Laboratorio III: Fundamentos de cromatografía de Intercambio Iónico

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1 pág. 1 de 17 Laboratorio III: Fundamentos de cromatografía de Intercambio Iónico 1- Los aminoácidos son ácidos polipróticos débiles. Cada aminoácido contiene protones disociables y su grado de disociación depende del ph de la solución. Consideremos el comportamiento ácido-base de la glicina, el aminoácido más sencillo. La misma presenta dos grupos ionizables. H O H 2 N CαC OH pka pka=10 = 9.6 R pka pka =2.6 = 2.3 Si se disuelve la glicina en una solución muy ácida ( por ej. ph = 1.0 ) tanto el grupo amino como el grupo carboxilo se encuentran protonados y la molécula presenta una carga neta de +1. Si se aumenta el ph por agregado de una base, la disociación de protones tendrá lugar en la secuencia que sigue: Carga neta [ M ]

2 pág. 2 de 17 En la zona cercana al ph neutro la mayor parte de la glicina se encuentra en la forma H 3 N + -CH -COO - 2, con una carga neta igual a cero. Un anfolito que se encuentre en este estado, con igual número de cargas positivas y negativas se denomina zwitterion. Sin embargo solo existe un punto dentro de esta zona de ph donde la carga neta de la glicina es cero. El ph al que ocurre esto de denomina punto isoiónico (pi). El punto isoiónico es un concepto teórico. El punto isoeléctrico es el ph al cual la proteína, cuando es sometida a un campo eléctrico, tiene una movilidad electroforética nula; puede determinarse experimentalmente mediante una electroforesis. En general se usan en forma intercambiable punto isoiónico y punto isoeléctrico, aunque no tienen porque coincidir exactamente. Se puede calcular el punto isoiónico aplicando la ecuación de Henderson- Hasselbalch a ambos grupos ionizables. ph = pka + log [A - ]/[HA] Cuando pi = ph pi = pk COOH + log [H 3 N + - CH 2 COO ] / [H N + CH COOH] pi = pk NH3 + log [H 2 NCH 2 COO ] / [H 3 N CH COO ] Sumando ambas ecuaciones se obtiene: pi = pk COOH + pk NH3 + log [H 2 NCH 2 COO ] / [H3N + CH2COOH] - pero como en el pi [H 2 NCH 2 COO ] = [H N + CH COOH] NH3 pi = pk + pk / 2 COOH Los aminoácidos polares contienen otros protones disociables en sus cadenas laterales, por lo que sus curvas de titulación son más complejas, sin embargo se aplica el mismo principio. Veamos el caso del ácido glutámico.

3 pág. 3 de 17 HOOC pka 1 HOOC pka 2 OOC pka 3 OOC NH 3 COOH NH 3 COO NH 3 COO NH 2 COO z=+1 z=0 pi z=-1 z=-2 OH El pka 1 corresponde al grupo carboxilo de la cadena principal, el pka2 corresponde al grupo carboxilo de la cadena lateral y el pka 3 corresponde al grupo amino. El pi del ácido glutámico se encuentra entre el pka y el pka. 1 2 Por qué los grupos carboxilo presentan distinto pka? El pka se encuentra relacionado con la constante de disociación Ka. El equilibrio de disociación del protón de un grupo químico se encuentra influenciado por su entorno. Por lo tanto la constante de disociación de un grupo químico depende de su entorno. Por ej. cuando el grupo carboxilo se encuentra cercano a un grupo cargado positivamente como por ejemplo en la lisina, la disociación del grupo carboxilo se ve favorecida porque el carboxilato interacciona con el grupo positivo de la lisina. Por lo tanto su Ka es mayor y por ende el pka menor. pk a = log10 K a El mismo argumento se puede manejar para el grupo carboxilo de la cadena principal, ya que se encuentra cercano a un grupo amino. La moléculas grandes como las proteínas pueden tener muchos grupos ácidos o básicos. Estas moléculas se denominan polianfolitos. Con más de dos grupos cargados, el cálculo de pi es más complejo. Sin embargo siempre que la molécula tenga grupos cargados positivamente y negativamente, tendrá un punto isoiónico en el cual la carga neta media es cero. Si predominan los grupos ácidos, el pi será bajo; si predominan los aminoácidos básicos, el pi será alto. La carga de una proteína está determinada por su pi y el ph del buffer en el que se encuentra. Si el ph es mayor que el pi, entonces la proteína estará cargada negativamente. Si el ph es menor que el pi entonces la proteína estará cargada positivamente.

4 PP Facultad de Ciencias pág. 4 de ph < pi pi ph > pi 2- Teoría del intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico se aplica a la separación de casi todos los tipos de moléculas cargadas, desde grandes proteínas a pequeños nucleótidos y aminoácidos. La molécula de interés, en general una proteína, es separada de otras proteínas en base a su diferencia de carga. La separación se basa en la adsorción reversible de moléculas de soluto cargadas a grupos de intercambio iónicos de carga opuesta inmovilizados a una matriz. El intercambio iónico al igual que cualquier proceso iónico es un equilibrio. La proteína cargada se une al intercambiador con carga opuesta mediante fuerzas electrostáticas. Intercambiador Proteína P + La molécula unida al intercambiador puede ser rápidamente reemplazada por otro ion. + + Na + + Na + P +

5 pág. 5 de 17 La separación se alcanza cuando existen sustancias con diferente grado de interacción con el intercambiador debido a sus diferencias de carga y densidades de carga Estas interacciones pueden controlarse variando condiciones como fuerza iónica y ph Intercambiadores iónicos Un intercambiador iónico consiste de una matriz porosa insoluble a la cual se le unen en forma covalente grupos cargados. Estos grupos cargados se encuentra asociados con contraiones móviles. Estos contraiones pueden ser intercambiados en forma reversible con otros iones de la misma carga sin alterar la estructura de la matriz. Los intercambiadores cargados positivamente tienen contraiones negativos (aniones) disponibles para intercambiar y por lo tanto se conocen como intercambiadores aniónicos. Los intercambiadores cargados negativamente tienen contraiones positivos (cationes) y se denominan intercambiadores catiónicos. Figura 1

6 pág. 6 de 17 La matriz puede estar constituida por compuestos inorgánicos, resinas sintéticas, polisacáridos etc. Las características de la matriz determinan sus propiedades como resolución, capacidad y recuperación al igual que las propiedades físicas como la resistencia mecánica y las propiedades de flujo. Los intercambiadores iónicos basados en dextranos (Sephadex ), seguidos de aquellos basados en agarosa (Sepharose CL-6B ) y de celulosa entrecruzada (DEAE Sephacel) fueron las primeras matrices de intercambio iónico que combinaron la forma esférica correcta con la alta porosidad, llevando a mejores propiedades de flujo y altas capacidades para macromoléculas. El Sephadex es un base adecuada como matriz de un intercambiador iónico ya que es hidrofílica y muestra poca adsorción inespecífica. Las proteínas, ácidos nucléicos y otras moléculas biológicas lábiles no se adsorben al gel ni sufren desnaturalización por el mismo. El grado de hinchamiento de los intercambiadores iónicos basados en Sephadex dependen del ph, de la fuerza iónica del buffer utilizado y de la naturaleza de los contraiones y es distinto que el del Sephadex neutro. El tipo de grupo funcional unido a la matriz determina el tipo y la fuerza del intercambiador iónico. Su número total y disponibilidad determina su capacidad. Tabla 1- Tipo de intercambiadores Grupos funcionales de los intercambiadores aniónicos Descripción Contraión Diethylaminoethyl -OCH 2 CH 2 N + H(CH 2 CH 3 ) 2 Intercambiador Cloruro (DEAE) débil Quaternary aminoethyl (QAE) -OCH 2 CH 2 N + (C 2 H 5 ) 2 CH 2 CH(OH)CH 3 Intercambiador fuerte Cloruro Quaternary amonium (Q) -CH 2 N + (CH 3 ) 3 Intercambiador fuerte Cloruro Grupos funcionales de los intercambiadores catiónicos Carboxy methyl (CM) -OCH 2 COO - Intercambiador débil Sodio Sulphopropyl (SP) -CH 2 CH 2 CH 2 SO 3- Intercambiador fuerte Sodio - Methyl sulphonate (S) -CH 2 SO 3 Intercambiador fuerte Sodio

7 pág. 7 de 17 Los grupos sulfónico y amino cuaternario son utilizados para generar intercambiadores fuertes y los otros grupos para generar intercambiadores débiles. EL término fuerte y débil se refiere al grado de variación de la ionización con el ph y no a la fuerza de la unión. Los intercambiadores fuertes se encuentran completamente ionizados en un amplio rango de ph, mientras que en los intercambiadores débiles el grado de disociación y por ende la capacidad varía en forma mucho más marcada con el ph. Algunas propiedades de los intercambiadores fuertes. - La capacidad no disminuye a phs altos y bajos debido a la perdida de grupos cargados del intercambiador. - Existe un mecanismo de interacción simple entre el intercambiador iónico y el soluto. - Los experimentos de intercambio iónico son más controlables ya que la carga del intercambiador no cambia con el cambio de ph. Los intercambiadores iónicos más comúnmente utilizados son los intercambiadores débiles. El DEAE Sephadex en general es utilizado como intercambiador aniónico y el CM - Sephaex como intercambiador catiónico. Las propiedades iónicas tanto del DEAE como del CM son dependientes del ph, pero ambos son lo suficientemente cargados como para funcionar bien como intercambiadores iónicos dentro de un rango de ph de 4-8 donde la mayoría de la separación de proteínas tiene lugar. Figura 2

8 pág. 8 de Capacidad de un intercambiador La capacidad de un intercambiador es una medida cuantitativa de su habilidad de aceptar contraiones intercambiables. Esta puede ser expresada como : - Capacidad total : es el número de grupos sustituyentes cargados por gramo de intercambiador seco o por ml de intercambiador hinchado. La capacidad total puede ser medida por titulación con una ácido o una base fuerte. - Capacidad disponible: Es la cantidad de proteína que puede ser unida a un intercambiador iónico en las condiciones experimentales de trabajo. Por lo tanto esta capacidad depende de las propiedades de la proteína, del intercambiador y de las condiciones experimentales seleccionadas. Propiedades de la proteína La propiedades de una proteína que determinan la capacidad disponible de un intercambiador son su peso molecular y la relación carga /ph. Por lo tanto la cantidad de proteína que un intercambiador puede unir varía según la proteína. Como casi todas las matrices utilizadas para cromatografía de intercambio iónico de moléculas biológicas son porosas, las moléculas que son lo suficientemente pequeñas como para entrar en los poros van a presentar una mayor capacidad disponible que aquellas moléculas que solo tengan acceso a los sustituyentes cargados que se encuentran en la superficie del gel. De la misma forma como la interacción es iónica la relación carga de la proteína/ph tiene que ser tal que la proteína presente la carga neta correcta con una densidad de carga suficiente para unirse a un intercambiador en particular bajo las condiciones experimentales seleccionadas. Propiedades de la matriz Las propiedades de la matriz que determinan su capacidad disponible para una proteína en particular son el tamaño de poro de la matriz y el número de sustitiyentes cargados. Por lo tanto una alta capacidad disponible va a estar dada por una matriz macroporosa con un alto número de sustituyentes cargados que mantengan su cargan en un amplio rango de ph.

9 pág. 9 de 17 Condiciones experimentales La condiciones experimentales que afectan la capacidad disponible u observada son ph; fuerza iónica del buffer; la naturaleza del contraión; la velocidad de flujo y la temperatura Proceso de intercambio iónico Selección del intercambiador No hay un intercambiador que sea mejor para una determinada separación, la elección del mismo depende de: Los requerimientos específicos de la aplicación, del tamaño molecular y del punto isoeléctrico de los componentes de la muestra. En una cromatografía de intercambio iónico uno puede elegir entre adsorber la sustancia de interés al intercambiador y dejar pasar los contaminantes (intercambio positivo) o adsorber los contaminantes al intercambiador y dejar pasar la sustancia de interés (intercambio negativo). Generalmente el primer método es el más útil ya que permite un mayor grado de fraccionamiento y concentra la sustancia de interés. Los procedimientos de intercambio iónico pueden ser llevados a cabo en: columna el intercambiador se empaqueta en una columna y la muestra se siembra en la parte superior de la misma, dejando que se adsorba al intercambiador. Batch el intercambiador y la muestra se colocan en un recipiente y se agitan durante un determinado tiempo. Las sustancias se unen al intercambiador iónico cuando presentan una carga neta opuesta a la del intercambiador. La unión es electrostática y reversible. En el caso de sustancias que presentan un solo tipo de grupos cargados la elección del intercambiador es clara. Las sustancias que presentan grupos cargados positivos y negativos, son llamadas anfotéricas y su carga neta depende del ph. Este es el caso de las proteínas,en su punto isoiónico tienen carga neta cero y no se unen ni a un intercambiador aniónico ni a uno catiónico. El ph del buffer determina la carga de las moléculas anfotéricas durante el experimento. Por lo tanto en principio uno puede seleccionar un intercambiador aniónico o catiónico para unir moléculas anfotéricas seleccionando el ph apropiado. En la práctica sin embargo la elección se basa en cual es el tipo de intercambiador y el ph que permiten

10 PP PP Facultad de Ciencias pág. 10 de 17 obtener una mejor separación de las moléculas de interés, dentro de los límites de estabilidad de la proteína. Muchas macromoléculas biológicas pueden desnaturalizarse o perder actividad en determinados rangos de ph y por lo tanto la selección del intercambiador está limitada por la estabilidad de las macromoléculas Elección del buffer El buffer seleccionado tiene que ser tal que la sustancia a ser unida al intercambiador se encuentre cargada. El ph del buffer tiene que ser al menos una unidad mayor que el punto isoeléctrico de la proteína si se va a utilizar un intercambiador aniónico (la proteína queda cargada negativamente) o al menos una unidad menor que el punto isoeléctrico si se va a utilizar un intercambiador catiónico (la proteína queda cargada positivamente), de forma de facilitar la unión al intercambiador. Otro aspecto a seleccionar es la fuerza iónica del buffer, esta deber ser lo suficientemente baja de forma que los iones del buffer no compitan con la sustancia de interés por los sitios de intercambio. Las sales tambien juegan un rol como estabilizadoras de proteínas en solución, por lo tanto es importante que la fuerza iónica sea lo suficientemente alta como para que no ocurra precipitación o desnaturalización de proteínas. Una vez seleccionado el buffer hay que equilibrar el intercambiador iónico en dicho buffer. A baja fuerza iónica Na + + P Na + Al aumentar la fuerza iónica Na Na + P + +

11 pág. 11 de Aplicación y adsorción de la muestra Si las moléculas de soluto tienen la carga apropiada van desplazando los contraiones y se unen en forma reversible al gel. La cantidad de intercambiador requerida para un experimento dado depende de la cantidad de muestra que va a ser cromatografiada y de la capacidad disponible del mismo para dicha sustancia. Para obtener una buena resolución en la cromatografía de intercambio iónico, en general no conviene usar más de un 10-20% de la capacidad disponible del intercambiador. Cuando el intercambio se va a realizar en columna también hay que tener en cuenta el que se tenga un buen empaquetamiento de la columna Elución Para eluir las moléculas del gel hay que cambiar las condiciones de forma que se tornen desfavorables para la unión de esas moléculas a la matriz. Esto en general involucra un cambio de ph o un aumento de la fuerza iónica en el buffer de elución. Si las condiciones iniciales para realizar el intercambio iónico se eligen de tal forma que las sustancias no deseadas son las que se unen a la columna, entonces no es necesario realizar un cambio en las condiciones de elución, ya que la sustancia de interés sale en el percolado. De la misma forma no se requieren cambios para la elución cuando los componentes de la muestra son retardados en forma diferencial y pueden ser separados en las condiciones de inicio. Esto se conoce como elución isocrática. Sin embargo normalmente la separación y elución se alcanzan mediante una reducción selectiva de la afinidad de las moléculas de soluto por los grupos cargados en el gel, tanto por cambio en la fuerza iónica, en el ph o en ambos. Este proceso se denomina elución por gradiente. Cuando se hace elución por gradiente, la fuerza iónica del buffer o el ph aumentan en forma gradual. Elución por cambio de ph. Cuando se altera el ph de la solución, llevándolo hacia el punto isoeléctrico, la sustancia unida al intercambiador, pierde su carga neta desorbiéndose y eluyendo del intercambiador.

12 pág. 12 de 17 Como muchas proteínas presentan una solubilidad mínima en su punto isoeléctrico, se deben tomar precauciones para asegurarse que no ocurra precipitación en la columna en el punto isoeléctrico. La solubilidad de los componentes de la muestra en el ph y fuezas iónicas de los buffers utilizados en la separación deben ser estudiadas. Elución por cambio de fuerza iónica. Es el tipo de elución más frecuentemente utilizado en cromatografía de intercambio iónico. Son fáciles de preparar y muy reproducibles. A bajas fuerzas iónicas la competencia por los gurpos cargados de la matriz es mínima y las sustancias cargadas pueden unirse fuertemente. Al aumentar la fuerza iónica del medio la competencia aumenta y se reduce la interacción entre el intercambiador y las sustancias de interés, resultando en su elución. El intercambio iónico es un equilibrio, por lo tanto la habilidad del contraión para desplazar la proteína unida depende no solo de la fuerza del enlace sino también de la concentración del contraión. Por ejemplo para un intercambio aniónico, cuanto menor sea la diferencia entre el ph y el pi, menor va a ser la fuerza del enlace entre la proteína y el intercambiador. Figura 3

13 pág. 13 de Regeneración del intercambiador. Los pasos siguientes consisten en la remoción del gel de sustancias que no fueron eluídas en las condiciones anteriores y regeneración de la columna a las condiciones iniciales para una nueva purificación. 3 Bibliografía C.K. Mathews, K.E. Van Holde (1996 ) Biochemistry, 2 nd ed., The Benjamin/cummings Publishing Company, Inc. Ion Exchange Chromatography, 3 rd ed., Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden.

14 pág. 14 de 17 Práctico de cromatografía de intercambio iónico Propiedades de la Lisozima. La lisozima es una enzima que lisa determinadas bacterias al romper los polisacáridos de sus paredes celulares. La pared celular proporciona un soporte rígido a la bacteria. Normalmente una célula bacteriana sin pared celular estalla a causa de la elevada presión osmótica de su interior. El polisacárido de la pared celular está formado por dos clases de azúcares: N- acetilglucosamina (NAG) y N-acetilmuramato (NAM). Así pues el polisacárido de la pared celular es un polímero alternante de residuos de NAM y NAG unidos por enlaces β (1 4) glicosídicos. La lisozima es una glicosidasa : hidroliza el enlace glicosídico entre el C-1 del NAM y el C- 4 del NAG. La lisozima presenta dos características que la diferencian del resto de las proteínas de la clara de huevo, que la hacen particularmente adecuada para su purificación. Estas son: su alto punto isoeléctrico pi = 11 y su bajo peso molecular PM = El primero permite su fácil purificación por cromatografía de intercambio iónico en un solo paso. El segundo le permite un claro seguimiento por electroforesis con SDS en poliacrilamida. Objetivo Purificación parcial de lisozima de clara de huevo mediante cromatografía de intercambio iónico. Protocolo de intercambio iónico de lisozima de clara de huevo. 1- Filtrar la clara de huevo a través de una gasa. 2- Diluir al quinto con buffer glicina-soda 0.1M ph 10.0 ( Fracción FO ). 3- Tomar una alícuota de 4.0 ml de FO y agregarle 4.0 ml de CM-Sephadex. 4- Realizar el intercambio en batch agitando durante 15 minutos por rotación. 5- Separar el percolado con ayuda de la jeringa ( Fracción F1)

15 pág. 15 de Lavar el gel con 4.0 ml de buffer glicina-soda 0.1M ph 10.0, agitando durante 10 minutos por rotación. Extraer el sobrenadante con ayuda de una jeringa. (4 lavados) 7- Repetir el paso anterior hasta que la absorbancia a 280 nm del sobrenadante de lavado sea menor a 0.1 UA/ml 8- Realizar la elución de la lisozima en columna, con buffer glicina-soda 0.1M ph 10.0 suplementado con NaCl 0.5M. 9- Recoger 2 ml por tubo y medir absorbancia a 280 nm a cada tubo. El pico de elución corresponde a la fracción F2 10- Guardar las fracciones FO, F1 y F2 en la heladera para realizar el control de pureza por electroforesis en poliacrilamida 11- Llenar el siguiente cuadro de purificación. Muestra dilución A280 Proteína (UA/ml) Proteína (UA tot) % Recuperación F0 *********** F1 Lavado 1 Lavado 2 Lavado 3 Lavado 4 Lavado 5 Eluído 1 Eluído 2 Eluído 3 Eluído 4 Eluído 5 Qué porcentaje de la proteína total se recupera luego del proceso de intercambio iónico? Qué porcentaje corresponde a la lisozima? 12 Dibuje el diagrama de elución. (A280 vs número de tubo de elución)

16 pág. 16 de 17 Ejercicios 1- Se quiere separar por cromatografía de intercambio iónico una mezcla compuesta por las siguientes proteínas, en un buffer carbonato-bicarbonato de sodio, 50mM; ph 9.5. Proteína PI Seroalbúmina 4.9 Hemoglobina 7.2 Mioglobina 8.1 Lisozima 11.0 Se equilibra el intercambiador iónico DEAE - Sephadex con el buffer carbonatobicarbonato de sodio 50mM, ph 9.5. Se adsorbe la muestra y se lava con el mismo buffer. 1) Qué proteínas se unen al intercambiador y cuales salen en el percolado y lavados? 2) Cómo eluiría las proteínas que quedaron unidas al intercambiador y en que orden eluirían? 2.- Se tiene una mezcla de proteínas con los siguientes puntos isoeléctricos: Proteína PI A 7.0 B 8.0 C 4.0 Cómo purificaría la proteína C por intercambio iónico? Qué tipo de intercambiador usaría? A que ph trabajaría? Cómo haría la elución?

17 pág. 17 de Se realiza una cromatografía de intercambio iónico a una mezcla de enzimas en un buffer fosfato de sodio 0.1M ph 8.0 Las enzimas de la mezclan presentan los siguientes puntos isoeléctricos: Proteína PI A 4 B 7 C 11 Se utiliza un intercambiador catiónico. Se adsorbe la muestra, se lava con el buffer fosfato de sodio 0.1M ph8.0. Se mide actividad en el percolado y se encuentran las enzimas A, B y C. Luego se eluye con buffer fosfato de sodio 0.1M, ph 8.0, suplementado con NaCl 0.5M Se mide actividad en los tubos de eluído y se encuentra la enzima C. 1) Este resultado es el esperado? Explique. 2) Si no es el esperado. Qué puede haber ocurrido? 4.- Dos proteínas con el mismo punto isoeléctrico Pueden separarse por intercambio iónico?