CNSP Blga. Nancy Arróspide Velasco CNSP Blga. Sonia Caridad Gutierrez Gonzáles

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1 EVALUACION DE SENSIBILIDAD Y ES- PECIFICAD DE PRUEBAS INMUNOCROMATOGRAFICAS PARA DIAGNOSTICO DE MALARIA A PARTIR DE MUESTRAS PANEL Ed. Nº 02 Ej. N F.E.: Pág. 1 de 15 EVALUACIÓN DE SENSIBILIDAD Y ESPECIFI- CIDAD DE PRUEBAS INMUNOCROMATOGRA- FICAS PARA EL DIAGNOSTICO DE MALARIA A PARTIR DE MUESTRAS PANEL Sustituye al PRT-CNSP-012: Control de calidad in vitro del ensayo inmunocromatográfico para el diagnóstico de malaria, utilizando muestras frescas de sangre ELABORADO POR: REVISADO POR: APROBADO POR: CNSP Blga. Nancy Arróspide Velasco CNSP Blga. Sonia Caridad Gutierrez Gonzáles PUCP Ing. Ílmice Zuta Chong CNSP Blga. Magna Suárez Jara CNSP Blga. Miriam Guevara Robles CNSP Blgo. George Obregón Boltan INFORME N DEET-CNSP/INS FECHA: EL PRESENTE DOCUMENTO SE DISTRIBUYE COMO COPIA NO CONTROLADA Y TIENE UNA VIGENCIA DE 2 AÑOS CONTADA A PARTIR DE LA FECHA DE SU APROBACIÓN. EQUIPO DE GESTION DE LA CALIDAD DEL CENTRO NACIONAL DE SALUD PUBLICA PROCESA LAS PROPUESTAS DE MODIFICACIÓN Y ACTUALIZA LAS EDICIONES VIGENTES DEL MISMO

2 INDICE Pág. 2 de 15 CARÁTULA 1 INDICE 2 1. OBJETIVO 3 2. CAMPO DE APLICACION 3 3. REFERENCIAS 3 4. DEFINICIONES 3 5. RESPONSABILIDADES 5 6. FUNDAMENTO DEL MÉTODO 5 7. DESARROLLO DEL TIPO DE MUESTRA PREPARACIÓN DE MUESTRAS CONDICIONES PREVIAS ASPECTOS DE BIOSEGURIDAD EQUIPOS Y MATERIALES EJECUCIÓN DEL MÉTODO 8 8. EXPRESIÓN DE RESULTADOS 9 9. CONFIABILIDAD DEL MÉTODO INFORME DE RESULTADOS REGISTROS ANEXOS 11 Pág.

3 1. OBJETIVO Pág. 3 de 15 Evaluar la sensibilidad y especificidad de pruebas inmunocromatográficas in vitro para el diagnóstico de Malaria (pldh y HRPII), utilizando muestras-panel in vitro. 2. CAMPO DE APLICACION El presente método de ensayo es aplicable a los ensayos inmunocromatográficos in vitro para el diagnóstico de Malaria (pldh y HRPII), utilizando muestras-panel preparadas en el Laboratorio de Malaria del CNSP/INS. 3. REFERENCIAS 3.1 Arróspide, N. & Gutierrez, S. Evaluación de la sensibilidad y especificidad de pruebas rápidas in vitro para el diagnóstico de malaria. II Congreso Internacional del INS. Rev. Med. 2003; 20 (supl): S Gutierrez, S. & Arróspide, N. Manual de procedimientos de Laboratorio para el diagnóstico de Malaria. Serie de Normas técnicas Nº 39.; INDECOPI. Norma Técnica Peruana. NTP-ISO PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO PARA INSPECCION POR ATRIBUTOS. Parte 1: Planes para muestreo clasificados por calidad de nivel aceptable (NCA) para inspección lote por lote. Lima Perú; MPR-CNSP-012. Manual de Bioseguridad para Laboratorio. Lima Perú; WHO. NEW PERSPECTIVES MALARIA DIAGNOSIS Report of a joint WHO/USAID informal consultation. Copyright; PRT-CNCC-003. Muestreo de productos farmacéuticos y afines. Lima Perú; World Health Organization Malaria rapid diagnosis. Making in work. Philippines; Piita Fernández, S.; Pértegas Díaz, S. Validez de una prueba diagnóstica. Unidad de Epidemiología Clínica y Bioestadística. Complexo Hospitalario- Universitario Juan Canalejo. A Coruña (España) Cad. Aten. Primaria 2003; 10: Inserto de Kit de diagnostico OptiMal Diamed IT Inserto de Kit de diagnostico ICT BINAX PF/PV. 4. DEFINICIONES

4 Pág. 4 de densidad parasitaria: Número de parásitos Plasmodium contabilizados por microlitro de sangre. Se mide en parásitos por microlitro de sangre p/µl especificidad: Capacidad para detectar a los sanos o la FVN: Especifici dad VN = VN + FP 4.3. malaria: Enfermedad provocada por la infección de los eritrocitos en el hombre con el parásito del género Plasmodium correspondiente a cualquiera de la cuatro especies circulantes en el mundo: P. vivax, P. falciparum, P. ovale y P. malariae muestras frescas parasitadas: son muestras hemáticas captadas entre 48 h, procedentes de zonas endémicas de pacientes con malaria por P. falciparum y P. vivax muestras negativas: Son muestras de personas clínicamente sanas y con diagnóstico microscópico de gota gruesa negativo muestras panel: Son muestras de sangre parasitada que son preparadas en laboratorio en diferente densidad parasitaria y que son preparadas a partir de muestras hemáticas frescas parasitadas muestras positivas a P. falciparum: Son muestras hemáticas de sangre total parasitadas con P. falciparum muestras positivas a P. vivax: Son muestras hemáticas de sangre total infectadas con P. vivax pruebas rápidas: Llamadas también pruebas inmuncromatográficas son tiras de papel revestida por una membrana de nitrocelulosa, en la cual se ha impregnado anticuerpos monoclonales y/o policlonales específicos para ciertos antígenos de las cuatro especies del género Plasmodium que parasitan al hombre. La reacción antígeno-anticuerpo, en presencia del conjugado, expresa la formación de una banda de color que es posible ser visualizada macroscópicamente. Existen dos tipos de prueba en el mercado comercial las que usan la proteína HRPII y las que usan la enzima Lactato deshidrogenasa (pldh) sensibilidad: La sensibilidad es la capacidad de la prueba para detectar la enfermedad o la FVP: VP Sensibilid ad = VP + FN Siglas CNCC: Centro Nacional de Control de Calidad. CNSP: Centro Nacional de Salud Pública. DEET: Dirección Ejecutiva de Enfermedades Transmisibles. E: Especificidad. p/µl: Número de parasitos Plasmodium contabilizados por microlitro de sangre. PfHRP-II: Proteína II rica en Histidina.

5 EL PRESENTE DOCUMENTO SE DISTRIBUYE COMO COPIA NO CONTROLADA Y TIENE UNA VIGENCIA DE 2 AÑOS CONTADO A PARTIR DE LA FECHA DE SU APROBACIÓN pldh: Lactato deshidrogenasa S: Sensibilidad. FVN: Fracción de verdaderos negativos. FVP: Fracción de verdaderos positivos. 5. RESPONSABILIDADES Pág. 5 de El Director Ejecutivo de la DEET revisa y firma los Informes de Resultados producto del desarrollo del presente método de ensayo El Coordinador de Enfermedades Metaxénicas es responsable de supervisar y hacer cumplir todos los aspectos relacionados a la aplicación del presente método de ensayo El Coordinador del Laboratorio de Malaria es responsable de revisar y verificar la conformidad de los resultados de los análisis desarrollados mediante la aplicación del presente método de ensayo El analista del Laboratorio de Malaria del CNSP/INS es responsable de la ejecución del ensayo inmunocromatográfico para el diagnóstico de Malaria, asimismo, coordina todas las actividades inherentes a la evaluación, así como el registro y emisión de resultados. 6. FUNDAMENTO DEL MÉTODO 6.1. Fundamento biológico de las pruebas inmunocromatograficas que detectan la pldh. La prueba tiene anticuerpos monoclonales que detectan la isoenzima glicolítica pldh la cual es expresada en altos niveles durante el estadío eritrocítico del parásito, por tanto es producida únicamente por parásitos vivos de las diferentes especies de Plasmodium. Esta prueba utiliza tiras de nitrocelulosa las cuales contienen un pool de anticuerpos de carácter monoclonal dirigidos específicamente hacia una epítope de la pldh. Esta reacción antígeno-anticuerpo es fijada por la presencia de anti-anticuerpos policlonales contenidos en la solución de conjugado en soportes de liposomas ligados a un colorante que permite la visualización de los resultados Fundamento biológico de las pruebas inmunocromatogràficas que detectan la Proteina II rica en Histidina (PfHRP-II). Esta prueba utiliza dos anticuerpos que han sido inmovilizados en la tira de la prueba formando líneas separadas a través de una lámina de prueba. Un anticuerpo (área de prueba T1) es específico para el antígeno de P. falciparum de proteína II, rica en histidina (P.f HRPII). El otro anticuerpo (área de prueba T2) es específico para un antígeno de malaria que es común para las otras especies P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae.

6 Pág. 6 de 15 Para la reacción antígeno-anticuerpo, utiliza un conjugado que contiene sulfordaminas (PATH, parasight) y oro coloidal (ICT), ligadas a un colorante para fijar la reacción. El antígeno HRPII puede seguir circulando en la sangre de la persona por 72 h después de negativizarse la gota gruesa, fenómeno conocido como antigenemia. En el mercado existen varios kits, que utilizan la PfHRP-II como fuente de antígeno, entre ellos tenemos: Parasight f; PATH; ICT Pf, ICT Pf/Pv, etc. 7. DESARROLLO DEL 7.1. TIPO DE MUESTRA Se evalúan las pruebas inmunocromatograficas de diagnóstico utilizados en el ensayo inmunocromatográfico in vitro para el diagnóstico de Malaria PREPARACIÓN DE MUESTRAS KITS DE DIAGNÓSTICO Las muestras de kits de diagnóstico para el método de ensayo, son proporcionadas en sus envases originales y recipientes sin abrir, estos son obtenidos por muestreo de los almacenes correspondientes por el personal del Equipo de Muestreo del CNCC, dichas muestras son transportadas y conservadas según las especificaciones del fabricante La selección del lote se realiza según los Planes Estándares de Muestreo, el número de envases mayores se obtiene aplicando la Tabla Mil-STD 105 D por atributo, tipo simple, nivel de inspección II y para la selección de las muestras se aplica el Método Aleatorio Simple (PRT-CNCC-003: Muestreo de productos farmacéuticos y afines). El proceso de obtención de la muestra de kits de diagnóstico y contramuestra legal es registrado en un Acta de Muestreo (FOR- 003 PRT-CNCC-003 Acta de muestreo CNCC) Los kits de diagnóstico muestreados son distribuidos de la siguiente manera: - Para la evaluación de la sensibilidad y especificidad de los kit, se entrega el número de Kits requerido al Laboratorio de Malaria del CNSP. - Las contramuestras legales (segundo grupo de Kits) se reservan en custodia en el CNCC. - Para el cálculo del número de kits a procesar para la selección de positivas y negativas se procede a la aplicación del método de muestreo por afijación simple Los kits de diagnóstico son rotulados de acuerdo a una tabla de números aleatorios para los tres grupos de evaluación: - Plasmodium vivax. - Plasmodium falciparum. - Muestras negativas.

7 MUESTRAS FRESCAS DE SANGRE Obtención: Pág. 7 de 15 - Son obtenidas por punción venosa, en tubos al vacío con anticoagulante ED- TA o Heparina, de pacientes con diagnóstico positivo de Malaria por P. vivax o P. falciparum cuya densidad sea no menor de tres cruces (+++) y en la cantidad de 5 ml (aproximadamente). - Para cualquiera de los casos (P. vivax y P. falciparum), la muestra se obtiene de los pacientes infectados con Malaria antes de iniciar el tratamiento. - Las muestras negativas, son obtenidas a partir de sujetos clínicamente sanos evaluados por un médico, la negatividad es confirmada a través de un examen de Gota Gruesa mediante la observación microscópica que lo avale como persona sin Malaria. - No se aceptan para el ensayo muestras hemolizadas Transporte: - Las muestras sanguíneas obtenidas en las áreas endémicas de Malaria por P. vivax y P. falciparum, son transportadas por el analista o enviadas por el currier vía aérea o terrestre, al lugar donde se ejecuta el ensayo manteniendo la cadena de frío entre 2 C a 8 C. - Las condiciones de transporte de muestras se realizan bajo las normas de bioseguridad de transporte de muestras. - El transporte se ejecuta en contenedores de bioseguridad validados para 72h a temperaturas de 2 C-8 C. - Las muestras deben llegar al laboratorio donde se ejecuta el ensayo en un período no mayor a 48 h de obtenida la muestra Conservación: - Las muestras sanguíneas se conservan en refrigeración (2ºC -8ºC), hasta el momento de la ejecución del ensayo. - El ensayo debe ser ejecutado sólo hasta 48h luego de haber tomado las muestras, caso contrario los parásitos pierden viabilidad CONDICIONES PREVIAS No aplica 7.4. ASPECTOS DE BIOSEGURIDAD El personal encargado de la obtención de muestra de sangre fresca debe estar especialmente capacitado e instruido en las operaciones relacionadas con su trabajo y debe seguir lo dispuesto en el Manual de Bioseguridad para Laboratorios (MPR-CNSP-012) en relación a prácticas seguras en la obtención de muestras sanguíneas y uso de equipos de protección personal (mandil, mascarilla, guantes).

8 Pág. 8 de Los analistas encargados de realizar la evaluación de sensibilidad y especificidad de las pruebas inmunocromatográficas in vitro para el diagnóstico de Malaria deben estar capacitados en las operaciones relacionadas con su trabajo y cumplir las normas de bioseguridad correspondientes y pertinentes EQUIPOS Y MATERIALES Materiales e insumos de laboratorio (el Giemsa y el Metanol cuentan con Certificados de Análisis y con fecha de vencimiento vigente): - Kit para el diagnóstico de Malaria (ensayo inmunocromatográfico in vitro). - Láminas portaobjeto. - Colorante Giemsa. - Metanol. - Glicerina. - Agua destilada o agua de caño con ph de 6,6 7,4. - Probetas de 10 ml, 50 ml y 100 ml. - Tubos al vacío (vacutainer) con anticoagulante. - Agujas al vacío (vacutainer) para tubos al vacío. - Crioviales de 2 5 ml (aproximadamente). - Contenedor de bioseguridad. - Bolsas de Bioseguridad Equipos y accesorios (todos los equipos deben de estar calibrados, excepto el microscopio binocular con objetivo de inmersión y los contadores manuales): - Refrigeradora con control de temperatura (2 C 8 C). - Micropipeta unicanal, de rango variable de 0,5 10 µl. - Micropipeta unicanal de rango variable de µl ó µl. - Micropipeta unicanal de rango variable de µl ó µl. - Cronómetro. - Balanza analítica. - Potenciómetro. - Termo-higrómetro. - Microscopio binocular con objetivo de inmersión. - Contadores manuales EJECUCIÓN DEL MÉTODO Determinación de la densidad parasitaria:

9 Pág. 9 de La sangre total es evaluada microscópicamente para determinar la densidad parasitaria, de acuerdo al Cálculo del número de parásito por microlitro de sangre. (Manual para el diagnóstico de Laboratorio de Malaria Normas técnicas Nº 39 INS) Dilución de las muestras frescas de sangre: Una vez obtenido el resultado de la densidad parasitaria en parásitos por microlitro de sangre, se procede a realizar los cálculos para obtener la dilución de la muestra de sangre en la densidad dentro del rango de parasitemia solicitado por el cliente Conocido el valor de la densidad parasitaria de la muestra parasitada, se lleva a la dilución deseada ejecutando una dilución con la muestra del control negativo, aplicando la fórmula: V 1 x C 1 = V 2 x C 2 Donde: V 1 = Volumen N 1. C 1 = Concentración N 1. V 2 = Volumen N 2. C 2 = Concentración N Ajustar luego la parasitemia por observación microscópica de la lámina en gota gruesa siguiendo el método del recuento parasitario en p/µl de sangre, preparando dos láminas para determinación de la densidad parasitaria por promedio de las mismas (Manual de procedimientos de Laboratorio para el diagnóstico de Malaria. Serie de Normas técnicas Nº 39) Evaluación de las muestras frescas de sangre: Proceder a ejecutar la reacción antígeno-anticuerpo (muestra hemática-tira) de acuerdo a lo que indique el inserto de la prueba que se está procesando Se ingresa los resultados en dos tablas de contingencia (4 x 3) obteniéndose tablas de contingencias en las que se debe encontrar una tasa de sensibilidad y especificidad del 100%, y una tasa de falso positivo y negativo del 0%. 8. EXPRESIÓN DE RESULTADOS 8.1. La Sensibilidad y Especificidad de las pruebas inmunocromatográficas para diagnóstico de Malaria a partir de muestras panel in vitro, se determina utilizando la Tabla de contingencia 2x2, como a continuación se detalla:

10 Kit inmunocromatográfico evaluado Positivo (con Malaria) Gota Gruesa Negativo (sin Malaria) Pág. 10 de 15 Total Positivo a b a + b Negativo c d c + d Total a + c b + d 8.2. La especificidad se calcula según la siguiente fórmula: E = d b+ d 8.3. La sensibilidad se calcula según la siguiente fórmula: S = 9. CONFIABILIDAD DEL MÉTODO a a+ c La confiabilidad teórica del método de ensayo para la evaluación de sensibilidad y especificidad de pruebas inmunocromatográficas para el diagnóstico de Malaria a partir de muestras panel in vitro es del 100% de reproducibilidad para las muestras ensayadas. 10. INFORME DE RESULTADOS Los resultados de las evaluaciones descritas en el presente documento son reportados en los formularios autorizados por el CNSP. 11. REGISTROS La información originada por el presente método de ensayo y toda información generada por esta actividad, son registradas en los formularios anexos.

11 12. ANEXOS ANEXO A: Formularios Pág. 11 de 15 ANEXO A.1: FOR-001 Reporte de resultados de la evaluación de sensibilidad y especificidad de las pruebas inmunocromatográficas para el diagnóstico de malaria ANEXO A.2: FOR-002 Ficha clínica del paciente. ANEXO A.3: FOR-003 Preparación de la Solución Stock de Giemsa (Giemsa Madre). ANEXO A.4: FOR-004 Uso del Colorante Giemsa Stock.

12 Ítem Fecha Código Nombre del evaluador: ANEXO A.1 FORMULARIO REPORTE DE RESULTADOS DE LA EVALUACIÓN DE SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LAS PRUEBAS INMUNOCROMATOGRÁFICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE MALARIA Resultado Ensayo inmunocromatográfico Gota gruesa Positivo Negativo Positivo Negativo Firma del evaluador: Pág. 12 de 15 FOR-001 MET- CNSP-008 Edición Nº 02 Pág. 1 de 1 Observaciones

13 Nombre del paciente : ANEXO A.2 FORMULARIO FICHA CLÍNICA DEL PACIENTE Pág. 13 de 15 FOR-002 MET- CNSP-008 Edición Nº 02 Pág. 1 de 1 Edad : Sexo: F M Peso: (Kg) Procedencia : EVALUACIÓN DEL PACIENTE Presenta signos, síntomas clínicos que sean compatibles con la definición del caso de Malaria? Resultado de la Gota Gruesa: Nombre del Médico evaluador: Sí Positivo No Negativo Firma del Médico evaluador: Fecha:

14 Laboratorio: Responsable de preparación: Colorante Giemsa utilizado: Código del Laboratorio: Marca: ANEXO A.3 FORMULARIO Pág. 14 de 15 FOR-003 MET- CNSP-008 PREPARACION DE LA SOLUCION STOCK DE GIEMSA (GIEMSA MADRE) Pág. 1 de 1 Nº de lote Fecha: Fecha de expiración Preparación: Balanza (donde se ejecutó pesada) Marca Serie: Ubicación: Cantidad de reactivos utilizados: Giemsa en polvo: Metanol : Glicerina: Volumen final Homogenización del colorante: De forma manual: Utilizando perlas de vidrio Horario de la homogenización: Fecha: Primer turno Evaluación del colorante Giemsa: Fecha: Segundo turno Tercer turno Nº. de láminas de gota gruesa evaluadas: Negativas Positivas: P. vivax P. falciparum Necesita madurar el colorante SI NO Edición Nº 02

15 EL EQUIPO DE GESTIÓN DE LA CALIDAD DEL CENTRO NACIONAL DE SALUD PUBLICA PROCESA LAS PROPUESTAS DE MODIFICACIÓN Y ACTUALIZA LAS EDICIONES VIGENTES Fecha Hora PROCEDIMIENTO CONTROL DE CALIDAD DE KITS DIAGNÓSTICO DEL ENSAYO INMUNOCROMATOGRÁ- FICO PARA EL DIAGNÓSTICO DE MALARIA Pág. 19 de 15 Usuario ANEXO A.4 FORMULARIO USO DEL COLORANTE GIEMSA STOCK Registro del código de Giemsa stock Registro del volumen utilizado FOR-004 MET- CNSP-008 Edición Nº 02 Pág. 1 de 1 Motivo de uso Observaciones Firma