Protección del color VS estabilización de color: Efectos sinérgicos

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1 Protección del color VS estabilización de color: Efectos sinérgicos V. Puente 1, C. Delgado 1, S. Arina 2 1 LAFFORT España. Pol. Txirrita Maleo Rentería. Guipúzcoa. vpuente@laffort.es 2 Bodegas Baigorri. C. Vitoria-Logroño, S/n Samaniego. Resumen Las vendimias cada vez más calurosas en los países más meridionales, provocan cambios y ajustes en los itinerarios tecnológicos de elaboración, donde el aporte de taninos aparece como el actor principal para compensar la madurez fenólica. En esta investigación, trabajaremos con diferentes hipótesis sobre los mecanismos de acción involucrados, para explicar los efectos observados sobre el color de un vino tinto tras el aporte de taninos: 1. Efecto copigmentación 2. Reactividad frente a las proteínas o efecto Kamikaze 3. Potencial antioxidante 4. Reactividad frente al acetaldehído Lo que se ha podido observar, es que tras la adición de taninos en un vino tinto, tanto mecanismos de protección como de estabilización están involucrados en los fenómenos de incremento de intensidad colorante. Estos fenómenos, se presentan como acciones sinérgicas que suman para la consecución de un mismo fin. En este caso, el empleo de un tanino únicamente reactivo frente al acetaldehído y por tanto con capacidad para formar teóricamente formas coloreadas estables, no es capaz en un vino tinto de alcanzar los mismos niveles de color que otro tanino con la misma capacidad de reacción pero además con un mayor potencial antioxidante o de copigmentación. El empleo de las técnicas aquí presentadas, nos posibilitarán cuantificar y predecir los efectos que los taninos enológicos ejercerán sobre el color de los vinos tintos, y de la misma manera seleccionar para cada momento de empleo el tanino óptimo. Palabras clave: Taninos, copigmentación, Efecto kamikaze, Potencial antioxidante, acetaldehido Abstract The hotter vintages, especially in the southern countries, lead to changes and adjustments on the technological itineraries, where tannins appear as key players to compensate the lack of phenolic maturity.

2 In this research, we will work with different hypotheses as mechanisms of action, to explain the effects observed on red wine color after tannin addition: 1. Copigmentation effect. 2. Reactivity against proteins or kamikaze effect. 3. Antioxidant potential. 4. Reactivity against acetaldehyde. From our observations, after addition of tannins in the red wines, protection as well stabilization mechanisms are involved in the phenomena observed of color intensity increase. These phenomena are presented as synergistic actions in order to achieve the same end In this case, the employment of a tannin only reactive against acetaldehyde, and therefore, theoretically with aptitude to form colored stable forms, it is not capable of reaching the same levels of color in red wines that another tannin with the same capacity of reaction but also with major antioxidant potential or copigmentation effect. The employment of these techniques, will make possible quantify and predict the effects that the enological tannins will exercise on the color of the red wines, and therefore to select the ideal tannin for every moment. Key words: Tannins, copigmentation, kamikaze effect, antioxidant potential, acetaldehyde Introducción Diversos efectos sobre los vinos tintos han sido relacionados con el empleo de taninos en vinificación, desde su reacción frente a las proteínas de los vinos (1), hasta su acción inhibitoria frente a enzimas oxidativos (2). Sin embargo, el aspecto por el que el tanino es reconocido a nivel enológico, es por su acción protectora del color y de la materia fenólica. Este efecto bien por su acción antioxidante, protegiendo a otros compuestos coloreados (3,4,5), bien por su contribución a aumentar los procesos de copigmentación (6), origina la obtención de vinos con mayores intensidades de color (7). La implicación de los taninos proantociánicos en la formación de complejos coloreados teóricamente más estables frente a la degradación (8), también se postula como un campo de estudio en la estabilidad de la materia colorante de los vinos tintos, donde el empleo de taninos elágicos, incapaces por si solos de formar formas complejas con los antocianos, si parece que pueden favorecer su formación a través de una acción antioxidante y formación indirecta de acetaldehído, molécula intermediaria en algunas de las reacciones de polimerización (9). Con este trabajo, se pretende caracterizar el efecto sobre el color de 3 taninos a través de la cuantificación de cuatro efectos relacionados con la conservación del color en el tiempo:

3 Efecto Kamikaze o acción protectora por reactividad frente a las proteínas endógenas de los mostos Efecto antioxidante frente a reacciones de oxidación Efecto de copigmentación frente a compuestos coloreados Efecto de estabilización frente al acetaldehído El objetivo final es dar posibles explicaciones a los mecanismos involucrados en la acción sobre el color vinos tintos elaborados en la D.O. Rioja con estos 3 taninos, así como comparar que acciones se presentan como determinantes en la conservación del mismo. Materiales y métodos Elaboración de los vinos. D.O. Rioja: uvas var. tempranillo se vinificaron por duplicado (zymaflore RX60) en depósitos de 500Kg. El llenado de los depósitos se realizó por gravedad a partir de orys de 2500 Kg. Los 3 taninos de origen diferente se aplicaron al 1º, 3º y 4º día de la vinificación a una dosis total de 30 g/hl ( ). Los vinos tras la fermentación maloláctica con Lactoenos 450PreAc, fueron embotellados tras ser corregidos en sulfuroso y tras filtración por 1.0 m. Análisis de los vinos. Se analizaron tras filtración por 0.65 m la intensidad colorante (d420+ d520+ d620), tonalidad (d420/d520), IPT (d280 nm), antocianos totales y taninos proantocianicos (Riberau-Gayon), % color copigmentado libre y polimérico (Boulton-Sommers), índice de polimerización (M. Ruiz) e índice de gelatina (Glories) tras la fermentación alcohólica, fermentación maloláctica y tras 9 meses en botella. Reactividad frente el acetaldehído: Los taninos se disolvieron a 3g/L en una solución sintética a ph = 3.2 y un 12% de etanol. Se filtró por 0.45 µm y se añadió 0.5 ml de acetaldehído( >99%), midiendo la variación de turbidez en el tiempo (Hach 2100P). Datos por triplicado Reactividad frente a las proteínas: Se preparó la solución de tanino a 10 g/l y se filtró por 1 m. A 25 ml de la solución de proteína (BSA a 0.8 g/l en solución 12º, ph 3.5, 5g/l tartárico) se le añadió 0.5 ml de la solución de tanino, y se midió la turbidez en el tiempo (Hach 2100P). Datos por triplicado Efecto copigmentación. A una solución modelo preparada a partir de un extracto natural de uva (110 mg/l antociano, 1.5 g/l tanino proantociánico en 12º, 5g/l ac. tartárico y ph 3,5) se le añadió cada tanino a un concentración final de 1 g/l. Tras filtración por 1 m, se esperó 30 minutos y se midió % copigmentación según Boulton- Sommers. Datos por triplicado Potencial antioxidante. Se partió de una solución modelo (110 mg/l antociano, 1.5 g/l tanino proantociánico en 12º, 5g/l ac. tartárico y ph 3,5) donde se añadió cada tanino a 50 g/hl. Se siguió la reducción de Fe 3+ a Fe 2+ mediante la variación de absorbancia del complejo coloreado formado. Metodología Laboratorios Excell Ibérica. Datos por triplicado

4 Turbidez (ntu) Estadística. Los tratamientos han sido comparados mediante Test T de student pareado para los efectos de reacción frente a BSA, copigmentación, potencial antioxidante y reacción frente al acetaldehído y mediante Test T de student NO pareado para los análisis de los vinos. Resultados y discusión Medición de la reactividad frente a las proteínas La interacción de las proteínas de la uva con los fenoles del vino se postula aquí como un mecanismo de pérdida de material fenólico endógeno. En técnicas como la maceración en frio de vinos tintos, al inicio de la FA más del 90% de los taninos proantociánicos presentes en el mosto provienen del hollejo, y normalmente es en esta fase donde el contenido de proteínas es más alto pudiendo generarse las interacciones que conllevarían a la floculación y la pérdida de material fenólico (comunicación personal G. Schmauch). Estos estudios han trabajado en la localización e identificación de péptidos y proteínas presentes en los mostos y vinos (10) y se ha llegado a identificar que en vinos tintos estos péptidos vienen tanto de la uva como de las levaduras (11) y que sus niveles tienden a ser bajos, ya que bien acciones proteolíticas de las levaduras bien interacción con los taninos del vino, tienden a disminuir su concentración (12). Este efecto por el cual se perdería una parte importante de los fenoles endógenos de la uva, es posible minimizarlo a través del efecto Kamikaze, empleo de taninos diana que sirvan de anclaje para las proteínas en las primeras fases de la fermentación alcohólica. La cuantificación del efecto Kamikaze se ha analizado a través de la reacción de los taninos frente a la proteína Seroalbúmina bovina (BSA), proteína globular de 67Kd, que presenta una interacción elevada frente a taninos oligómeros y poliméricos, y mucho menor frente a monómeros y dímeros (13), siendo buena elección para extrapolar los resultados de reactividad frente a taninos extraíbles del hollejo, taninos normalmente de alto peso molecular (14). 250 Reactividad frente a BSA Tanino 1 Tanino 2 Tanino 3 Fig. 1. Incremento de la turbidez originada por diferentes taninos proantociánicos en presencia de BSA en solución hidroalcohólica.

5 x 10-4 mol./l Ác. Ascórbico La fig. 1 muestra como la reactividad frente a la BSA del tanino 1 es mucho mayor que la los taninos 2 y 3, y significativamente diferente a ambos (t 1-2 =42,93 y t 1-3 =35,84; p<0,01) y por tanto con un mayor efecto Kamikaze frente a las proteínas del mosto, y mayor efecto protector del material fenólico endógeno de las uvas. Medición del Potencial Antioxidante. El empleo de los taninos en enología siempre ha tenido mucho que ver con la capacidad de estos para absorber el oxígeno, y por tanto con una acción antioxidante y protectora hacia los demás compuestos del vino fácilmente oxidables. En este caso el potencial antioxidante de un extracto natural de uva en solución modelo aumentó de manera significativa con la adición del tanino 1 y 2 (t t-1 =5,69, t t-2 =15,92; p<0,05) indicando que hay un incremento de la protección frente a la oxidación con la adición de estos 2 taninos. 60 Potencial antoxidante de los taninos Fig. 2. Incremento del PAT (potencial antioxidante) tras la adición de diferentes taninos a un extracto antociánico de uva en solución hidroalcohólica Medición del efecto de copigmentación. El fenómeno de copigmentación es un proceso debido a asociaciones moleculares entre pigmentos coloreados y otros normalmente no coloreados, el cual origina que ambos pigmentos exhiban un mayor intensidad colorante a la esperada por su concentración. Este efecto provoca cambios en las reacciones de oxidación y formación de compuestos poliméricos. Los vinos tintos con mayor número de copigmentos, presentan ya no sólo más color desde los estadios más tempranos de la vinificación, sino que parece que sirven de vía en la transformación de estas moléculas hacia formas más estables de color (5).

6 Turbidez (ntu) % Efecto % copigmentación Fig. 3. Incremento del % de color debido a copigmentación tras la adición de diferentes taninos a un extracto antociánico de uva en solución hidroalcohólica. La fig. 3 muestra los resultados de copigmentación de los taninos en solución modelo en presencia de un extracto natural de uva. Tanto el tanino 1 como el tanino2 presentan efectos de copigmentación significativamente diferentes respecto al testigo, (t t-1 =4,74 y t t-2 =5,50 respectivamente; p<0,05), no mostrando ese efecto el tanino 3. Medición de la reactividad de los taninos frente al acetaldehído. El acetaldehído se ha postulado en numerosas ocasiones como una molécula intermediaria en las reacciones de transformación, donde estructuras fenólicas coloreadas sencillas evolucionan hacia moléculas más complejas. Este acetaldehído en los vinos puede provenir bien de los agentes fermentativos, o bien de procesos oxidativos. La adición de este compuesto a soluciones modelo con taninos, incrementa la polimerización de los compuestos proantocianicos (15, 16). En este caso, para determinar la eficacia de esta unión frente al acetaldehído, se ideó una prueba sencilla basada en saturar una solución de tanino con acetaldehído, y ver el incremento de turbidez de la solución en el tiempo. Este incremento de turbidez, a concentración estable de tanino, es proporcional al tamaño del pigmento generado, y por tanto a su polimerización o reactividad frente al acetaldehído Reactividad frente al Acetaldehido Tanino 1 Tanino 2 Tanino 3 Fig. 4. Incremento de la turbidez originada por diferentes taninos proantociánicos en presencia de acetaldehído en solución hidroalcohólica.

7 En este caso tanto el tanino 2 como el 3 fueron significativamente diferentes al tanino 1 (t 1-2 =18,84 y t 1-3 =18,74; p<0,01) mostrando una elevada reacción frente al acetaldehído. El análisis de un mayor número de taninos de diferentes orígenes mostró que sólo algunos de los taninos de origen proantociánico presentó algún tipo de reactividad frente, mientras que ninguno de los taninos hidrolizables, mostraron este efecto (datos no mostrados). Resumen taninos testados. Los análisis desarrollados muestran que tenemos 3 taninos bien diferenciados en cuanto a los cuatro efectos cuantificados: Tanino 1 Tanino 2 Tanino 3 Efecto Kamikaze *** * * Efecto antioxidante ** ** * Efecto copigmentación ** ** * Efecto estabilización * *** *** ***efecto elevado (p<0,01), ** efecto moderado (p<0,05),* efecto leve (p=n.s.) La suma de estos cuatro efectos nos proporciona una visión cuantificable del efecto teórico que deberían tener estos 3 taninos sobre la protección del color. Estos 3 taninos fueron empleados a las dosis enológicas en vinificaciones por duplicado en uvas tempranillo de la D.O Rioja Vinificaciones Tras la fermentación maloláctica, todos los vinos presentaron parámetros analíticos similares (tabla 1), certificando la correcta distribución de la uva gracias al sistema de llenado por gravedad: Acidez total (g/l ac. Tart.) 4,76 4,48 4,53 4,57 Ácido D-glucónico (g/l) nd nd nd nd Ácido L-láctico (g/l) 1,76 1,84 1,88 1,83 Ácido L-málico (g/l) 0,20 <0,10 <0,10 0,20 Azúcares reductores (g/l) <1,50 <1,50 <1,50 <1,50 Grado alcohólico (% Vol) 13,79 13,64 13,55 13,71 ph 3,74 3,78 3,78 3,72 Sulfuroso libre (mg/l) <12 <12 <12 <12 Sulfuroso total (mg/l) Tabla 1. Datos analíticos del mosto de entrada y de los vinos resultantes tras la FML Los vinos tratados con taninos (fig.5) presentaron una IC netamente superior tras 9 meses embotellados con diferencias significativas en los 3 casos ( t t-1 =6,87, t t-2 =7,86 y t t-3 =9,32; p<0,05). Un aspecto importante es que esta ganancia de color se ha fraguado

8 a nivel de protección, observando cómo mientras la IC del vino testigo cae más del 50% desde la fermentación alcohólica, los vinos tratados con tanino cayeron en torno un 30%. Este efecto no es visible en tiempos cortos, sino que aparece sobre todo después de la FML, y se acentúa durante la conservación de los vinos. A nivel de copigmentación, las mayores diferencias se observan en las primeras fases, aumentando este parámetro con el empleo de los 3 taninos, aunque la variabilidad de los datos no nos posibilite ir más allá de esta mera observación. Durante la conservación tanto los porcentajes de color polimérico, como los índices de polimerización, se incrementan en mayor medida en los vinos tratados con taninos. 14 Evolución intensidad de color 50% Evolución % color polimérico % 30% 6 20% % 0 Nov.07 Ene.08 Oct.08 0% Nov.07 Ene.08 Oct.08 50% 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% Evolución % color copigmentado Nov.07 Ene.08 Oct.08 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 Evolución índice de polimerización Nov.07 Ene.08 Oct.08 Fig.5. Evolución de los parámetros fenólicos y cromáticos de los vinos.. Este color polimérico teóricamente está constituido por todas aquellas asociaciones resistentes a la decoloración por SO2, como por ejemplo formas generadas por condensación mediada por acetaldehído, o aductos de cicloadición, donde el acetaldehído y el material fenólico endógeno de las uvas estarían involucrados en su formación. Aunque el efecto más visible sobre el color de este vino viene determinado por los taninos 2 y 1, los 3 taninos resultaron efectivos, indicando que los 4 factores, copigmentación, reactividad frente al acetaldehído, efecto Kamikaze y la protección

9 frente a la oxidación participan como ejes activos en las vías de protección de la materia colorante. Conclusión El empleo de taninos se presenta en enología, sobre todo en situaciones de maceraciones cortas, como una suma de efectos beneficiosos, donde la calidad cromática de los vinos resulta mejorada. El empleo en este caso de taninos con efectos enológicos diferentes, significó alcanzar el mismo objetivo, mayor intensidad colorante tras el embotellado, pudiendo concluir que las acciones derivadas del empleo de los taninos, en numerosas ocasiones provienen de la acción sinérgica de varios efectos diferentes. La reactividad frente al acetaldehído, la capacidad de actuar como copigmentos, la acción protectora o Kamikaze y la acción antioxidante, son fenómenos cuantificables y que posibilitan a largo plazo proteger la caída de la materia colorante de los vinos tintos. El vino objetivo a obtener, condicionará la elección del tipo de tanino y su momento de aplicación. Referencias bibliográficas 1. Nicolas Vivas et Nathalie Saint-Cricq de Gaulejac. Incidence de différents tanins œnologiques sur la formation de trouble d origine protéique dans les vins blancs. Revue des Œnologues n B. Marquette, Florent Dumeau, Marie-Laure Murat, Freddy Daviaud. Mise en évidence de l'inhibition de l'activité laccase de Botrytis cinerea par l'utilisation de tanins en vinification Revue des œnologues vol.:30, 109 pàg.: J.-L. Puech, F. Feuillat, and J. R. Mosedale. The Tannins of Oak Heartwood: Structure, Properties, and Their Influence on Wine Flavor. Am. J. Enol. Vitic. 50:4: Cavin S., Romanelli A., Fabre S. Application de la mesure du pouvoir réducteur du vin par colorimètrie. Revue des OEnologues, Ann E. Hagerman, Ken M. Riedl, G. Alexander Jones, Kara N. Sovik, Nicole T. Ritchard, Paul W. Hartzfeld, and Thomas L. Riechel. High Molecular Weight Plant Polyphenolics (Tannins) as Biological Antioxidants. J. Agric. Food Chem., 46 (5), 1887Ŕ Roger Boulton. The Copigmentation of Anthocyanins and Its Role in the Color of Red Wine: A Critical Review. Am. J. Enol. Vitic. 52:2: A.B. Bautista-Ortína, J.I. Fernández-Fernándezb, J.M. López-Rocaa and E. Gómez-Plaza. The effects of enological practices in anthocyanins, phenolic compounds and wine colour and their dependence on grape characteristics. Journal of Food Composition and Analysis Vol, 20, Issue 7,

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