-1 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCTA 26 (2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: 0 (A) LONGITUD: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CLASE DE CADENA: simple (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERISTICAS:

16 (B) LOCALIZACION: complementaria a pb del ADN de HIV-1 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: GCTCTCCGCAC CCATCTCTCT CCTTCT 26 (2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CLASE DE CADENA: simple (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERISTICAS: (B) LOCALIZACION: complementaria a pb del ADN de HIV-1 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: GCTCTCGCAC CCATCTCTCT CCTTCTA 27 (2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: : 3 (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CLASE DE CADENA: simple (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc 4 (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: SI 0 (ix) CARACTERISTICAS: (B) LOCALIZACION: complementaria a pb del ADN de HIV-1 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: : GCTCTCGCAC CCATCTCTCT CCTTCTAG 28 (2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 16

17 (C) CLASE DE CADENA: simple (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERISTICAS: (B) LOCALIZACION: complementaria a pb 323- del ADN de HIV-1 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: CGCTCTCGCA CCCATCTCTC TCCTTCTA 28 (2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CLASE DE CADENA: simple (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: SI 3 (ix) CARACTERISTICAS: (B) LOCALIZACION: complementaria a pb 322- del ADN de HIV-1 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: CGCTCTCGCA CCCATCTCTC TCCTTCTAG 29 (2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 8: 4 0 (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CLASE DE CADENA: simple (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERISTICAS: (B) LOCALIZACION: complementaria a pb 321- del ADN de HIV-1 17

18 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: CGCTCTCGCA CCCATCTCTC TCCTTCTAGC (2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CLASE DE CADENA: simple (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERISTICAS: (B) LOCALIZACION: complementaria a pb del ADN de HIV-1 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: ACGCTCTCGC ACCCATCTCT CTCCTTCTAG (2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: 3 (A) LONGITUD: pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CLASE DE CADENA: simple (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc (iii) HIPOTETICO: NO 4 (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERISTICAS: 0 (B) LOCALIZACION: complementaria a pb del ADN de HIV-1 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: : CTCGCACCCA TCTCTCTCCT (2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 70 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CLASE DE CADENA: simple 18

19 (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc a ARN genómico (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: HIV-1 (viii) POSICION EN EL GENOMA: (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: ACTAGCGGAG GCTAGAAGGA GAGAGATGGG TGCGAGAGCG TCAGTATTAA GCGGGGGAGA ATTAGATCGA

20 REIVINDICACIONES 3 1. Un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria al menos a los nucleótidos 324 a 348 de la región gag conservada del genoma de HIV-1, teniendo el oligonucleótido a nucleótidos enlazados por al menos un enlace internucleotídico no fosfodiéster, mejorando el enlace la resistencia del oligonucleótido a la digestión por las nucleasas. 2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en el cual al menos uno de los enlaces internucleotídicos no fosfodiéster es un enlace fosforotioato. 3. El oligonucleótido de la reivindicación 2, en el cual el oligonucleótido tiene nucleótidos. 4. El oligonucleótido de la reivindicación 3 que tiene la secuencia de nucleótidos indicada en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: 1.. El oligonucleótido de la reivindicación 2, en el cual el oligonucleótido tiene 26 nucleótidos. 6. El oligonucleótido de la reivindicación que tiene la secuencia de nucleótidos indicada en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: El oligonucleótido de la reivindicación que tiene la secuencia de nucleótidos indicada en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: El oligonucleótido de la reivindicación 2, en el cual el oligonucleótido tiene 27 nucleótidos. 9. El oligonucleótido de la reivindicación 8 que tiene la secuencia de nucleótidos indicada en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: 4.. El oligonucleótido de la reivindicación 2, en el cual el oligonucleótido tiene 28 nucleótidos. 11. El oligonucleótido de la reivindicación que tiene la secuencia de nucleótidos indicada en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO:. 12. El oligonucleótido de la reivindicación que tiene la secuencia de nucleótidos indicada en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: El oligonucleótido de la reivindicación 2, en el cual el oligonucleótido tiene 29 nucleótidos. 14. El oligonucleótido de la reivindicación 13 que tiene la secuencia de nucleótidos indicada en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: 7.. El oligonucleótido de la reivindicación 2, en el cual el oligonucleótido tiene nucleótidos El oligonucleótido de la reivindicación que tiene la secuencia de nucleótidos indicada en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: El oligonucleótido de la reivindicación que tiene la secuencia de nucleótidos indicada en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: Una formulaciónterapéutica que comprende el oligonucleótido de la reivindicación 1 en un vehículo fisiológicamente aceptable. 19. Una formulaciónterapéutica que comprende el oligonucleótido de la reivindicación 4 en un vehículo fisiológicamente aceptable.. Una formulación terapéutica que comprende un primer y un segundo oligonucleótidos antisentido anti-hiv-1, siendo el primer oligonucleótido el oligonucleótido de la reivindicación Un método de inhibición de la proliferación de HIV-1 que comprende los pasos de: (a) proporcionar una formulación terapéutica que comprende el oligonucleótido de la reivindicación 1 en un vehículo fisiológicamente aceptable; y

21 (b) tratar células infectadas por HIV-1 in vitro con la formulaciónterapéutica en una cantidad suficiente para permitir la fijación del oligonucleótido a la región gag de cualquier ADN o ARNm provírico de HIV-1 en las células infectadas, conlocuallafijación del oligonucleótido al ADN o ARNm de HIV-1 inhibe la proliferación de HIV El método de la reivindicación 21, en el cual el paso en el que se proporciona la formulación terapéutica comprende proporcionar un oligonucleótido que tiene nucleótidos enlazados por al menos un enlace fosforotioato, indicándose la secuencia del oligonucleótido en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para uso como sustancia terapéutica activa. 24. El uso de un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para la preparación de una formulación farmacéutica para inhibir la proliferación de HIV NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 21

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