25OH Vitamina D Total ELISA

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1 en Leer por complete este protocolo antes de su uso. 25OH Vitamina D Total ELISA I. USO PREVISTO Ensayo inmunoenzimático para la medición cuantitativa in vitro de 25-hydroxyVitamina D2 y D3 (25OH-D2 y 25OH-D3) en suero. II. IFORMACIÓ GEERAL A. ombre propietario: DIAsource 25OH Vitamina D Total ELISA Kit B. Catalogue numero: KAP97 : 96 tests C. Fabricado por: DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2, B-348 Louvain-la-euve, Belgium. Para asistencia técnica o información de pedido contactarse: Tel : +32 () Fax : +32 () III. ATECEDETES CLÍICOS La Vitamina D es el término genérico utilizado para designar la Vitamina D2 o ergocalciferol y Vitamina D3 o colecalciferol. La Vitamina D3 humana se produce de manera natural cuando la piel se expone a los rayos solares ultravioletas. En el hígado principalmente, la Vitamina D es metabolizada a 25-HidroxiVitaminaa D3 (25OH D3) la cual es la principal forma de Vitamina D circulante en el cuerpo. El 25OH D3 es un precursor para otros metabolitos de Vitamina D y también tiene una actividad limitada por si misma. El derivado mas activo es la,25-hidroxivitaminaa D3, producida en el riñón (o placenta) por -hidroxilación de 25OH D3. La Vitamina 25OH D3 estimula la absorción intestinal tanto del calcio y el fosforo así como la reabsorción ósea y la mineralización. La Vitamina 25OH D3 puede también ser activada en otros tejidos responsables por el transporte de calcio (placenta, riñón, glándula mamaria ) y glándulas endocrinas (glándulas paratiroideas, células beta ) La Vitamina D3 y la Vitamina D2 están también disponibles por ingestión mediante la alimentación o suplementos dietarios. Como la Vitamina D2 es metabolizada de manera similar a Vitamina D3, ambas contribuyen al estado general de Vitamina D en un individuo. Esta es la razón por la cual es muy importante medir ambas formas de 25OH Vitamina D igual para un correcto diagnostico de deficiencia de Vitamina D como factor de riesgo importante para en los resultados de raquitismo, osteomalacia, osteoporosis senil, cáncer y embarazo. La medición de ambas formas de 25OH Vitamina D es también requerida para determina la causa de concentraciones séricas anormales de suero en pacientes. Se ha demostrado que la intoxicación con Vitamina D causa daños renales y tisulares.

2 IV. Reagents Reactivos Microplaca con 96 Mab anti 25OH Vit. D2 y D3 Calibrador : matriz biológica con gentamicina y proclin Calibradores -5 en suero de caballo con gentamicina y proclin COTROL Controles = 2 En suero humano con proclin IC Tampón de Incubación con caseína y proclin COJ Conjugado concentrado 25OH Vit D HRP PRICIPIOS DEL MÉTODO El kit DIAsource 25OH Vitamina D Total ELISA es un Ensayo Inmunosorbente Unido a Enzima en microplaca. Durante un primer paso de incubación de 2 horas, a temperatura ambiente, la 25OH Vitamina D Total (D2 y D3) presentes en los calibradores, controles y muestras es disociada de las proteínas de unión séricas para fijar en los sitios de unión de un anticuerpo monoclonal específico. Después de paso de lavado, una cantidad fija de 25OH Vitamina D-marcada con biotina en presencia de peroxidasa de rábano picante (HRP), compite con la 25OH Vitamina D2 y 25OH Vitamina D3 que no se encuentra marcada. Después de 3 minutos de incubación a temperatura ambiente la microplaca es lavada para detener la reacción de competencia. La solución Cromogénica (TMB) es adiciona e incubada durante 5 minutos. La reacción es detenida con la adición de la Solución de Parada y la microplaca es luego leída a la longitud de onda apropiada. La cantidad de sustrato invertido es determinado colorimétricamente por medición de la absorbancia, la cual es inversamente proporcional a la concentración de 25OH Vitamina D Total ELISA (D2 y D3) de las muestras que son determinadas por interpolación de dosis desde la curva de calibración. V. RECTIVOS PROVISTOS HRP concentrado COJ Tampón de con caseína y proclin WASH SOL Solución de lavado (TRIS-HCl) CHROM TMB Solución cromogénica TMB (Tetrametilbenzidina) STOP SOL Solución de parada 96 Kit Test 96 Kit Código Colour Pruebas color Code Reconstitución Reconstitution 96 pozos Azul 5 viales 2 viales 2 ml.4 ml Amarillo Adicionar 2 ml Amarillo Adicionar ml Plateado Adicionar ml Verde Azul.2 ml Amarillo 3 ml ml Rojo Café 2 ml Café Diluir x con Diluir 2 x con Diluir 2 x con (usar un agitador magnético). 2 ml HCl.5 ota: Usar el calibrador para dilución de muestras con valores mayores al calibrador mas alto. o hay material de referencia disponible VI. SUMIISTROS O PROPORCIOADOS El siguiente material es necesario, pero no se proporciona dentro del kit:. Agua destilada 2. Pipetas de 5 ul, 5 ul, 2 ul, y ml (se recomienda el uso de pipetas de precisión con puntas desechables de plástico) 3. Mezclador Vortex 4. Agitador magnético 5 Agitador horizontal de microplacas (3 a 7 rpm) 6. Lavadora para microplacas 7. Lector de microplacas para 45 y 65 nm (lectura monocromática) VI. VII. REAGET PREPARATIO A. Calibrador : Reconstituir el calibrador con 2 ml de B. Calibradores - 5: Reconstituir los calibradores -5 con ml de agua destilada C. Controles: Reconstituir los controles con ml de. D. Solución de trabajo HRP:! La solución de trabajo HRP debe prepararse absolutamente en los 5 minutos justo después de las primeras 2 horas del paso de incubación sea iniciado (cf X.B.5) Prepare un volumen adecuado de solución de trabajo HRP por mezcla del concentrado HRP con el de acuerdo al numero de tiras a utilizar, como se indica en la tabla: por ejemplo para 6 tiras (48 pozos): µl de concentrado y 5 µl de HRP Concentrado para ml de. Use un vortex para homogenizar. Dejar que el de trabajo HRP a temperatura ambiente y evitar la exposición directa a la luz solar o usar viales de vidrio oscuro para esta preparación. o. de tiras Volumen concentrado ( µl ) Volumen HRP concentrado ( µl ) Volumen de ( ml ) E. Solución de Trabajo Lavado: Preparar una volumen adecuado de Solución de Trabajo Lavado adicionando 99 volúmenes de a volumen de Solución de Lavado (2x). Usar agitador magnético para homogenizar. Descartar la solución de trabajo de lavado que no se utilice al final del día. VIII. ALMACEAMIETO Y FECHAS DE EXPIRACIO DE REACTIVOS Antes de la apertura o de su reconstitución, todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de vencimiento indicada en la etiqueta del vial, siempre y cuando se mantenga bajo una temperatura de 2 a 8 C. Después de la reconstitución, los calibradores y controles son estables durante una semana a una temperatura de 2 a 8 C. Para períodos más largos de almacenamiento, las alícuotas deben realizarse y mantenerse a una temperatura de -2 C para un máximo de 3 meses. Evite realizar continuas etapas de congelación y descongelación. La solución de lavado recién preparada debe utilizarse el mismo día. Las alteraciones en la apariencia física de los reactivos del kit pueden indicar inestabilidad o deterioro. IX. RECOLECCIO Y PREPARACIO DE MUESTRAS - Este kit es adecuado para muestras de suero. - El suero debe mantenerse a una temperatura de 2-8 C. - Si la prueba no se ejecuta dentro de las 24 horas, se recomienda almacenar las alícuotas a -2 C. - Evite etapas posteriores de congelación y de descongelación.

3 X. PROCEDIMIETO A. otas sobre manipulación o utilice el kit o los componentes después de la fecha de caducidad. o mezcle materiales de diferentes lotes. Permita que todos los reactivos alcancen temperatura ambiente antes de su uso. Mezcle bien todos los reactivos y muestras agitándolas suavemente. Realice pruebas de calibradores, controles y muestras por duplicado. Se recomienda la alineación vertical. Utilice un recipiente de plástico limpio para preparar la solución de lavado. Para evitar la contaminación cruzada, use boquillas de pipeta desechables para la adición de cada reactivo y de muestra. Para la dispensación de la Solución cromogénica y la Solución de Parada evite el uso de pipetas con partes metálicas. Las pipetas de alta precisión o equipo automático de pipeteado mejorarán la precisión. Respete los tiempos de incubación. Para evitar derivaciones, el tiempo entre el pipeteado del primer calibrador de la primera y la última muestra debe limitarse al tiempo mencionado en la sección XIII parágrafo E. (Retardo). Prepare una curva de calibración para cada prueba, no utilice los datos de pruebas anteriores. Dispense la solución Cromogénica dentro de los 5 minutos después del lavado de la microplaca. Durante la incubación con Solución cromogénica, evite la exposición a la luz directa del sol sobre la microplaca. B. Procedimiento. Seleccione el número requerido de tiras para la corrida. Las tiras que no se vayan a usar deben ser guardadas en la bolsa con el desecante y almacenado a 2-8 C. 2. Asegure las tiras dentro de un marco de apoyo 3. Pipetear 5 µl de cada calibrador, Control y Muestra dentro de los pozos apropiados. 4. Pipetear 5 µl de Tampón de Incubación dentro de todos los pozos. 5. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente, en un agitador de microplaca (3 a 7 rpm). Prepare la solución de trabajo de HRP una vez la incubación vaya iniciar (dentro de 5 minutos) 6. Aspirar el líquido de cada pozo 7. Lavar la placa 3 veces así: dispensando.4 ml de Solución de Lavado dentro de cada pozo aspirando el contenido de cada pozo 8. Pipetear 2 µl de la solución de trabajo de HRP dentro de cada pozo. Incubar la microplaca durante 3 minutos a temperatura ambiente, en un agitador de placa (3 a 7 rpm) 9. Aspirar el líquido de cada pozo.. Lavar la placa 3 veces así: dispensando.4 ml de Solución de Lavado dentro de cada pozo aspirando el contenido de cada pozo. Pipetear µl de Solución Cromogénica dentro de cada pozo en 5 minutos siguiendo el paso de lavado. 2. Incubar la microplaca durante 5 minutos a temperatura ambiente, en un agitador de placar (3 a 7 rpm), evitar la exposición a la luz solar directa. 3. Pipetear µl de Solución de Parada dentro de cada pozo. 4. Leer las absorbancias a 45 nm (filtro de referencia 63 nm o 65 nm) en hora y calcular los resultados como se describe en la sección XI. XI. CULO DE RESULTADOS XII. IFORMACIÓ TÍPICA Los siguientes datos tienen solamente fines ilustrativos y no deben ser usados en lugar de una curva real de calibración en tiempo real. 25OH-EASIA Calibrador ota: ng/ml = 2.5 pmol/ml ng/ml ng/ml 25 ng/ml 55 ng/ml ng/ml 8 ng/ml Unidades XIII. XIII. REDIMIETO Y LIMITACIOES A. Limite de detección Se analizaron 2 calibradores cero junto con un grupo de otros calibradores. El limite de detección, definido como la concentración aparente dos desviaciones por debajo del promedio de OD en la unión cero, fue de.5 ng/ml. B. Especificidad Los porcentajes de reacción cruzada estimados mediante la comparación de la concentración producida con un 5% de inhibición se presentan en la siguiente tabla: 25OH-Vitamina D 3 25OH-Vitamina D 2,25(OH) 2-Vitamina.D 3,25(OH) 2-Vitamina.D 2 Vitamina D3 Vitamina D2 24,25(OH)2-Vitamina.D3 25,26(OH)2- Vitamina D3 3-epi-25 hidroxi Vitamina D3 Componente Reactividad cruzada (%) % 83% 5% <.2% <.2% <.2% % % <.2% El rendimiento del ensayo no se ve afectada por la hemólisis (5 g / L de hemoglobina probado), bilirrubinemia (,5 g / L de bilirrubina probado) o triglicéridos (5 g / L a prueba). C. Precisión Muestra A B ITRA-ESAYO <X> ± SD 27.4 ± ±.2 C.V Muestra A B SD : Desviación Estándar; CV: Coeficiente de Variación ITER- ESAYO <X> ± SD 26.3 ± ±.9 C.V Leer la placa a 45 nm contra el filtro de referencia configurados 65 nm (o 63 nm). 2. Calcular la media de las determinaciones por duplicado. 3. Calcular cada calibrador, control y muestra: D. Exactitud PRUEBA DE RECUPERACIÓ OD (Calibrador, Control o Muestra) B/B (%) x OD (Calibrador Zero) 4. Usando ya sea papel lineal o semi-logarítmico, trace los valores B/B(%) para cada punto de calibración en función de la concentración IGF de cada punto de calibración. Rechace valores anómalos evidentes. 5. También se pueden utilizar métodos asistidos por ordenador para la construcción de la curva de calibración. En caso de utilizar procesamiento automático de resultados, se recomienda una curva de función logística de 4- parámetros. 6. Mediante la interpolación de los valores B/B(%) de la muestra, determine las concentraciones de IGF de las muestras de la curva de calibración. 25OH-Vit.D 3 Adicionada OH-Vit.D 2 Adicionada

4 Dilución de muestra / /2 /4 /8 /6 /32 Concentració n teórica PRUEBA DE DILUCIÓ Concentración medida XVII. BIBLIOGRAFÍA. ZERWEKH J.E. (28) Blood biomarkers of Vitamina D status. Am. J. Clin. utr., 87(suppl):87S-9S. 2. HOLICK M.F. (26) Resurrection of Vitamina D deficiency and rickets. J. Clin. Invest., 6: HEAEY R.P. (2) Vitamina D: how much do we need, and how much is too much. Osteoporos. Int., : / /2 /4 /8 /6 Muestra Muestra TIMEPO DE RETARDO E. Retardo de tiempo entre el calibrador anterior y el dispensado de la muestra Como se indica a continuación, los resultados de prueba siguen siendo precisos, incluso cuando el incubación es dispensado y 2 minutos después que los calibradores han sido adicionados dentro los pozos. ' ' 2' XIV. COTROL DE IDAD ITERO Si los resultados obtenidos para el Control y/o Control 2 no se encuentran dentro del intervalo de valores especificado en la etiqueta del vial, los resultados no pueden ser utilizados a menos que se cuente con una explicación satisfactoria de la discrepancia. Si se desea, cada laboratorio puede realizar sus propios grupos de muestras de control, el cual debe mantenerse congelada en alícuota. Los controles que contienen azida pueden interferir con la reacción enzimática y no pueden ser usados. Los criterios de aceptación para la diferencia entre los resultados de muestras en duplicado deben basarse en las Buenas prácticas de laboratorio. Se recomienda que los controles sean analizados rutinariamente como muestras desconocidas con el fin de medir la variabilidad. Los resultados del ensayo deben ser revisados con tablas de control de la calidad. Es bueno comprobar visualmente el ajuste de la curva seleccionada por el computador. XV. ITERVALOS DE REFERECIA 4. DAWSO-HUGHES B., HEAEY R.P., HOLICK M.F., LIPS P., MEUIER P.J. (997) Prevalence of Vitamina D insufficiency in an adult normal population. Osteoporos. Int., 7: BISCHOFF-FERRARI H.A., GIOVAUCCI E., WILLETT W.C., DIETRICH T., DAWSO-HUGHES B. (26) Estimation of optimal serum concentrations of 25-hydroxyVitamina D for multiple health outcomes. Am. J. Clin. utr., 84: HOLICK M.F(24) Sunlight and Vitamina D for bone health and prevention of autoimmune diseases, cancers and cardiovascular disease. Am. J. Clin. utr., 8:6788S-688S. 7. HEAEY R.P. (2) Defining deficiency of Vitamina D. Clinical Laboratory International, October 2, vol.34 : HOLICK M.F. (27) Vitamina D deficiency.. Engl. J. Med., 357: TAHA. M., VIETH R.(2) The problem of an optimal target level for 25-HydroxyVitamina D, the test for Vitamina D nutritional status. Clinical Laboratory International, ovember 2, vol.34 : 28-3 XVIII. RESUME DEL PROTOCOLO Calibradores (-6) Controles, Muestra, tampón de incubación IBRADORES (µl) 5-5 MUESTRAS(S) COTROLES(µl) La ingesta en la dieta, raza, estación y edad son factores conocidos que afectan los niveles normales de 25OH.Vit.D3 Cada laboratorio debe establecer sus propios rangos basados en su población local. Literatura reciente ha sugerido los siguientes rangos para la clasificación del estatus de 25OH.Vit.D3: Deficiencia: - ng/ml; Insuficiencia: -3 ng/ml; Suficiencia: 3 a 5 ng/ml; Toxicidad: >5 ng/ml. XVI. PRECAUCIOES Y ADVERTECIAS Seguridad Únicamente para uso de diagnostico in vitro. Los componentes de sangre humana incluidos en este kit han sido evaluados por métodos aprobados Europeos y/o aprobados por FDA y fueron encontrados como negativos para HBsAg, anti - VHC, anti-vih- y 2. ingún método conocido puede ofrecer una completa seguridad de que los derivados de sangre humana no transmitan hepatitis, sida u otras infecciones. Por lo tanto, la manipulación de los reactivos, suero o plasma especímenes deben estar de acuerdo con los procedimientos de seguridad local. Todos los productos de origen animal y sus derivados han sido recolectados de animales sanos. Los componentes bovinos proceden de países donde no se ha reportado la presencia de BSE. Sin embargo, los componentes que contienen sustancias animales deben ser tratados como potencialmente contagiosos. Evite cualquier contacto de reactivos con la piel. La solución de detención contiene HCl. En caso de contacto con ésta, lave con abundante agua. o fume, beba, coma o aplique cosméticos en la zona de análisis. o pipetear con la boca. Utilice ropa de protección y guantes desechables. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación a 4 rpm. Aspirar los contenidos de cada pozo. Lavar 3 times con 4 µl de Solución de Lavada y aspirar. Conjugado de trabajo HRP 2 2 Incubar durante 3 minutos a temperatura ambiente con agitación a 4 rpm. Aspirar los contenidos de cada pozo. Lavar 3 times con 4 µl de Solución de Lavada y aspirar.. Solución cromogénica Incubar durante5 min a temperatura ambiente en agitación continua. Solución de parada Realice la lectura en un lector de microplacas Registre la absorbancia de cada pocillo a 45 nm (contra 63 o 65 nm) DIAsource Catalogo o. : KAP 97 P.I. umero : 7547/en Revisión o. : 283/ Fecha de revisión:

5 .I. úmero: 7 Revisión o Símbolos utilizados Consultar las instrucciones de uso Temperatura de almacenamiento Usar por código de lote umero de catalogo umero de Control Dispositivo medico para uso In Vitro Fabricante Contenido suficiente para <n> ensayos WASH SOL Solución de lavado concentrada Calibrador cero Calibrador # COTROL Ag 25I Ab 25I Ag 25I Ab 25I IC ACETOITRILE SERUM DIL SPE DIL ATISERUM IMMUOADSORBET DIL REC SOL PEG Control # Trazador Trazador Trazador concentrado Trazador concentrado Tubos Tampón de incubación Acetonitrila Suero Diluyente de muestra Tampón de dilución Antisuero Immunoadsorbente Diluyente de calibrador Solución de reconstitución Polietilen glicol EXTR SOL ELU SOL GEL PRE SOL Solución de Extracción Solución de Elución Cartuchos de silica Bond Elut Solución de Pre-tratamiento EUTR SOL Solución de neutralización TRACEUR Ab HRP Ag HRP Ab HRP Ag HRP COJ Tampón trazador Microplaca HRP Conjugado HRP Conjugado HRP Conjugado concentrado HRP Conjugado concentrado Tampón CHROM TMB CHROM TMB SUB STOP SOL IC SER Ab AP SUB PPP BIOT COJ AVID HRP ASS Ab BIOT Ab SAV HRP SB 2nd Ab ACID DIST TRAY PMSF STRIP SUB CART WASH SOL TMB Cromogénico concentrado TMB Cromogénico solución Tampón de sustrato Solución de parada Suero de Incubación Tampón AP Conjugado Substrato PPP Conjugado concentrado Biotina Avidina HRP concentrado Tampón de ensayo Conjugado de Biotina Anticuerpo específico Estreptavidina HRP concentrada Unión no específica 2do Anticuerpo Tampón de acidificación Distribuidor Gradilla de Incubación Solución PMSF Proteger de la luz Tira Substrato Cartucho Tampón de lavado