ANTIPOLIOMIELÍTICA INACTIVADA, VACUNA

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1 EL TEXTO EN COLOR ROJO HA SIDO MODIFICADO Con fundamento en el numeral de la Norma Oficial Mexicana NOM-001-SSA1-2010, se publica el presente proyecto a efecto de que los interesados, a partir del 1º de mayo y hasta el 30 de junio de 2016, lo analicen, evalúen y envíen sus observaciones o comentarios en idioma español y con el sustento técnico suficiente ante la CPFEUM, sito en Río Rhin número 57, Colonia Cuauhtémoc, código postal 06500, Ciudad de México, Fax: Correo electrónico:. ANTIPOLIOMIELÍTICA INACTIVADA, VACUNA La vacuna antipoliomielítica inactivada es una preparación liquida de poliovirus tipos 1, 2 y 3 producidos en cultivos celulares susceptibles, concentrados, purificados e inactivados por un método validado. FABRICACIÓN El método de producción demostrará que se obtienen de manera consistente vacunas comparables con las vacunas que demostraron su eficacia y seguridad en estudios clínicos. La producción de la vacuna está basada en el sistema de lote semilla viral y cuando se utilizan líneas celulares éstas se manejan de acuerdo a un sistema de banco celular. El virus en la vacuna final no debe ser sometido a más pases a partir del lote de semilla maestra que el número de pases utilizado para preparar la vacuna que en estudios clínicos haya demostrado ser satisfactoria en cuanto a seguridad, eficacia y requerimientos de biocontención. Cada tipo de virus se cultiva de manera independiente en cultivos libres de agentes extraños. El medio de mantenimiento de las células no contendrá proteínas derivadas del suero utilizado para su crecimiento, puede contener rojo de fenol como indicador de ph y concentraciones muy bajas de antibióticos excepto penicilina y sus derivados. LOTE SEMILLA DE TRABAJO El lote de semilla viral de cada uno de los tres tipos de poliovirus estará identificado por registros históricos en donde se indica el origen de la cepa y su manipulación subsecuente. Las cepas de poliovirus utilizadas en producción serán identificadas a través de registros históricos, los cuales incluirán la información del origen de las cepas y su subsecuente manipulación (por ejemplo, silvestres, atenuadas o manipuladas por tecnología de ADN recombinante). La identidad de las cepas será determinada por pruebas de infectividad y métodos inmunológicos. Adicionalmente, las cepas Sabin y las cepas derivadas por tecnología de ADN recombinante se identificarán por análisis de secuencia de nucleótidos. Cada lote semilla viral maestro y de trabajo se preparan a partir de materiales que cumplen con los siguientes requisitos: Pruebas en cultivo de riñón de conejo (solo para semillas virales maestras derivadas de cepas que han sido previamente propagadas en cultivos primarios de riñón de mono). Las semillas maestras que han sido propagadas en cultivos primarios de riñón de mono se evaluarán para demostrar que estén libres de virus Herpes B y de otros virus. Se evaluará una muestra de por lo menos 10 ml de virus semilla. El suero utilizado en el medio de cultivo estará libre de inhibidores de virus B utilizando virus herpes simple como indicador. La mezcla de líquido a evaluar se inocula en recipientes de cultivo, de tal forma que la dilución en el medio de cultivo no exceda de 1:4. El área de la monocapa celular será de por lo menos de 3 cm 2 /ml del inóculo. Por lo menos un recipiente de cultivo permanece sin inocular y sirve como control. Los cultivos inoculados y los cultivos control son incubados a temperatura de 37 C y se observan a intervalos apropiados por un periodo de por lo menos dos semanas. Para que la prueba sea válida, no más del 20 % de los recipientes de cultivo serán desechados por razones no específicas al final del periodo de prueba. La sensibilidad de cada lote de células de riñón de conejo es demostrada por reto con una cantidad validada de virus herpes simple. Pruebas agentes adventicios y para secuencias de SV40 Agentes adventicios Los lotes semilla virales maestro y de trabajo utilizados para producción de vacunas estarán libres de virus adventicios. Una muestra de por lo menos 40 ml de cada virus es evaluada. La muestra es neutralizada utilizando suero antipoliovirus tipo específico de alto título. Las muestras se prueban en cultivos primarios de células de riñón de Cercopithecus sp o células que han demostrado ser igual de susceptibles a virus SV40, asimismo se utilizarán células diploides. Los cultivos celulares son incubados a 37 C y observados por dos semanas. Al final del periodo de observación, por lo menos se realiza un subcultivo del líquido sobrenadante en el mismo sistema de cultivo celular. La muestra se inocula de tal forma que la dilución del líquido del sobrenadante en el medio de cultivo no exceda la dilución 1:4. El área de la monocapa celular será por lo menos de 3 cm 2 /ml del inóculo. Por lo menos un recipiente de cultivo celular permanece sin inocular y funciona como un control. Las células inoculadas con el líquido sobrenadante y los cultivos control son incubados a 37 C y observados a intervalos regulares por un periodo adicional de 2 semanas. Los lote semilla virales maestro y de trabajo pasan la prueba si no hay evidencia de la presencia de agentes adventicios. Para que la prueba sea válida, no más del 20 % de los recipientes de cultivo han sido desechados por razones no específicas al final del periodo de observación. Se han desarrollado nuevos 1

2 métodos moleculares con amplias capacidades de detección de agentes adventicios. Estos métodos incluyen: Amplificación de ácidos nucléicos (NAT o pruebas de ácidos nucléicos) para familias completas de virus, con análisis de los amplicones por hibridación, secuenciación o espectrometría de masas; NAT con iniciadores aleatorios (primers) seguida del análisis de amplicones, sobre microarreglos de oligonucleótidos de secuencias virales conservadas o substracción digital de secuencias expresadas; y secuenciación de alto rendimiento. Estos métodos pueden utilizarse en el futuro para complementar los métodos existentes o como alternativa a los métodos in vivo e in vitro, después de su validación y con la aprobación de la Autoridad Regulatoria Nacional. El riesgo teórico de la presencia de agentes adventicios humanos, de simios, bovinos o porcinos en los lotes semilla, deriva de la utilización de suero bovino o tripsina porcina. Si es necesario, virus como poliomavirus bovino, parvovirus porcino o circovirus porcino pueden ser investigados utilizando ensayos específicos, como NAT. Detección de secuencias de SV40 Se demostrará que la semilla viral maestra está libre de secuencias de SV40, utilizando ensayos específicos validados. Se recomienda utilizar regiones genómicas separadas de SV40 para amplificación y el uso de una región como prueba presuntiva, la confirmación se tendrá que realizar en muestras repetidamente positivas. La sensibilidad de los ensayos de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) será establecida para la región genómica utilizada. Pruebas adicionales en las semillas de las cepas Sabin y otras cepas atenuadas derivadas por tecnología de ADN recombinante Si se utilizan cepas Sabin para la producción de vacuna, se utilizan las semillas maestras establecidas y es necesario realizar pruebas adicionales. En los lotes semilla maestro utilizados para la producción de vacuna se monitorean las características virales moleculares (por ejemplo utilizando MAPREC = análisis de mutantes mediante la utilización de enzimas de restricción y PCR) y las semillas cumplirán con las especificaciones establecidas para los lotes semilla virales descritos en la monografía de vacuna Antipoliomielítica oral (esterilidad, concentración viral e identidad). Para las semillas maestras de cepas atenuadas derivadas de tecnología de ADN recombinante, las pruebas incluyen: caracterización completa del genoma por secuenciación de nucleótidos o técnicas de secuenciación masiva y demostración de estabilidad genética y fenotípica de pases bajo condiciones de producción. Estas pruebas se validan y son aprobadas por la Autoridad Regulatoria Nacional. La necesidad de pruebas de neurovirulencia en estas semillas estará científicamente justificada. Cuando se utilicen nuevos virus para las semillas de trabajo, incluyendo cepas Sabin y otras cepas atenuadas derivadas de tecnologías de ADN recombinante, por lo menos tres cosechas monovalentes consecutivas son analizadas para monitorear las características moleculares virales, por ejemplo a través de MAPREC. PROPAGACIÓN Y COSECHA INDIVIDUAL SUSTRATO PARA LA PROPAGACIÓN DEL VIRUS Para la propagación del virus se pueden utilizar células diploides humanas o una línea celular continua. Los bancos celulares de origen animal cumplen con los requisitos establecidos en la monografía Caracterización de los sustratos celulares para la fabricación de productos biológicos. El número máximo de pases para preparar el banco celular de trabajo a partir del banco celular maestro y el número de pases de los cultivos de producción es establecido por el fabricante y aprobado por Autoridad Regulatoria Nacional. IDENTIDAD. Las pruebas de identidad utilizadas incluyen pruebas bioquímicas (por ejemplo, análisis de isoenzimas), marcadores citogenéticos, técnicas moleculares como secuenciación de ADN, entre otras. Medio de cultivo. Si se utiliza suero para la propagación de las células, se evalúa para demostrar que está libre de contaminación bacteriana, fúngica y por micoplasmas. Asimismo estará libre de virus infecciosos. Adicionalmente, el suero es examinado para evaluar la presencia de bacteriófagos y endotoxinas. La concentración de proteínas séricas es reducida por enjuague de los cultivos celulares con medio libre de suero y/o purificación de las cosechas virales. No debe utilizarse suero de origen humano en ninguna etapa de la producción. La tripsina bovina o porcina usada para preparar los cultivos celulares estará libre de bacterias, hongos, micoplasmas y virus infecciosos. Los métodos serán aprobados por la Autoridad Regulatoria Nacional. El suero y la tripsina procederán de áreas libres de encefalopatías espongiformes. El banco celular y los cultivos celulares subsecuentes se manejan bajo condiciones asépticas y en un área exclusiva en la que no se manejen otros virus o células. CULTIVOS CONTROL Cuando se utilizan en la producción células diploides humanas o líneas celulares continuas, una fracción equivalente de por lo menos el 5 % del total o 500 ml de la suspensión celular, o 100 millones de células al nivel de pase empleadas para los cultivos de producción de vacuna, son preparados como cultivo control. Cuando se utiliza tecnología de biorreactor, se determinará el tamaño y el tratamiento de la muestra celular a examinar, previo acuerdo con la Autoridad Regulatoria Nacional. 2

3 PRUEBAS PARA LOS CULTIVOS CELULARES CONTROL. MPB Para que la prueba sea válida no más del 20 % de los cultivos celulares control deben de haber sido desechados por razones no específicas. Al final del periodo de observación, los cultivos celulares control son examinados para buscar evidencia de degeneración causada por agentes adventicios. Si se demuestra la existencia de los mismos, los cultivos no son utilizados en la producción de vacuna. IDENTIDAD. Al nivel de producción, las células control serán identificadas por métodos como: pruebas bioquímicas (por ejemplo, análisis de isoenzimas), pruebas inmunológicas, pruebas citogenéticas (por ejemplo marcadores cromosomales) y pruebas para marcadores genéticos (por ejemplo ADN fingerprinting (huella de ADN) o secuenciación. HEMADSORCIÓN. MPB Al final del periodo de observación, por lo menos el 25 % de los controles celulares es evaluado para búsqueda de virus hemadsorbentes. Si las células han sido almacenadas, la duración del almacenamiento no excederá de 7 días y la temperatura de almacenamiento permanecerá entre 2 y 8 C. DETECCIÓN DE OTROS AGENTES ADVENTICIOS EN LOS LÍQUIDOS SOBRENADANTES. MPB Se analizan 10 ml de cada mezcla de líquido sobrenadante de cada grupo de cultivos control. La dilución de la muestra en el medio de cultivo no será mayor de 1:4. El área de la monocapa celular es por lo menos de 3 cm 2 /ml del inóculo. Para que la prueba sea válida, no más del 20 % de los recipientes de cultivo han sido desechados por razones inespecíficas al final del periodo de prueba. Si se presentan efectos citopáticos o agentes adventicios en alguno de los cultivos, la cosecha de virus producida a partir de los lotes de cultivos de las cuales las células control fueron tomadas será desechada. Algunos virus pueden ser detectados por ensayos moleculares específicos validados, como los NAT. Si las pruebas no se evalúan inmediatamente, las muestras se mantienen a temperaturas de menos 60 C o inferiores a ésta. CULTIVOS CELULARES PARA LA FABRICACIÓN El día de inoculación de los cultivos con la semilla viral de trabajo, cada recipiente de cultivo de células o una muestra de los mismos, es examinado visualmente para búsqueda de degeneración causada por agentes infecciosos. Si existe evidencia de la presencia de los mismos, el cultivo celular no se utilizará en la fabricación. COSECHAS INDIVIDUALES Después de la inoculación de virus en las células, las condiciones de los cultivos serán las que han sido estandarizadas. Las muestras para control son tomadas inmediatamente durante la cosecha. Cada cosecha individual se somete a las siguientes pruebas: IDENTIDAD. Identificar el virus de la cosecha individual como poliovirus tipo 1, 2 o 3 por neutralización en cultivos celulares, utilizando anticuerpos específicos o por métodos moleculares validados. ESTERILIDAD. MGA Cumple los requisitos. Utilizar 10 ml por cada medio de cultivo para demostrar la ausencia de bacterias, hongos y micoplasmas. CONCENTRACIÓN DE VIRUS. Determinar la concentración de virus en cada cosecha individual por titulación del virus infeccioso en cultivos celulares. COSECHA MONOVALENTE PURIFICADA Varias cosechas individuales se pueden mezclar y concentrar para formar la cosecha monovalente que se someterá a purificación antes del proceso de inactivación por un método validado. Los métodos de purificación y concentración incluyen clarificación por filtración, concentración por ultrafiltración, paso a través de columnas de filtración en gel, así como el uso de columnas de intercambio iónico. Las cosechas monovalentes purificadas se someten a las siguientes pruebas: IDENTIDAD. Se pueden identificar por neutralización, utilizando antisueros específicos o por métodos moleculares. La identidad de cada uno de los tres serotipos puede determinarse por análisis de secuencia de nucleótidos o por una técnica molecular disponible. CONCENTRACIÓN DE VIRUS INFECCIOSO. La concentración viral de cada mezcla de cosechas monovalentes purificadas es determinada por titulación de virus infeccioso en cultivo celular. ANTÍGENO D. El contenido de antígeno D de cada mezcla monovalente purificada es determinado por un método inmunoquímico validado utilizando una vacuna de referencia calibrada contra el estándar internacional de la OMS. PROTEÍNA. MPB No debe contener más de 0.1 µg de proteína por unidad de antígeno D de poliovirus o debe de estar entre los límites aprobados para el producto en particular. ADN RESIDUAL. Cuando se utilizan líneas celulares continuas en la producción, el método de purificación deberá ser eficiente en reducir el ADN celular a 10 ng o menos por dosis humana. La prueba puede ser omitida como evaluación de rutina, 3

4 cuando el proceso ha sido validado y aprobado por la Autoridad Regulatoria Nacional. FILTRACION ANTES DE LA INACTIVACIÓN. Cada cosecha monovalente purificada debe filtrarse antes de la inactivación. La inactivación es iniciada lo más pronto posible y en ningún caso después de 72 h posteriores a la filtración. Es preferible iniciar la inactivación dentro de las 24 h posteriores a la filtración. Una muestra de la cosecha monovalente purificada y filtrada es resguardada y se determina el título de virus infeccioso (tiempo de inicio de la cinética de inactivación). PRUEBAS ADICIONALES PARA COSECHAS MONOVALENTES PURIFICADAS PRODUCIDAS CON SEMILLAS SABIN U OTRAS SEMILLAS DERIVADAS DE TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE Las condiciones de producción serán validadas y se utilizarán pruebas in vivo y pruebas in vitro para asegurar que el fenotipo atenuado de las cepas Sabin en las cosechas monovalentes se mantiene. Pruebas como MAPREC, son aplicadas a la proporción de cosechas monovalentes producidas cada año con el objetivo de asegurar la consistencia de producción. Adicionalmente, es importante que a intervalos acordados con la Autoridad Regulatoria Nacional, las cosechas monovalentes sean evaluadas para asegurar que las condiciones de producción permanecen satisfactorias. La consistencia es evaluada con técnicas moleculares (pruebas in vitro) para determinar las características virales y con las pruebas de neurovirulencia (pruebas in vivo). Las pruebas moleculares para cepas derivadas utilizando tecnología ADN recombinante, pueden incluir caracterización completa del genoma por secuenciación de nucleótidos o secuenciación masiva. Estas pruebas serán validadas utilizando estándares apropiados. PRUEBAS PARA MONITOREAR LAS CARACTERISTICAS MOLECULARES VIRALES (CONSISTENCIA). Pruebas como MAPREC se utilizan para determinar la consistencia molecular de la producción de cosechas monovalentes purificadas. Los resultados de la prueba de MAPREC son expresados como proporciones relativas con el estándar internacional tipo específico para análisis de poliovirus (Sabin). La variación aceptable del contenido de mutantes de lote a lote será acordada con la Autoridad Regulatoria Nacional. Para el tipo 3 (472-C) una cosecha monovalente purificada será rechazada si el nivel de mutaciones es más del 1.0 % cuando se compara contra el estándar internacional. Los límites para los tipos 1 y 2 serán aprobados por la Autoridad Regulatoria Nacional. Los límites de mutaciones obtenidos por fabricantes quienes han implementado las pruebas para los tipos 1 y 2 han sido menores del 2 % para el tipo 1 (para la suma de las mutaciones 480A, 525C) y 1.5 % para Sabin tipo 2 (481 G). NEUROVIRULENCIA. MPB Cumple con la prueba. COSECHAS MONOVALENTES PURIFICADAS INACTIVADAS El virus de las cosechas monovalentes purificadas y filtradas es inactivado por un procedimiento aprobado por la Autoridad Regulatoria Nacional. Antes de la inactivación la concentración de la cosecha monovalente purificada se ajusta basada en la concentración de virus infeccioso o en el contenido de antígeno D conforme lo determinado en los estudios de validación. El método de inactivación debe demostrar resultados consistentes para la producción de vacunas aceptables, uno de los agentes inactivantes más utilizado ha sido el formaldehído. La eficiencia de la inactivación es monitoreada por determinaciones periódicas del título viral. El periodo de inactivación excederá el tiempo necesario para reducir el título del virus a cantidades no detectadas con un factor de por lo menos 2. Una segunda filtración es realizada durante el proceso de inactivación. Este paso se efectúa después de que el título ha caído por debajo de los niveles detectables, pero antes de que la primera muestra para pruebas de seguridad sea tomada. La cinética de la inactivación viral es establecida por cada fabricante. La consistencia del proceso de inactivación debe ser monitoreada. Para este propósito, el título viral y el contenido de antígeno D de cada cosecha monovalente purificada y filtrada antes, durante y al final de la inactivación serán determinados. Los registros de consistencia (inactivación efectiva y cinética de inactivación) son establecidos para la producción de por lo menos cinco lotes consecutivos. Si esto no se cumple, un análisis de causa-raíz es realizado y será necesario evaluar cinco lotes adicionales. EVALUACIÓN DE INACTIVACIÓN. Dos muestras de un volumen equivalente de por los menos dosis humanas, son tomadas de cada mezcla monovalente purificada e inactivada. Una muestra se toma al final del periodo de inactivación y la otra en no más de transcurrido el 75 % del proceso de inactivación. Después de eliminar o neutralizar el agente inactivante, las muestras son evaluadas para demostrar la ausencia de poliovirus infeccioso, por inoculación en cultivo celular. Las células de riñón de mono de algunas especies, como las del género Macaca, Cercopithecus y Papio sp., parecen ser más sensibles que otras. Si otros sistemas de cultivo son utilizados, incluyendo líneas celulares continuas (por ejemplo L20B), deben mostrar la misma sensibilidad a poliovirus inoculando con virus parcialmente inactivados con formaldehido. Cuando se utilizan cultivos primarios de riñón de mono, las dos muestras son inoculadas en cultivos derivados de diferentes lotes de células. La dilución de la 4

5 muestra en el medio de cultivo no excederá de 1:4 y de manera que exista una relación de al menos 3 cm 2 de área de cultivo celular por mililitro de inóculo. Uno o más cultivos de cada lote permanecerán como control sin inocular utilizando el mismo medio de cultivo. El formaldehído en las muestras de vacuna para su inoculación en cultivo celular es generalmente neutralizado al tiempo de muestreo, por adición de bisulfito. Usualmente, las muestras son subsecuentemente dializadas. Es posible realizar pruebas en cultivos celulares de material no dializado. Sin embargo, es frecuente encontrar toxicidad para las células, aún con dilución 1:4, lo que disminuye la sensibilidad. La prueba será repetida sobre material dializado. El contenido del antígeno D después de la diálisis será determinado para verificar si hubo pérdida durante el proceso de diálisis. Los cultivos celulares serán observados por lo menos durante tres semanas. No menos de dos subcultivos deberán realizarse de cada recipiente original de cultivo celular. El primer subcultivo de cada recipiente se realiza antes del cambio de medio de cultivo, y el segundo subcultivo es realizado al final del periodo de observación. Los subcultivos son observados por lo menos durante 2 semanas. Si se detecta poliovirus infeccioso en las muestras tomadas al final del periodo de inactivación, o en las muestras tomadas en no más de transcurrido el 75 % del proceso de inactivación, la cosecha monovalente purificada inactivada no debe ser utilizada. El aislamiento de poliovirus vivo de una cosecha monovalente purificada inactivada, es considerado como falla de consistencia en la fabricación y será necesario la revisión del proceso de fabricación y su revalidación. Si se utilizan cultivos primarios de riñón de mono en la prueba, éstos pueden contener agentes adventicios que interfieren con los resultados. Al final del periodo de observación, los cultivos celulares utilizados para detección de virus vivo residual son retados con una cantidad validada de virus vivo Sabin del mismo tipo que el de la cosecha monovalente purificada inactivada. Si se utilizan líneas celulares continuas en la prueba, la capacidad para detectar virus infeccioso es verificada para cada prueba, por la introducción de un control positivo al comienzo de cada prueba. Los controles positivos son inoculados con baja cantidad de virus cercana a los límites de detección del método. Alternativamente, si no se utilizan controles positivos, se debe de realizar una prueba de reto, como la descrita cuando se utilizan cultivos primarios de riñón de mono. Es recomendable que los cultivos celulares utilizados en las pruebas para verificar la presencia de virus residual activo sean observados por el más largo periodo de tiempo que sea posible, en virtud que los virus que han sido expuestos al formaldehído requieren periodos más largos de tiempo para producir efecto citopático en comparación con los virus no tratados. Asimismo se verificará que el suero adicionado al medio de cultivo en una concentración de más del 50 %, no contenga inhibidores para los tres poliovirus. Es importante que a los cultivos celulares utilizados no se les realice cambio de medio de cultivo antes de 5 a 7 días posteriores a su inoculación. ESTERILIDAD. MGA Cumple los requisitos ANTÍGENO D. Se pueden utilizar métodos inmunoquímicos validados utilizando una referencia calibrada contra el estándar internacional. Cumple con los límites establecidos. GRANEL TRIVALENTE Se prepara directamente a partir de mezclas de cosechas monovalentes inactivadas de poliovirus humanos tipo 1, 2 y 3 para alcanzar un contenido de antígeno D establecido. Sólo se utilizarán graneles trivalentes que cumplan con los siguientes requisitos: AUSENCIA DE POLIOVIRUS INFECCIOSO. Una muestra de por lo menos ml o, si se prepara vacuna purificada y concentrada, al menos el equivalente a dosis humanas de cada granel trivalente será probada en cultivos celulares. No debe aislarse poliovirus infeccioso. ESTERILIDAD. MGA Cumple los requisitos ANTÍGENO D. Se pueden utilizar métodos inmunoquímicos validados utilizando una referencia calibrada contra el estándar internacional. Cumple con los límites establecidos, demostrados con los estudios clínicos. FORMALDEHÍDO LIBRE RESIDUAL. MPB El contenido de formaldehído libre residual en el granel trivalente deberá cumplir por lo aprobado por la Autoridad Regulatoria Nacional. GRANEL FINAL Se prepara directamente a partir de las cosechas monovalentes inactivadas de poliovirus tipo 1, 2 y 3 o de uno o más graneles trivalentes. Se pueden agregar preservativos, excipientes u otras sustancias. Hasta que se proceda al llenado, la vacuna en granel final se almacenará bajo condiciones que el fabricante ha demostrado que se mantiene la actividad biológica deseada. Solo se utilizará el granel final que cumpla con las siguientes especificaciones: ESTERILIDAD. MGA Cumple los requisitos POTENCIA in vivo. Cuando la consistencia de producción se ha demostrado en un número adecuado de graneles finales, la prueba puede omitirse en acuerdo previo con la Autoridad Regulatoria Nacional. Estas pruebas se realizarán para 5

6 demostrar la comparabilidad de nuevos procesos de fabricación. Para validar la prueba se puede utilizar el estándar internacional de la OMS como vacuna de referencia, o bien una preparación producto-específica que sea trazable a un lote de vacuna que mostró su eficacia en los ensayos clínicos. La prueba se realiza en ratas y consiste en la inyección intramuscular en las extremidades posteriores de ratas, de cuatro diluciones de la vacuna en prueba y de la vacuna de referencia, usando para cada dilución un grupo de no menos de 10 ratas libres de patógenos específicos. El número de animales utilizados será suficiente para permitir el cálculo de potencia con límites al intervalo de confianza del 95 % de confianza en el rango del 25 al 400 %. El número de diluciones y el número de animales usados por dilución puede diferir del especificado, siempre que el esquema propuesto tenga por lo menos la misma sensibilidad en la prueba. Para cada dilución, el peso de los animales no debe de variar en más del 20% de la media del grupo. Un inóculo de 0.5 ml es utilizado por rata. El rango de dosis a evaluar es elegido con base en la dosis respuesta obtenida para cada tipo de poliovirus. Los animales son sangrados después de 20 a 22 días. Los títulos de anticuerpos neutralizantes contra los tres tipos de poliovirus son medidos separadamente usando 100 DICC 50 de las cepas Sabin como virus de reto, se pueden utilizar células Vero o Hep-2c como células indicador, y condiciones de neutralización de 3 h de 35 a 37 C, seguido de 2 a 8 C por 18 h. Los resultados son leídos después de fijar y teñir las células, después de 7 días de incubación a 35 C. Para que el ensayo de anticuerpos sea válido, el título de cada virus de reto estará en el rango de 30 a 300 DICC 50 y el título de anticuerpos neutralizantes del suero control debe estar entre las dos diluciones de su media geométrica. La potencia es calculada por comparación de la proporción de animales que responden a la vacuna de prueba y a la vacuna de referencia por el método de probitas. Para definir un animal que dio respuesta, es necesario establecer un valor de corte en el título de anticuerpos neutralizantes para cada tipo de poliovirus. En virtud de la variación inter-laboratorios no es posible definir un valor de corte que pueda aplicarse a todos los laboratorios. El valor de corte debe establecerse por cada laboratorio con base en una serie mínima de 3 pruebas con la vacuna de referencia. El punto medio de una escala log 2 del mínimo y máximo de la media geométrica de los títulos de la serie de tres o más pruebas es usado como valor de corte. Para cada uno de los tres poliovirus, la potencia de la vacuna no debe ser estadísticamente menor a la de la vacuna de referencia. La prueba es válida si: La DE 50 para la vacuna de prueba y para la vacuna de referencia se encuentra entre la menor y mayor dosis administrada a los animales de prueba. El análisis estadístico no muestra desviaciones significativas de linealidad y paralelismo. Los límites de confianza de la potencia relativa se encuentra entre el 25 y el 400 % de la potencia estimada. ANTIGENO D. Esta prueba puede omitirse en el granel final si se realiza en el producto final. Para la validación cuando se utiliza la técnica de ELISA es necesario verificar que se cumple con los criterios de linealidad y paralelismo. ADYUVANTE. MPB 0120 (Cuando aplique). Cada granel final de la vacuna es evaluado. Esta prueba puede omitirse si se realiza en el producto final. Cuando se utilicen compuestos de aluminio, el contenido no será mayor de 1.25 mg por dosis individual humana. PRESERVATIVO. Se puede utilizar 2-fenoxietanol y cumplirá con los límites que mostraron eficacia y seguridad demostrada. PRODUCTO TERMINADO DESCRIPCIÓN. Es una preparación liquida clara, puede ser incolora o colorida debido a la presencia de un indicador de ph, libre de partículas extrañas en suspensión. IDENTIDAD. Demostrar que la vacuna contiene poliovirus tipos 1, 2 y 3 aplicando un método inmunoquímico como la determinación de antígeno D mediante un ensayo de ELISA. La prueba de potencia puede utilizarse como prueba de identidad. ESTERILIDAD. MGA Cumple los requisitos. INOCUIDAD. MPB Cumple los requisitos. La prueba puede omitirse para la liberación rutinaria de lotes una vez que se demuestra la consistencia de producción y el cumplimiento con las buenas prácticas de fabricación. TITULACIÓN. Determinar el contenido de antígeno D para cada uno de los poliovirus tipos 1, 2 y 3 por un método inmunoquímico, utilizando una vacuna de referencia calibrada contra estándar internacional, la prueba puede omitirse cuando se obtienen resultados satisfactorios en el granel final. Si la utilización de adyuvante interfiere con el ensayo, se realiza un proceso de desorción o tratamiento antes de efectuar la prueba de ELISA. Si esto no es posible, se realizan ensayos in vivo. En general las vacunas antipoliomielíticas inactivadas que han sido fabricadas utilizando cepas silvestres se formulan para contener 40, 8 y 32 unidades de antígeno D o más, por dosis humana para los tipos 1, 2 y 3 respectivamente. Las vacunas con bajo contenido de antígeno D pueden aceptarse si están sustentadas con estudios clínicos. Las vacunas con adyuvantes, o las vacunas producidas a partir de otras semillas virales (por ejemplo, virus Sabin), pueden ser autorizadas con 6

7 diferente composición antigénica, siempre que estén soportadas con ensayos clínicos. ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316 Menos de 5.0 UI por dosis humana. Los niveles serán consistentes con los niveles encontrados como aceptables en lotes de vacuna utilizados en estudios clínicos. ALBUMINA SERICA BOVINA. Si se utiliza suero animal en el crecimiento de los cultivos celulares la cantidad de albúmina sérica bovina será de no más de 50 ng por dosis humana, determinada por un método inmunoquímico adecuado. La prueba puede omitirse si se realiza en el granel trivalente o granel final. NITRÓGENO PROTÉICO. MPB (Lowry) No más de 10 μg de nitrógeno protéico por dosis humana. La prueba puede omitirse para liberación de rutina una vez que se ha demostrado la consistencia de producción. ADYUVANTE Y GRADO DE ADSORCIÓN. MPB 0120 (Cuando aplique). Si se utilizó un adyuvante en la formulación, en cada lote final se determinará su contenido. Cuando se utilizaron compuestos de aluminio, su contenido no será mayor de 1.25 mg por dosis humana. La prueba puede ser omitida en el lote final, si se realizó en el granel trivalente o en el granel final. El grado de adsorción del antígeno a los compuestos de aluminio (hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio hidratado) se llevará a cabo en cada lote final. PRESERVATIVO. En el caso de que se hubiera utilizado un preservativo, su concentración no será mayor de 115 % de lo indicado en la etiqueta y no menor de la cantidad que haya mostrado efectividad y seguridad. FORMALDEHÍDO LIBRE. MPB No más de 0.2 g/l. La prueba puede omitirse si se realiza en el granel trivalente o granel final. ANTIBIÓTICOS RESIDUALES. (Cuando aplique) Si se utilizaron antibióticos durante la fabricación, se determinará el contenido y estará dentro de los límites aprobados por la Autoridad Regulatoria Nacional o de acuerdo a las especificaciones del fabricante. La prueba puede ser omitida como liberación rutinaria de cada lote cuando se ha demostrado consistencia de fabricación. ph. MGA Cumple con la especificación del fabricante. VARIACIÓN DE VOLUMEN. MGA Cumple los requisitos. CONSERVACIÓN. Entre 2 y 8 C. 7