APLICACIONES BIOLÓGICAS DE LA ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL. P. Carmona Instituto de Estructura de la Materia (CSIC)
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- María Victoria María Concepción Ortiz de Zárate Padilla
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1 APLICACIONES BIOLÓGICAS DE LA ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL P. Carmona Instituto de Estructura de la Materia (CSIC)
2 GRUPO DE BIOESPECTROSCOPIA Aplicaciones Biológicas de la Espectroscopía Vibracional Estudios estructurales Aplicaciones bioanalíticas P. Carmona (IEM) M. Molina (UCM) C. Pargada (UCM) J. Bartolomé (FEHV) Proteínas y RNA virales. Componentes de alimentos reestructurados (proteínas, agua, lípidos). P. Carmona (IEM) M. Careche (IF) A. Herrero (IF) F. Jiménez (IF) Biodiagnóstico P. Carmona (IEM) A. Toledano (IC) I. Alvarez (IC)
3 Interacción radiación electromagnética-vibraciones moleculares ESPECTROSCOPIA INFRARROJA Y RAMAN Grupos funcionales Estructura espacial Análisis Químico
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5 Interacción radiación electromagnética-vibraciones moleculares ESPECTROSCOPIA INFRARROJA Y RAMAN Grupos funcionales Estructura espacial Análisis Químico
6 TIPOS DE ESTRUCTURAS A ESTUDIAR POR IR-RAMAN Secundaria Terciaria Cuaternaria Intercambio isotópico H/D Identificación Frecuencias características. Correlaciones espectro-estructura. Cuantificación Ajuste de perfiles. Regresión PLS. Dominios temporales de intercambio H/D Espectroscopía de correlación 2D
7 2850 cm cm-1
8 725 cm cm-1 ~1300 cm cm-1
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10 cm cm -1
11 cm cm -1 A-DNA B-DNA
12 IR spectra of biological components highlighting the most prominent absorption features. Spectra for a protein (myoglobin), lipid (dimyristoylphosphatidylcholine, DMPC), nucleic acid (poly-a), and carbohydrate (sucrose) are shown.
13 cm cm -1
14 ESTRUCTURA SECUNDARIA DE PROTEINAS Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales Y = a + b 1 X 1 + b 2 X b p X p Y i, X i = espectros de proteínas
15 5 -G C C A G C C C C C 3 -C A CA G C G G G G G U U G A
16 Wavenumber/cm -1 Raman Intensity/Arbitr. Units
17 Wavenumber/cm -1 Raman Intensity/Arbitr. Units
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21 Syringe pump Membrane 10 Cell front plate 6 5
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23 Quartz cell syringe pump microdialysis fibre laser
24 CINETICAS DE INTERCAMBIO H/D MEDIBLES POR ESPECTROSCOPIA IR-RAMAN (k 2.5 min -1 ) Proteínas Acidos Nucleicos lámina-β doble hélice A, B (pares GC) α-hélice est. cuat. (lámina-β, α-hélice, desordenada) estructura Z (pares GC, AT, AU) est. cuat. (pares GC, AT, AU)
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26 (a) Synchronous and (b) asynchronous 2D correlation spectra constructed from dynamic spectra.
27 VENTAJAS DE LA ESPECTROSCOPIA OPTICA DE CORRELACION 2D Resolución de bandas solapadas. Asignación de modos vibracionales mediante correlación de bandas. Secuenciación temporal de cambios espectrales. Detectar interacciones moleculares a través de grupos que generan bandas correlacionadas.
28 A cm Espectros síncronos de la proteína P22
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30 Hepatitis C virus
31 Wavenumber/cm Time/min
32 Microscopio Raman Renishaw
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46 Factor 2: % SINF NC Factor 1: % A Factor 1 versus Factor 2 plot (score plot) of principal component analysis from 16 healthy control and 29 scrapie-infected samples (NC and SINF groups, respectively). (Carmona et al., J. Gen. Virol., 2005).
47 Typical protein (lysozyme) β Sheet Other The steric structure of the protein is formed by interaction of amino acids. Therefore, the steric structure depends on the sequence of amino acids. α Helix Amino acid β Turn The structure of the protein is classified into 4 structures as follows: 1. Primary 2. Secondary 3. Tertiary 4. Quaternary
48 5 Abs Benzene ring (280 nm) Wavelength[nm] Almost all proteins have a peak at 280 n, therefore, quantitative analysis of protein can be performed with a UV/Vis spectrometer. An alternative quantitative analysis method is colorimetry using reagent (such as the Lowry method, Biuret method, etc.) Abs Calibration curve Quantitative analysis First of all, spectra of each protein concentration are measured to produce a calibration curve. Next, unknown samples are measured and quantitative analysis is performed Concentration [%, M etc.] Concentration [%, M etc.] using the calibration curve. Abs
49 Amid I peak contains the secondary structure information ( -Helix, - Sheet etc.) Using this peak, the IR-SSE program calculates SSE by PCR ( Principal Component Regression) or PLS (Partial Least Square) method.
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57 Principal Component 1, Loadings 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0-0,2-0,4-0,6-0,8-1,0-1, cm -1 Loadings plot of Factor 1 (Principal Component 1) for the score plot in the previous Figure.
58 35 30 β-sheet Structure (%) Controls Infected Bar diagram for the means of ß-sheet percentages measured for healthy control and scrapie-affected samples from genetically selected animals. (Carmona et al., Chemistry and Biology, 2004).
59 VIBRACIONES MOLECULARES Espectroscopia Infrarroja Espectroscopia Raman Absorción de radiación infrarroja Difusión inelástica de radiación APLICACIONES Estructura de la materia a nivel molecular (moléculas orgánicas, inorgánicas y cristales) Análisis químico (determinación de compuestos inorgánicos, orgánicos y biológicos) en estado sólido, líquido o gaseoso.
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61 Teoría de grupos ESTRUCTURA Cálclulos de frecuencias de vibración
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