Valentina Vélez Henao

Transcripción

1 Efecto de la suplementación con antioxidantes y el sistema de empaque sobre las características espermáticas del semen equino criopreservado y su relación con la criotolerancia espermática. Valentina Vélez Henao Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias Medellín, Colombia 2016

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3 Efecto de la suplementación con antioxidantes y el sistema de empaque sobre las características espermáticas del semen equino criopreservado y su relación con la criotolerancia espermática. Valentina Vélez Henao Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de: Magister en Biotecnología Director: M.Sc. Andrés Pareja López Codirector: Ph.D. Delmis Omar Camargo Rodríguez Línea de Investigación: Universidad Nacional - Biotecnología Animal Universidad CES Biología Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias Medellín, Colombia 2016

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5 Evolucionar constituye una infidelidad, a los demás, al pasado, a las antiguas opiniones de uno mismo. Cada día debería de tener al menos una infidelidad esencial, una traición necesaria, se trataría de un acto optimista, esperanzador, garantizaría la fe en el futuro, una afirmación de que las cosas pueden ser no solo diferentes, sino mejores. Jonás Trueba Todas las canciones hablan de mí (2010).

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7 Agradecimientos Esta investigación fue financiada bajo el marco de la Convocatoria para Proyectos de Carácter Innovador en Investigación y Transferencia de Tecnología del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, presentado y ejecutado por la Universidad CES y la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. Agradecimientos especiales al personal de los laboratorios de biotecnología en salud de la Universidad CES, sede Sabaneta, al Laboratorio de Procesamiento de Semen San Pablo de la Universidad Nacional de Colombia, sede Rionegro, y al Laboratorio de Citometría de Flujo de la Sede de Investigación Universitaria (SIU), quienes se encargaron de mantener las condiciones técnicas y logísticas necesarias para que las instalaciones del laboratorio, equipos y suministros se encontrarán siempre a nuestra disposición. Agradezco el apoyo incondicional y permanente en este proceso de formación a mis amigos y asesores; los profesores Andrés Pareja López y Omar Camargo Rodríguez quienes acompañaron la generación y ejecución del presente trabajo con su asesoría y dirección.

8 Contenido Lista de abreviaturas y unidades... IX Lista de tablas... 1 OBJETIVOS... 3 Objetivo General... 3 Objetivos Específicos Capítulo I Resumen Abstract Introducción Marco teórico Metodología Animales Recolección de la muestra seminal Protocolo de criopreservacion Protocolo de descongelación Evaluación de movilidad Funcionalidad de la membrana plasmática (TEST HIPO-OSMOTICO HOS) Reacción acrosómica Integridad de Ácido Desoxirribonucleico (ADN) Potencial de membrana mitocondrial Viabilidad espermática Análisis estadístico Resultados Evaluación de movilidad Funcionalidad de membrana plasmática (Test Hipo-Osmótico) Reacción acrosómica Integridad de ácido desoxirribonucleico (ADN) Potencial de membrana mitocondrial Viabilidad espermática Discusión Conclusiones y recomendaciones Conclusiones Recomendaciones Bibliografía... 33

9 Lista de abreviaturas y unidades Abreviatura Término ADN Ácido desoxirribunocleico ALH Amplitud lateral de la cabeza ARN Ácido ribonucleico AOX Antioxidante ATP BCF Adenosín trifosfato Frecuencia de batido de la cola CASA Computer Assisted Sperm Analyzer Conc Concentración DE Desviación estándar ERO Especie reactiva de oxígeno HOS Test hiposmótico IP Yoduro de propidio LIN Índice de linealidad PBS Buffer fosfato Q Quercetina Rep Reproductor Spm Espermatozoide Tp Tamaño de pajilla VAP Velocidad media VCL Velocidad curvilínea VSL Velocidad rectilínea Ve Vitamina E % Mov % espermatozoides móviles % Pro % espermatozoides progresivos Unidades Término g Gravedades g Gramo gl Grados de libertad M Molar mg Miligramo ml Mililitro mm Milimolar % Porcentaje C Grados Celsius C/min Celsius por minuto

10 Unidades Término µl Microlitro µm/seg. Micrómetros por segundo µm Micrómetro µm Micromolar MOsmol Miliosmolar

11 Lista de tablas Tabla 1. Tratamientos suplementados Tabla 2. Variables sensibles al efecto del antioxidante Tabla 3. Variables que fueron sensibles a la interacción del antioxidante y sus niveles de concentración Tabla 4. Variables que fueron sensibles a la interacción del tamaño de la pajilla y el antioxidante Tabla 5. Variables que fueron sensibles a la interacción del tamaño de la pajilla y el antioxidante Tabla 6. Porcentaje de actividad mitocondrial según concentraciones de Quercetina Tabla 7. Comparaciones múltiples entre tratamientos y su respectivo control

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13 OBJETIVOS Objetivo General Evaluar el efecto de la suplementación con antioxidantes y el sistema de empaque sobre las características espermáticas generales del semen equino criopreservado y la respuesta individual a la criotolerancia. Objetivos Específicos - Estudiar el efecto de los antioxidantes quercetina y vitamina E sobre las características del semen equino sometido a criopreservación. - Evaluar el efecto del sistema de empaque sobre los parámetros seminales de semen equino criopreservado. - Determinar si existe relación entre la suplementación con antioxidantes y el sistema de empaque con la criotolerancia espermática.

14 4 1. Capítulo I. EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON ANTIOXIDANTES Y EL SISTEMA DE EMPAQUE SOBRE LAS CARACTERÍSTICAS ESPERMÁTICAS DEL SEMEN EQUINO CRIOPRESERVADO Y SU RELACIÓN CON LA CRIOTOLERANCIA ESPERMÁTICA. 1.1 Resumen Objetivo: Evaluar el efecto de la suplementación con antioxidantes y el sistema de empaque sobre las características espermáticas del semen equino criopreservado y la respuesta a la variabilidad individual a la criotolerancia. Materiales y métodos: El semen colectado de 10 caballos con fertilidad comprobada, se obtuvo de diferentes criaderos del departamento de Antioquia, fue criopreservado empleando dos sistemas de empaque (pajilla 0.5 ml y pajilla 0.25 ml) y dos antioxidantes (Vitamina E y Quercetina), con niveles de concentración 20µM, 200 µm, 2000 µm para Vitamina E y 2.5 µm, 25 µm, 250 µm para Vitamina E. Post-descongelación se realizó la evaluación de los parámetros de calidad seminal: evaluación de movilidad por medio del software CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer), funcionalidad de membrana plasmática según test hipo-osmótico HOS, los parámetros de reacción acrosomal, actividad de membrana mitocondrial, integridad de ADN y porcentaje de vitalidad fueron evaluados por medio de citometría de flujo. Para el análisis estadístico fueron realizados análisis de varianza (ANOVA) con estructura factorial y utilizando la prueba de Dunnett, se realizaron comparaciones múltiples de medias. Resultados: El efecto del antioxidante fue representativo (P<0.05) para los parámetros de movilidad VAP (µm/s), VSL (µm/s), VCL (µm/s), ALH (µm/s) y Linearidad (%). Las variables que fueron sensibles a la interacción del antioxidante y sus niveles de concentración fueron % de actividad mitocondrial y % de vitalidad (P<0.05). Particularmente para % de actividad

15 5 mitocondrial se observó un efecto altamente significativo del antioxidante Quercetina (P= ) en la concentración 2.5 µm. Adicionalmente, se evidenció el efecto del tratamiento: tamaño de pajilla: 0.5 ml, antioxidante: Quercetina, concentración: 2.5 µm, cuando fue comparado con su respectivo control para las variables: Velocidad rectilínea (VSL), % Spm Progresivos, Amplitud lateral de la cabeza (ALH) (P<0.05). Conclusiones: Si bien la suplementación con antioxidantes y el sistema de empaque mejoran algunos parámetros espermáticos post-descongelación, no optimizan de manera contundente el protocolo de congelación del semen equino, y no es posible establecer su relación directa con la criotolerancia. El fenómeno de criotolerancia espermática parece estar determinado por la respuesta individual de los reproductores a los procesos de superenfriamiento y congelación. Palabras clave: Criopreservación, Equinos, Semen, Antioxidantes, Sistema de empaque. 1.2 Abstract Objective: This study evaluated the effects of antioxidant supplementation and packaging system on stallion cryopreserved sperm characteristics and cryotolerance individual variability. Materials and Methods: Ten ejaculate samples from fertile horses in different farms from the Antioquia department (Colombia), were collected and assessed for semen traits. Each sample was cryopreserved using two packaging systems (straw 0.5 ml and straw 0.25 ml) and two different antioxidants (vitamin E and Quercetin) with concentration levels of 20 µm, 200 µm, 2000 µm for Vitamin E and 2.5 µm, 25 µm, 250 µm for Vitamin E. Post-thaw evaluation of semen quality parameters was performed: mobility were assessed through CASA software (Computer Assisted Sperm Analyzer), plasma membrane functionality were assessed according hypo-osmotic test HOS; acrosome reaction parameters, mitochondrial membrane activity, DNA integrity and vitality percentage were assessed by flow cytometry. For statistical analyzes and multiple means comparison, variance analysis (ANOVA) with factorial structure and Dunnett's test were performed. Results: The antioxidant effect was representative (P <0.05) for mobility parameters VAP (µm/s), VSL (µm/s), VCL (µm/s), ALH (µm/s) and Linearity (%). Percentage of mitochondrial activity and vitality percentage were sensitive to the interaction of the antioxidant and its concentration levels (P <0.05). Highly significant effect of antioxidant Quercetin (P = ) on mitochondrial activity percentage was observed, particularly at 2.5 µm concentration. Additionally, for this specific treatment: 0.5 ml straw size and antioxidant

16 6 Quercetin at 2.5 µm concentration, effect was observed when compared with its respective control for variables: Velocity average path (VAP), Speed Progressive Velocity straight line (VSL),% Mobile sperm,% Progressives sperm, Velocity curvilinear (VCL), lateral amplitude of head (ALH) (P <0.05). Conclusions: Even though antioxidant supplementation and packaging system, improve some post-thawing sperm parameters, they do not optimize conclusively stallion semen freezing protocol, and it is not possible to establish a direct relationship between them and cryotolerance. Supplementation with antioxidants and different packaging systems did not decisively improve the process of equine semen freezing. Sperm cryotolerance phenomenon seems to be determined by the stallion individual response to the supercooling and freezing processes. Keywords: Cryopreservation, Equine, Stallion, Semen, Antioxidants, Packing System.

17 7 1.3 Introducción En Colombia actualmente, los esquemas reproductivos de los criaderos de equinos se basan en los procedimientos de monta natural e inseminación artificial (AI) con semen fresco o refrigerado. Su aplicación intensiva se debe a la facilidad del manejo en campo debido a la optimización de tiempo y esfuerzo de trabajo, la explotación permanente de reproductores con características genéticas favorables, el control sobre la calidad de las características espermáticas, así como la reducción de la probabilidad de introducir enfermedades durante el manejo reproductivo (1,2). Según la Encuesta Nacional Agropecuaria ENA-2014, en Colombia, la actividad pecuaria de equinos presenta una variación -2.1% con relación a años anteriores. En los años 2012, 2013, y 2014 se contabilizaba un inventario equino de , , cabezas, respectivamente. Estos inventarios han disminuido en comparación con especies mulares y asnales los cuales registran un aumento del 11,1 % y 87,1%, respectivamente, entre los años 2013 y (3) El subsector productivo equino juega un papel importante en el país, tanto para su crecimiento económico como para su desarrollo cultural toda vez que la mayoría de su distribución geográfica y dinámica poblacional se asocia con la economía primaria (agricultura) establecida, principalmente, en la región andina, en donde los equinos son usados como herramienta de trabajo, indispensable para las regiones más apartadas y topográficamente difíciles. Lo anteriormente expuesto justifica emprender esfuerzos encaminados al mejoramiento de los procesos productivos y concretamente en los reproductivos orientados al desarrollo y mantenimiento de las líneas reproductivas criollas. Actualmente, en general, el manejo reproductivo se basa principalmente en la monta natural y en una población menor pero creciente, se viene usando biotecnologías reproductivas como la inseminación artificial (IA) con semen fresco, refrigerado y/o criopreservado y la transferencia de embriones, todo ello con el objetivo de incrementar el número de crías de ejemplares con características genéticas de alto valor comercial. (5) Actualmente, entre el 30 y 45% de las inseminaciones alrededor del mundo se llevan a cabo con semen refrigerado (colectado, procesado y refrigerado para ser usado en un las 24h siguientes) alcanzando tasas de preñez de entre 50 y 60%. Estos resultados de fertilidad son similares a los obtenidos en la inseminación artificial con semen fresco (colecta e inseminación en máximo 1h), el cual es utilizado por un 50 a 60% de los criadores que inseminan y alcanza una tasa de preñez de entre 65 y 70% por ciclo reproductivo. Las

18 8 inseminaciones artificiales realizadas con semen congelado (criopreservado en nitrógeno líquido y descongelado para inseminar) comprenden entre el 5 y 10 % de las inseminaciones y alcanza una tasa de preñez entre el 40 y 50 % o menos, lo cual es un poco más bajo en comparación al semen fresco y refrigerado (6). La inseminación con semen congelado/descongelado se traduce en los criaderos en menores índices de concepción y dada la mortalidad celular inherente al proceso mismo de criopreservación, se traduce también en un menor número de dosis (comercializables) por eyaculado, de manera que esta metodología aún no es lo suficientemente atractiva ni ampliamente acogida por los criadores de équidos. Por esta razón, las inseminaciones con semen congelado se limitan principalmente al comercio internacional, a la introducción de nuevo material genético para inseminar yeguas puras en los criaderos, muchas veces importado o en los casos de bancos genéticos creados para reproductores que aun siendo fértiles perdieron la habilidad para montar o que siendo tan valosos se estimó necesario criopreservar su germoplasma. Pese a su relativa ineficiencia reproductiva, el semen equino criopreservado presenta ventajas sustanciales sobre el semen fresco o refrigerado entre las cuales se destacan: su facilidad para el transporte a largas distancias (entre países), su conservación viable durante un tiempo prolongado, casi ilimitado (años), el mayor control sanitario, genético y/o productivo que se puede aplicvar sobre los donantes; el autoabastecimiento de genética en los criaderos supliendo la necesidad de disponer de reproductores vivos para preñar la yeguada, la creación de bancos genéticos para razas en peligro de extinción o de individuos sobresalientes, la propagación de líneas que se encuentren en circunstancias desfavorables (brotes epidémicos) y además permite optimizar los procesos de comercialización (importación y exportación) aumentando el tiempo de anaquel del semen equino, lo que ha permitido crear nuevas unidades de negocio dentro de las explotaciones equinas. En la mayoría de protocolos de criopreservación de semen equino, es necesario separar el plasma seminal del paquete celular, para lo cual el semen es sometido a centrifugaciones seriadas, lo cual induce una generación desmedida de especies reactivas de oxigeno (ERO); que terminan afectando la microarquitectura y fisiología espermática de múltiples formas: daño en membranas celulares, ADN, enzimas, receptores y otras proteínas de importancia estructural máxima relacionadas con el citoesqueleto (7), el axonema

19 9 (relacionados con la pérdida de movilidad)(8), o la fusión esperma-oocito, entre otros(9,10). Se ha reportado además, que los espermatozoides equinos son particularmente susceptibles al choque térmico y al enfriamiento, lo cual está directamente relacionado con la naturaleza de sus membranas y la formación de cristales a nivel intracelular y extracelular durante los procesos de congelación/descongelación (11). Adicionalmente, la misma composición de los diluyentes usados durante el proceso de criopreservación, pueden inducir un estrés osmótico y oxidativo, los cuales afectan la mayoría de las organelas celulares, causando una disfunción espermática (12,13). En los últimos años, los protocolos de criopreservación han venido siendo modificados sustancialmente en buscando reducir los daños ocasionados por la criopreservación. Para tal efecto se han desarrollado nuevos y perfeccionado tradicionales sistemas de empaque tales como el Flatpack (14), el Mini-Flatpack (15), los sistemas abiertos (16), las pajillas de 0.25 ml y 0.25ml (17); en esa misma medida, se han optimizado los protocolos de congelación con base en las características conjugadas de las tasas de enfriamiento, los crioprotectores y los diluyentes en ellos usados (11,17 19). Así mismo se ha demostrado la bondad de suplementar los diluyentes de congelación con compuestos con propiedades antioxidantes como es el caso de la Quercetina y Vitamina E (20,21) toda vez que reducen la peroxidación lipídica, el daño en ADN y otras organelas, causados por la acción de los radicales libres inestables. Todas las innovaciones y mejoras introducidas al proceso han permitido mejorar los parámetros de calidad seminal medidos tras la descongelación, sin embargo aún siguen siendo inferiores comparados con los índices obtenidos en semen fresco y refrigerado lo cual significa que es necesario investigar más buscando introducir mejoras adicionales en temas fundamentales y definitivos como la concentración del antioxidante, el sistema de empaque, las tasas de enfriamiento y las tasas de recuperación pos-descongelación con los cuales sea posible implementar un procedimiento de IA exitoso con semen congelado. No obstante los resultados aceptables obtenidos bajo diferentes protocolos de criopreservación son prometedores, se sabe de la existencia de una subpoblación de reproductores cuyos espermatozoides presentan baja criotolerancia y/o mala congelabilidad (22,23), y que en consecuencia tendrían resringido su uso en un programa de IA basado en semen congelado. El caso contrario también se presenta, una subpoblación equina para la cual se reporta una mejor respuesta a la criopreservación y/o

20 10 mayor criotolerancia. Hasta ahora, el criterio de selección aplicado a los potenciales reproductores donantes sde semen congelable en los criaderos se limita a su valor comercial y no por la criotolerancia espermática, que de implementarse de manera paralela potencializaría la creación de bancos genéticos. Una diferencia esencial entre la refrigeración y la congelación es que mientras la gran mayoría de los eyaculados soportan el proceso de refrigeración, la respuesta de los espermatozoides a la congelación es muy variable. Aunque dicha variabilidad se ha reportado hace tiempo en la especie equina (22) las mejoras introducidas en los protocolos de criopreservación no han logrado superar este hecho. Últimamente se han venido postulando diferentes teorías que tratan de explicar la razón a dicha variabilidad individual, reportada también en otras especies. Aquellas relacionadas con las características de la respuesta al estrés oxidativo (24,25) y la composición lipídica de la membrana plasmática de los espermatozoides (26,27), son las que han venido acumulando mayores evidencias para la explicación de dicho fenómeno. Finalmente, es aceptado que para mejorar la eficiencia reproductiva del semen criopreservado es necesario conocer con la mayor exactitud posible los posibles factores extrínsecos e intrínsecos que afectan al individuo donante, identificar los aspectos o factores que condicionan esta variabilidad pues aunque se han señalado muchos aspectos asociados a la variabilidad en la criotolerancia espermática, son escasos los estudios que han abordado dicha problemática en la especie equina. Por esta razón, y dada la importancia económica, social y cultural de los caballos en Colombia, se hace necesario adelantar investigaciones como esta que buscan contribuir a mejorar la congelabilidad de los espermatozoides equinos mediante el estudio del efecto de dos variables de importancia fundamental en el proceso: la presencia de antioxidantes y los sistemas de empaque. 1.4 Marco teórico Durante las últimas décadas, el sector equino ha realizado importantes esfuerzos para potenciar el crecimiento de la industria equina en diferentes escenarios a nivel deportivo, cultural y/o como herramienta de trabajo y transporte. Sin embargo, según el censo pecuario nacional de 2016 realizado por el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), para

21 11 la fecha del censo se evidencia una leve recuperación del inventario equino. Colombia cuenta con reconocimiento internacional por sus especies caballar, mular y asnal usadas en la recreación, el deporte y el trabajo. El Caballo Criollo Colombiano, caracterizado por su sensibilidad, fuerza, brío, velocidad y suavidad es un ejemplar de un fenotipo único, hermoso, elegante, noble, con movimientos bien definidos, permitiéndole a quien lo monta gozar de gran quietud en su andar. También se cuenta con valiosos ejemplares mulares y asnales de labor, los cuales suman una población de cabezas, asentada principalmente en los departamentos de Antioquia (10,61%), Tolima (8,15%), Cundinamarca (7,52%), Córdoba (7,36%), Casanare (5,69%) y Cauca (5,63%), regiones en que se concentra el 45,21% del censo equino nacional. Antioquia particularmente cuenta a la fecha con cabezas. (4). Sin embargo, el gran reto del país es buscar alternativas que optimicen la competitividad con el propósito de fortalecer su participación en el mercado internacional ya que actualmente Colombia no ha sido reconocido como un país productor principal ni tampoco con actividad exportadora representativa. Los principales avances en el mejoramiento de los parámetros productivos, con reconocimiento mundial han sido direccionados a la producción y mejoramiento genético del caballo criollo colombiano(28). Una de las biotecnologías reproductivas que ha hecho avanzar tecnológicamente la reproducción equina ha sido la inseminación artificial (IA) con semen refrigerado, que aplicada rutinariamente en los criaderos, produce resultados de fertilidad y prolificidad similares a los alcanzados con la monta natural (2,29). Su aplicación se ha extendido por su contribución al mejoramiento genético acelerado mediante la utilización intensiva de reproductores con caracteres genéticos de alto valor comercial, la reducción del número de sementales por granja, la reducción del riesgo de introducción de enfermedades a las explotaciones, la facilidad para el manejo reproductivo al reducir el tiempo y el trabajo necesarios, así como un mejor control de la calidad del semen(30). La IA con semen refrigerado se ha desarrollado gracias a la disponibilidad de diluyentes comerciales que permiten la conservación del semen durante periodos variables entre 2 y 7 días, pero el uso de semen equino congelado se limita a la introducción de nuevo material genético de alto valor para inseminar yeguas puras en las granjas de selección, o bien asociados a labores de investigación (6,31,32).

22 12 La criopreservación de semen es una técnica accesoria a la inseminación artificial y la fertilización in vitro y ha jugado un papel bastante importante en los últimos 50 años en el mejoramiento genético en diferentes especies de animales de interés zootécnico. Mediante esta biotecnología se ha logrado realizar mejoramiento genético en rebaños, prevenir y controlar enfermedades, hacer control reproductivo, aprovechar mejor los sementales y obtener un mejor rendimiento económico. No obstante, la manipulación del semen en estos procesos altera el óptimo desempeño de los espermatozoides (33), al punto que la fertilidad del semen criopreservado es comparativamente menor que la del semen fresco causada posiblemente por la susceptibilidad al choque térmico, al enfriamiento y a la composición misma del diluyente; variables que están directamente relacionadas con el estrés osmótico y la formación de cristales durante el proceso de congelación/descongelación, afectando la mayoría de las estructuras y organelas (34,35). De otro lado, las centrifugaciones seriadas y la remoción del plasma seminal, inducen una liberación significativa de especies reactivas de oxígeno (EROs) por parte de los espermatozoides y leucocitos del semen resultando en disfunción espermática (36,37). Particularmente la membrana plasmática de los espermatozoides de los mamíferos es rica en ácidos grasos poli-insaturados, los cuales son muy susceptibles al ataque de las ERO (12,26,36), además, durante los últimos estados de la espermatogénesis, los espermatozoides han descartado la mayoría de su citoplasma perdiendo gran parte del conjunto de defensas enzimáticas que los protegen del daño peroxidativo. Igualmente, la capacidad de reparación del ADN se pierde en los espermatozoides maduros, haciéndolos más vulnerables al daño oxidativo que cualquier célula somática (38). En resumen, las ERO dañan las macromoléculas afectando el componente estructural y funcional de los espermatozoides sobrevivientes, lo cual se ve reflejado en la inestabilidad de la membrana, daño de los receptores de membrana, alteraciones del citoesquelesto, perturbaciones del axonema (el cual es asociado con la pérdida de movilidad), inhibición de la fusión esperma-oocito, y daño nuclear entre otros (8,9,34,39). Por esta razón, la adición de compuestos antioxidantes en los diluyentes para la criopreservación de semen equino se ha utilizado ampliamente ya que puede reducir la peroxidación lipídica, el daño en ADN y demás organelas espermáticas, procurando reducir el daño espermático acumulado hasta el momento de la pos-descongelación (40 42) Las sustancias antioxidantes son capaz de retardar o prevenir la oxidación de moléculas tales como las especies reactivas de oxígenos- ERO. La oxidación es una reacción química

23 13 de transferencia de electrones de una molécula a un agente oxidante. Las reacciones de oxidación pueden producir radicales libres que inician reacciones en cadena con resultados deletéreos para las células(43,44). Los antioxidantes detienen estas reacciones eliminando los intermediarios del radical libre e inhiben otras reacciones de oxidación. Los flavonoides son pigmentos (o metabolitos secundarios) naturales presentes en los vegetales y que protegen al organismo del daño producido por agentes oxidantes, se encuentran en frutas, verduras, semillas y flores, así como en cerveza, vino, té verde, té negro y soja. Contienen en su estructura química un número variable de grupos hidroxilo fenólicos y excelentes propiedades de quelación del hierro y otros metales de transición, lo que les confiere una gran capacidad antioxidante. Por ello, desempeñan un papel esencial en la protección frente a los fenómenos de daño oxidativo. Sus propiedades anti-radicales libres se dirigen fundamentalmente hacia el radical hidroxilo y superóxido, especies altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de peroxidación lipídica(45,46) Dentro de los flavonoides, la quercetina ha sido ampliamente investigada debido a su capacidad para eliminar radicales libres así como sus habilidades quelantes de metales; la presencia de tres grupos hidroxilo hace del compuesto un potencial barredor de radicales libres y / o antioxidante (47). Es el flavonoide más abundante en la dieta. En humanos, particularmente, se ha reportado que la quercetina puede proteger el ADN del estrés oxidativo in vitro, al interactuar con el ADN forma una especie de complejo que no tiene actividad electroquímica y no puede ser reducido (48). La presencia de quercetina durante la congelación mejora la movilidad y capacidad de la zona de unión de los espermatozoides, ya que disminuye el proceso de peroxidación lipídica. El flavonoide quercetina, inhibe la formación del ion superóxido, quelatos de hierro, así como la formación del radical peróxido lipídico (21). De la misma manera, el antioxidante vitamina E o α-tocoferol ha sido usado y estudiado a gran profundidad, es una vitamina liposoluble que ofrece un efecto protector en la membrana plasmática del semen congelado, ayudando así a mantener la actividad metabólica y la viabilidad celular. La vitamina E es conocida por comportarse como inhibidor de la peroxidación lipídica en la membranas biológicas, previniendo el daño oxidativo de semen criopreservado o refrigerado (49,50). A pesar de la suplementación de los diluyentes de criopreservación con compuestos antioxidantes, el daño sufrido por el estrés oxidativo sigue siendo persistente, lo cual ha generado la necesidad de explorar alternativas como el uso de ácidos grasos, para procurar estabilizar la membrana plasmática. En las células espermáticas la composición lipídica de la membrana plasmática juega un rol importante en la determinación de la fluidez de la

24 14 membrana así como la movilidad y viabilidad(12). Los espermatozoides equinos, en particular, contienen un mayor porcentaje de ácidos grasos poliinsaturados n-6 en lugar de n-3. El ácido graso que se presenta en mayor cantidad en la membrana plasmática de la especie equina es el DPA (ácido docosapentaenoico) y sus niveles no cambian durante la congelación y tampoco se relaciona con la disminución de la movilidad, a diferencia del DHA (ácido docosahexaenoico), el cual disminuye luego de la congelación y está positivamente relacionado con la movilidad espermática (51,52). Diferencias en la composición lipídica de la membrana plasmática del espermatozoide ha sido sugerida como el factor clave de la variabilidad presentada respecto a la congelabilidad. En muchas especies de mamíferos, hasta el 60% del total de ácidos grasos son ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) de cadena larga de la serie n-3, lo que les confiere mayor fluidez debido a la presencia de muchos enlaces dobles pero también mayor propoensión a la peroxidación. La composición de ácidos grasos en espermatozoides de porcinos es especialmente interesante, ya que contienen 25% ácido docosapentanoico (C22: 5 n-6; DPA) y 30% de ácido docosahexaenoico (C22: 6 n-3; DHA) y presentan las mismas dificultades que los espermatozoides equinos cuando son sometidos a los procesos de criopreservación/descongelación (35), lo cual permite especular que equilibrar la proporción de ácidos grasos poliinsaturados en la membrana plasmática del espermatozoide podría mejorar la respuesta a la congelabilidad y disminuir así la variabilidad en respuesta al proceso de congelación. Si bien se han descrito varias técnicas para la criopreservación de semen equino, el más utilizado es de congelación en pajillas. En esta técnica se procede inicialmente con una etapa previa de enfriamiento y estabilización y otra posterior de congelación las cuales se han diseñado para minimizar las consecuencias negativas derivadas del proceso de congelación y aumentar la resistencia de los espermatozoides a este proceso(18,53,54). En la actualidad se utilizan una gran variedad de empaques, buscando albergar una cantidad suficiente de espermatozoides y que a su vez permita una distribución homogénea de la temperatura, los diferentes tipos de empaque y las principales ventajas y desventajas de los mismos son: Píldoras: La relación volumen/superficie facilita una mejor distribución de la temperatura, pero su limitado volumen y concentración supone la utilización de un número considerable de ellas para reconstituir una dosis inseminante con suficientes espermatozoides para poder ser utilizados en IA.

25 15 Maxi pajuela: Solo se necesitan una o dos de ellas para reconstituir una dosis inseminante stándar, pero su diseño geométrico no facilita la transmisión de la temperatura y ello supone que las zonas periféricas del envase se ven sometidas a un tiempo más prolongado de exposición a temperaturas extremas de congelación y descongelación. Pajillas de 0.5 ml: De tipo francés o alemán. Permiten una transmisión de la temperatura del exterior al interior aceptable, pero su pequeño volumen dificulta la consecución de una dosis inseminante exitosa. Mini pajillas de 0.25 ml: De tipo americano. Permiten una buena transmisión de la temperatura del exterior al interior, pero su pequeño volumen dificulta aún más la consecución de una dosis inseminante efectiva. Bolsas planas: Contienen una dosis entera y su geometría facilita la congelación y descongelación rápida y homogénea. Presenta dificultades para su almacenamiento en tanques de nitrógeno líquido. En el área de criopreservación de espermatozoides equinos hay poca literatura sobre investigaciones que conduzcan a dilucidar las diferencias que existen entre eyaculados de reproductores denominados de buenos congeladores y malos congeladores. La congelabilidad de los eyaculados parece estar relacionada con características individuales más que con el proceso de criopreservación como tal (55) y por esta razón la capacidad de cada reproductor en producir espermatozoides resistentes al choque térmico tiene diversas explicaciones en las características de su propio eyaculado. Las características particulares de ciertos eyaculados de resistir a la criopreservación mejor que otros permanecen sin dilucidar. Sin embargo, algunos trabajos han vinculado estos aspectos con orígenes genéticos (6,56,57), lo cual explica también porque eyaculados recolectados del mismo macho tienden a mostrar la misma congelabilidad (25,58). A pesar de que se ha notado que puede haber ligeros cambios en la congelabilidad entre eyaculados del mismo macho, se ha postulado que las condiciones de cría junto con la genética, pueden afectar la resistencia al choque térmico. Finalmente, para determinar el efecto de una variable sobre los procedimientos de congelación o determinar el efecto de un reproductor por ejemplo sobre las características del semen pos-descongelación, se deben hacer las evaluaciones seminales de rutina, que

26 16 generalmente incluyen la medición del volumen, el color, el olor, la apariencia, la consistencia, la densidad, el ph, la presencia de impurezas, la concentración y la movilidad, pero estas mediciones no proveen una información confiable sobre la capacidad fertilizante de los espermatozoides, por lo cual, se deben introducir otras evaluaciones como la de la integridad del ADN y del estado del acrosoma, y la funcionalidad de las membranas plasmática y mitocondrial, como un complemento para la determinación indirecta de la calidad espermática. 1.5 Metodología Animales El semen fue obtenido diferentes criaderos del departamento de Antioquia. Se colectaron en total de 10 eyaculados de machos que cumplieran con los criterios de inclusión: entre 2-6 años de edad, kg en peso, fertilidad comprobada y usados de manera rutinaria para inseminación artificial. Las condiciones de manejo de los reproductores fueron las propias de cada criadero, en general, bajo estabulación, alimentados con una dieta a base de forraje picado y heno suplementado con alimento concentrado, sal mineralizada y agua a libre disposición Recolección de la muestra seminal Las muestras de semen fueron recolectadas usando una vagina artificial (53 C) en presencia de una yegua en celo. La vagina artificial posee un filtro que permite la recolección de semen libre de gel. Inmediatamente posterior a la recolección los eyaculados fueron sometidos a las respectivas evaluaciones macroscópica de campo: volumen, color, olor, apariencia, consistencia, densidad, ph, presencia de impurezas para luego, las muestras aptas, ser diluidas en una proporción 2:1 (Semen: Diluyente comercial Kenny). Una vez en el laboratorio de les medía concentración, viabilidad, morfología y movilidad. Las muestras fueron procesadas y evaluadas en el Laboratorio de Biotecnología en Salud de la Universidad CES, sede Sabaneta, el Laboratorio de Reproducción Animal de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, y en el Laboratorio de Citometría de Flujo de la Sede de Investigación Universitaria (SIU) de la Universidad de Antioquia.

27 Protocolo de criopreservación Inicialmente se realiza una centrifugación a 660 x g por 15 min a 20 C de las muestras previamente diluidas. El sobrenadante es eliminado y el pellet re-suspendido con 2ml del diluyente comercial, el cual contiene yema de huevo. Posterior a esta dilución los parámetros de viabilidad, concentración espermática, número total de espermatozoides y movilidad fueron re-evaluados, y solo las muestras de semen que presentaron un mínimo de 70% en movilidad progresiva y un 80 % en morfología normal fueron procesadas. Posteriormente, el diluyente comercial suplementado con yema de huevo y glicerol es adicionado para obtener una concentración final 2 x 10 8 espermatozoides viables/ml. Las muestras de semen diluidas se dividen en 14 alícuotas, 2 control para cada tamaño de pajilla (Sin antioxidantes) y 12 suplementadas con los antioxidantes Vitamina E 2000 µm, 200 µm y 20 µm, Quercetina 250 µm, 25 µm y 2.5 µm. Luego cada tratamiento fue empacado en pajillas de 0.25 ml y 0.5 ml respectivamente (Tabla 1). Después, las muestras fueron sometidas a una curva de enfriamiento/congelación de 3 fases. En la primera fase se dio el enfriamiento de 20 C a 5 C a una tasa de enfriamiento de 0.26 C/min. En la segunda fase se disminuyó la temperatura de las muestras de 5 C a - 90 C a una tasa de enfriamiento de 4.75 C/min por medio de la exposición a vapores de nitrógeno líquido. La última fase consistió en llevar las muestras congeladas directamente al nitrógeno líquido en donde fueron almacenadas. Tabla 1. Tratamientos suplementados ID Tratamiento 1 Ve ml 2000 µm 2 Ve ml 200 µm 3 Ve ml 20 µm 4 Ve- 0.5 ml µm 5 Ve- 0.5 ml 200 µm 6 Ve- 0.5 ml 20 µm 7 Q ml 250 µm 8 Q ml 25 µm 9 Q ml µm 10 Q- 0.5 ml 250 µm 11 Q- 0.5 ml 25 µm 12 Q- 0.5 ml µm 13 Control ml 14 Control ml

28 Protocolo de descongelación La descongelación se realizó en un baño maría a 37 C por 20 segundos. Después de la descongelación, las muestras fueron preparadas para las diferentes evaluaciones que se describen a continuación Evaluación de movilidad Las evaluaciones de movilidad individual post-congelación fueron realizadas por medio del software CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer), referencia IVOS de Hamilton Thorne. Cada tratamiento se evaluó por triplicado en microcélulas leja de 4 pozos de 3 µl cada uno. En cada medición se capturan diferentes campos hasta alcanzar 1500 espermatozoides. Cada evaluación se realiza por un video de 25 cuadros consecutivos por segundo y se determinan 11 para metros de movilidad: Proporción de espermatozoides móviles (expresada en %) Proporción de espermatozoides progresivos (expresada en %) Velocidades (expresada en µm/s): o Velocidad promedio (VAP) o Velocidad rectilínea (VSL) o Velocidad curvilínea (VCL) Progresión (expresada en %), o Linealidad (LIN) o Rectitud del movimiento (STR) o Balanceo (WOB) Desplazamiento lateral de la cabeza espermática (ALH) (se expresa en µm) Frecuencia de golpe cruzado (BCF) (se expresa en Hz) Funcionalidad de la membrana plasmática (Test hiposmótico) De cada tratamiento se toman 50µl de semen y se mezclan con 1ml de solución hipoosmótica (0.49g de citrato de sodio y 0.9g de fructosa en 100ml de 100mOsm/Kg), y luego se llevó a incubación a 37 C por 60 min. Para la evaluación una gota de 10µl es dispuesta en un portaobjetos y cubierto por un cubreobjetos. Bajo un microscopio de contraste de fases se determinan los espermatozoides positivos, que son aquellos que tienen la cola doblada o enrollada.(59,60)

29 Reacción acrosómica Esta evaluación se realizó por medio de citometría de flujo. Esta técnica se basa en el uso de una lectina conjugada con un fluorocromo, PNA (lectina de maní (Arachis hypogaea)), esta se une específicamente a la membrana acrosomal interna de los espermatozoides y es marcada por el fluorocromo FITC (Isotiocianato de fluoresceína) se usó a una concentración de 100 µg/ml. Permite detectar aquellos espermatozoides que tienen su membrana acrosomal dañada, lo cual permite la unión de la lectina a la membrana acrosomal y de igual manera el fluorocromo, al interior del compartimiento acrosomal eventos por lectura. (Szabolcs et al,2002 con modificaciones) (61) Integridad de Ácido Desoxirribonucleico (DNA) La medición de integridad de ADN se realizó por medio de citometría de flujo. Mediante el fluorocromo Naranja de Acridina se mide la suceptibilidad del ADN espermático a la desnaturalización, esto se realiza por cuantificación del cambio cromático fluorescente del verde al rojo. El fluorocromo Naranja de acridina se intercala entre las dobles cadenas de ADN como un monómero y se liga a las cadenas simples del ADN como un agregado. El monomérico emite fluorescencia verde (ADN intacto) mientras que el agregado emite fluorescencia roja (ADN desnaturalizado). Se utilizó a una concentración de eventos por lectura. (Golan et al,1997 con modificaciones)(62) Potencial de membrana mitocondrial La medición del potencial de membrana mitocondrial se realizó por medio de citometría de flujo. Fue utilizado el fluorocromo 3,3-diexyloxacarbocianina iodido (DiOC 6), un compuesto catiónico y lipofílico, cuya acumulación en compartimentos intracelulares depende del potencial transmembrana y es por tanto empleado para marcar mitocondrias, este se incorpora en mitocondrias con elevado potencial de membrana mitocondrial, y percibe cuando la mitocondria padece una pérdida de potencial de membrana, con lo cual se da una pérdida del fluorocromo y consecuentemente una perdida en la fluorescencia, lo cual es detectado por el citómetro. Se utilizó a una concentración 1nM eventos por lectura. (Rottenberg et al,1998 con modificaciones) (63)

30 Viabilidad espermática La viabilidad espermática se realizó por citometría de flujo utilizando el fluorocromo ioduro de propidio (IP), esta técnica se basa en la exclusión del IP en células vivas. La membrana plasmática de las células viables forma una barrera con permeabilidad selectiva entre el contenido intracelular y el medio extracelular. Las células muertas pierden esta propiedad y por lo tanto incorporan el fluorocromo, el cual se intercala entre las bases del ADN y del ARN en una relación de 1 molécula de colorante cada 4 o 5 pares de bases. Una vez unido a los ácidos nucleicos, la fluorescencia del IP se ve incrementada 20 a 30 veces. Se utilizó a una concentración 500ug/ml eventos por lectura. (Szabolcs et al, 2002 con modificaciones) (61) Análisis estadístico Por medio del software libre The R Project for Statistical Computing versión Fueron realizados análisis de varianza con estructura factorial, tomando la concentración como factor anidado, dado que los niveles de concentración para cada antioxidante no son iguales. Se manejan tres niveles de cada antioxidante, pero diferentes dosis entre ellos (aunque corresponden con bajo, medio y alto). Consecuentemente, se considera un modelo con concentración anidada en antioxidante. En la evaluación de los tratamientos (14 tratamientos en total, configurados a partir de una estructura factorial 2x2x3 + 2 controles) y se midieron 16 variables respuesta, estableciendo así, el reproductor en el modelo como factor de bloqueo. La estructura factorial de los tratamientos se organizó de la siguiente manera: - Tamaño de pajilla (tp), con dos niveles: 1 y 2 - Antioxidante (aox), con dos niveles: Vitamina E y Quercetina. - Concentración (conc), con tres niveles diferentes para cada antioxidante. En R, el modelo anidado para la estructura factorial se denota así: variable.respuesta~rep + tp + aox + tp:aox + aox/conc Se realizaron anovas para cada una de las variables respuesta y dos modelos para cada una de ellas: Modelo 1, considerando la estructura factorial (no se incluyen los controles).

31 21 Fuentes de Variación gl Reproductor 9 Tp 1 Aox 1 Tp*Aox 1 Aox / Concentración 4 Error 103 Total 119 Modelo 2, ignorando la estructura factorial (incluyendo los controles) Fuentes de Variación gl Reproductor 9 Tratamiento 13 Error 117 Total 139 Usando el paquete phia se evaluaron efectos simples de la interacción tamaño de pajilla: antioxidante (tp*aox), cuando fue del caso. La significancia del efecto aox/concentración quiere decir que hay efecto de la concentración, es decir, que la respuesta media difiere entre concentraciones. Puesto que los niveles de concentración difieren entre antioxidantes, cuando dicha condición estuvo presente, se realizaron análisis independientes para cada antioxidante. Para ello se particionó la base de datos por tipo de antioxidante (Vitamina E y Quercetina). En tales casos, para cada antioxidante, se corre el siguiente modelo: variable.respuesta~rep + tp*conc Usando la prueba de Dunnett, se realizan comparaciones de cada tratamiento contra el control. 1.6 Resultados El análisis de varianza se aplicó a cada una de las variables respuesta (11 variables pertenecientes a los parámetros de movilidad y 5 variables que evalúan funcionalidad espermática (Host, reacción acrosomal, reacción mitocondrial, integridad de ADN y vitalidad) teniendo en cuenta antioxidante, tamaño de la pajilla, concentración, interacción entre tamaño de pajilla y antioxidante, así como la interacción entre el antioxidante y la concentración.

32 Evaluación de movilidad Se observó de manera trasversal una alta variabilidad por parte de los reproductores para cada una de las variables evaluadas. Aquellas variables que presentaron efectos significativos del antioxidante (p 0,05) se observan en la tabla 2. Los parámetros de movilidad expuestos en la tabla presentaron una mejor respuesta con la suplementación con el antioxidante Vitamina E. Para los demás parámetros de movilidad evaluados no se determinó un efecto del antioxidante. Tabla 2. Variables sensibles al efecto del antioxidante Antioxidante (X ± DE) Variable Valor P Vitamina E Quercetina VAP (µm/s) ± 1.80 a ± 1.80 b VSL (µm/s) ± 1.41 a 40.8 ± 1.41 b VCL (µm/s) ± 4.02 a ± 4.02 b ALH (µm/s) ± ± 0.32 Linearidad (%) ± ± 1.15 Valores mostrados: media ± desviación estándar. Los exponentes a, b indican diferencia estadística significativa VAP: Velocidad media VSL: Velocidad rectilínea. VCL: Velocidad curvilínea. ALH: Amplitud lateral de la cabeza Funcionalidad de membrana plasmática (Test hipoosmótico) No se encontró ningún efecto del antioxidante y tamaño de la pajilla para ninguno de los tratamientos suplementados, sin embargo si se observó un efecto bastante significativo del reproductor (P < 0.05) Reacción acrosómica No se observó efecto del antioxidante y el tamaño de la pajilla, pero si un efecto importante del reproductor (P < 0.05) Integridad de ácido desoxirribonucleico (ADN) No se encontró ningún efecto del antioxidante, ni tampoco del tamaño de la pajilla, pero de igual manera un si un efecto significativo por parte del reproductor (P < 0.05).

33 Potencial de membrana mitocondrial Se encontró efecto del antioxidante Quercetina dependiente de la concentración (P= ), y del reproductor (P < 0.05).no se observó efecto del tamaño de la pajilla. Tabla 3. Tabla 3. Variables que fueron sensibles a la interacción del antioxidante y sus niveles de concentración. Antioxidante (X ± DE) Variable Valor P Vitamina E Quercetina Actividad mitocondrial (%) ± 2.37 a ± 2.37 b Vitalidad (%) ± 1.13 a ± 1.13 b Valores mostrados: media ± desviación estándar. Los exponentes a, b indican diferencia estadística significativa Viabilidad espermática El porcentaje de vitalidad se vio afectado por efecto del antioxidante dependiente de la concentración (Tabla 3) y efecto del reproductor (P < 0.05) pero no se determinó ningún efecto del tamaño de la pajilla. No se presentó efecto directo del tamaño de la pajilla para ninguna de las variables evaluadas, pero si se observó su efecto en la interacción con el antioxidante para el porcentaje de espermatozoides móviles (tabla 4). Tabla 4. Variables que fueron sensibles a la interacción del tamaño de la pajilla y el antioxidante Variable Valor P Interacción Media ± DE Espermatozoides móviles (%) Tp 0.5 ml - Ve ± 0.90 Tp 0.25 ml - Ve ± 0.90 a Tp 0.5 ml - Q ± 0.90 Tp 0.25 ml - Q ± 0.90 b Valores mostrados: media ± desviación estándar. Los exponentes a, b indican diferencia estadística significativa Tp: Tamaño de pajilla Ve: Vitamina E Q: Quercetina

34 24 Posteriormente se realizó un análisis de varianza para las concentraciones de antioxidante, únicamente para aquellas variables que presentaron interacción entre la concentración y el antioxidante (tabla 3), realizando análisis de varianza (ANOVA) para determinar los efectos significativos de la concentración con el fin de determinar el efecto real del antioxidante. Particularmente para el porcentaje de actividad mitocondrial se observó un efecto altamente significativo del antioxidante Quercetina ( ) en comparación con el antioxidante Vitamina E. (Tabla 5). Tabla 5. Variables que fueron sensibles a la interacción del tamaño de la pajilla y el antioxidante. Antioxidante Variable Vitamina E Quercetina Actividad mitocondrial (%) ª b Vitalidad (%) Valores mostrados: media ± desviación estándar. Los exponentes a, b indican diferencia estadística significativa Con base en el resultado anterior del porcentaje de actividad mitocondrial, se realizó una prueba de medias para determinar la concentración a la cual el antioxidante Quercetina presento una diferencia significativa, encontrando que la concentración 2.5 µm tuvo una incidencia mayor en el porcentaje de actividad mitocondrial. Tabla 6. La mayor diferencia entre concentraciones de Quercetina se presentó para 2.5 µm y 250 µm, P = Tabla 6. Porcentaje de actividad mitocondrial según concentraciones de Quercetina Concentración Quercetina Actividad mitocondrial (%) 2.5 µm ± 3.33ª 25 µm ± 3.33ª 250 µm ± 3.33 b Valores mostrados: media ± desviación estándar. Los exponentes a, b indican diferencia estadística significativa Finalmente se realizaron comparaciones múltiples de medias con la prueba de Dunnett, de todos los tratamientos contra su respectivo control, determinando según el valor P si algún tratamiento tuvo diferencias significativas para cada variable evaluada.