La clonación en modelos experimentales: factores de éxito y fracaso Eduardo Roldán Museo Nacional de Ciencias Naturales, CSIC, Madrid.

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1 TALLER La clonación en animales y seres humanos Fundación BBVA II Semana de la Ciencia Madrid, martes 5 de noviembre de 2002 Coordinador: Eduardo Roldan (Museo Nacional de Ciencias Naturales, CSIC) Programa La clonación en modelos experimentales: factores de éxito y fracaso Eduardo Roldán Museo Nacional de Ciencias Naturales, CSIC, Madrid. Clonación en animales y aplicaciones potenciales Emilio Martínez Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia. La biología del embrión humano y el impacto de la clonación Montserrat Boada Servicio de Medicina de la Reproducción, Instituto Universitario Dexeus, Barcelona. Células madre y clonación Franz Martín Bermudo Instituto de Bioingeniería, Universidad Miguel Hernández, Alicante..

2 Introducción La clonación es uno de los temas de la biología que más atención atrae en estos momentos. Su interés científico y tecnológico es muy elevado debido a su enorme potencial para el análisis de aspectos fundamentales del desarrollo de los seres vivos, y de sus aplicaciones a varios campos tales como la multiplicación de animales de élite, la generación de animales genéticamente modificados para estudios de enfermedades animales y humanas o la producción de fármacos, y la posibilidad de contribuir a generar tejidos y órganos de reemplazo. En este Taller, un grupo de investigadores españoles presentará y debatirá desarrollos recientes en diversos aspectos de la clonación. El Taller está destinado a un público general interesado en avances de la ciencia. Se resumirán aspectos de la clonación con el fin de comprender por qué esta técnica constituye una revolución en nuestra manera de entender aspectos fundamentales de la biología, y se ilustrarán las posibles aplicaciones en el campo de la producción animal y mejora genética en animales, y en la producción de modelos animales para el estudio de enfermedades. Se debatirá también si la clonación puede ayudar a mantener, o incluso aumentar, la diversidad en especies en peligro de extinción. Asimismo, se abordará cómo la clonación ha influido en nuestra percepción del embrión humano, y el uso de la clonación en la producción de células madre embrionarias con fines terapéuticos. 1

3 La clonación en modelos experimentales: factores de éxito y fracaso Eduardo Roldán Museo Nacional de Ciencias Naturales, CSIC, Madrid. La clonación por transferencia de núcleos de células somáticas provenientes de individuos adultos, considerada biológicamente imposible hasta hace pocos años, es hoy una realidad en ratones, ovejas, vacas, cabras, cerdos y gatos. La clonación por transferencia de núcleo consiste en la transferencia de un núcleo de una célula somática a un óvulo al que previamente se le ha extraído su dotación cromosómica, la activación del óvulo por métodos físicos o químicos, la incubación in vitro del embrión resultante y la transferencia a una nodriza para que continúe su desarrollo. Los individuos obtenidos son prácticamente idénticos a aquellos de los que se obtuvieron las células somáticas. La identidad no es total porque si bien el genoma nuclear es idéntico, el genoma mitocondrial, que deriva del óvulo, difiere. Puede haber también diferencias debidas a mutaciones surgidas durante el desarrollo y a ambientes uterinos y post-natales diferentes. Enucleación (extracción de cromosomas) mediante micromanipulación de un óvulo de ratón (izquierda) y microinyección de un núcleo, proveniente de una célula del cúmulo ooforo, en un óvulo enucleado de ratón (derecha). La clonación es aún muy ineficaz, ya que sólo se desarrolla a término una proporción muy reducida de los embriones construídos mediante transferencia de núcleo. Este bajo éxito es el resultado de pérdidas producidas en las etapas tempranas de desarrollo embrionario, durante el desarrollo fetal y en el período perinatal. No se comprende aún cuáles pueden ser los mecanismos responsables de esta elevada mortalidad pero se cree que se debe a la expresión incorrecta de genes durante diversos estadios de desarrollo. Cuando se realiza la transferencia de núcleo, también se realiza una transferencia de mitocondrias y es posible que exista una cierta incompatibilidad entre las mitocondrias transferidas y aquellas que están presentes en el óvulo (en la fecundación, sólo las mitocondrias del óvulo sobreviven ya que las del espermatozoide son destruídas). Se han obtenido clones utilizando núcleos provenientes de varios tipos de células adultas o fetales, entre las que se encuentran células del cumulus oophorus (aquellas que rodean al óvulo), fibroblastos, células musculares, linfocitos, o neuronas de la corteza cerebral fetal. También se han obtenido clones empleando núcleos de células 2

4 madre embrionarias. No todas las células son igualmente eficientes como donantes de núcleo y algunos tipos celulares no ha sido útiles para obtener clones. Es importante conocer por qué existen estas diferencias entre los diversos tipos de células. Existe sólo una baja proporción de células en los tejidos que tienen la capacidad totipotente y por tanto de generar clones? Si es así, existe algún modo de seleccionar este tipo de células? o, pensando en otros términos, existe alguna manera para hacer que una proporción mayor de células se vuelvan adecuadas para la clonación? Las células donantes de núcleos se emplean directamente, es decir, recién obtenidas del animal, o después de un cultivo celular. No se ha puesto demasiado énfasis hasta el presente en la posibilidad de utilizar células somáticas preservadas por congelación, aunque esto constituiría una enorme ventaja a la hora de almacenar o transportar células, como por ejemplo en el caso de especies en peligro de extinción. Los óvulos, a su vez, se obtienen mediante tratamiento de superovulación de hembras donantes y se emplean inmediatamente, aunque se ha comenzado a explorar la posibilidad de emplear óvulos conservados mediante congelación. Quedan todavía muchas preguntas por responder en relación a los procesos básicos de reprogramación de los núcleos, y a factores técnicos involucrados en el éxito de la clonación. Tal vez no exista un único protocolo adecuado de clonación que funcione en todas las especies porque las características de los óvulos y de las células donantes de núcleo difieren entre las especies animales. Un método que funciona adecuadamente con una especie puede no funcionar bien con otra y, por ello, los aspectos técnicos tendrán que adaptarse a cada especie. Esto a su vez constituye una oportunidad para comprender mecanismos fundamentales de control del desarrollo embrionario que abrirá las puertas a un nuevo período de investigaciones en biología del desarrollo. donante de óvulos trasplante a nodrizas eliminación de cromosomas trasplante de núcleos desarrollo in vitro donante de células somáticas células somáticas Clonación mediante transferencia de núcleo. Se emplean núcleos provenientes de fibroblastos (o de otras células) de un animal donante que se transfieren a óvulos a los que previamente se les ha extraído el material genético nuclear. Las construcciones resultantes se activan mediante estímulos químicos o eléctricos, los embriones se cultivan in vitro y se tranfieren a nodrizas que llevan adelante la gestación de los clones. 3

5 Clonación en animales y aplicaciones potenciales Emilio Martínez Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia. El término clon puede ser definido como una réplica genética exacta de una molécula de ADN, de una célula, tejido u órgano o de un organismo vegetal o animal completo. Un clon también puede ser considerado como aquel ser vivo que tiene el mismo genoma nuclear que otro organismo. En la actualidad el método mediante el cual se podría obtener un número ilimitado de animales genéticamente idénticos es el de la transferencia nuclear (NT), método mediante el cual nació la famosa oveja Dolly. La clonación animal mediante NT implica varias etapas: 1) utilización de ovocitos maduros como células receptoras; 2) extracción de los cromosomas del ovocito (enucleación); 3) transferencia del núcleo de la célula obtenida desde el animal que se desea clonar dentro del ovocito enucleado; 4) activación del embrión resultante para que se inicie el desarrollo embrionario; 5) cultivo in vitro del embrión y 6) transferencia de los embriones clonados a las hembras receptoras para que se desarrolle la gestación a término. Las técnicas que son requeridas para llevar a cabo cada una de estas etapas y la eficiencia de cada una de ellas varían entre las diferentes especies, lo que determina el grado de dificultad con que una especie animal en concreto puede ser clonada. Sin embargo, la especie es solamente una variable de las numerosas que pueden afectar al éxito de la clonación para reproducir un genotipo específico. Otra sería el origen de la célula donante, embrionario, fetal o adulto, usada para NT. Hasta la fecha, la eficiencia de la transferencia nuclear utilizando células somáticas, en base al desarrollo a término en relación con el número de ovocitos reconstruidos, es muy baja (1-2%). Además, se han observado diversas anormalidades en la descendencia, incluyendo disfunciones placentarias, reabsorciones embrionarias tempranas y pérdidas fetales, defectos del tracto urogenital, irregularidades respiratorias y cardiovasculares, etc., que en un porcentaje significativo de casos ocasionan la muerte a los pocos días del nacimiento. Uno de los objetivos principales de las investigaciones sobre clonación animal ha sido desarrollar un método para propagar animales de elevado valor genético. Esto es de suma importancia principalmente en el ganado vacuno, donde el intervalo generacional es largo y la tasa reproductiva baja. Una segunda razón de importancia para desarrollar las técnicas de clonación radicaría en la obtención de animales genéticamente manipulados. Las células donantes pueden ser genéticamente manipuladas y obtener animales transgénicos de indudable interés para la ganadería y la salud humana (mejora de caracteres productivos en los animales, animales más resistentes a las enfermedades, animales como modelos de enfermedades humanas de componente genético, animales para la obtención de proteínas terapéuticas humanas y animales generadores de órganos para ser incluidos en los programas de transplante de órganos en la especie humana). Estos animales transgénicos podrían, a su vez, ser clonados por NT y establecer poblaciones clónicas a partir de los animales transgénicos previamente seleccionados. Aunque la eficacia de las técnicas de clonación es todavía escasa, los descubrimientos efectuados en los últimos años han provocado una tremenda expansión de esta tecnología, la cual puede formar parte de la producción animal en 4

6 pocos años. Sin duda, la capacidad para clonar un animal de una especie dada dependerá en gran medida del número de programas de investigación enfocados específicamente sobre esa especie. Con los avances que se alcancen, la posibilidad de clonar un animal dependerá, posiblemente, de la perseverancia. Clones y animales transgénicos 5

7 La biología del embrión humano y el impacto de la clonación Montserrat Boada Servicio de Medicina de la Reproducción, Instituto Universitario Dexeus, Barcelona. Desarrollo embrionario La formación de un embrión se inicia con el proceso de fecundación. La unión de un espermatozoide y un ovocito da lugar a un cigoto que tras el adecuado desarrollo embrionario originará un nuevo individuo, genéticamente único, resultante de la combinación de los genomas paterno y materno. En condiciones in vitro, la penetración del espermatozoide en el ovocito se produce a las 3-4 horas de coincubación, a diferencia de lo que ocurre si se utiliza la técnica de microinyección espermática en que ésta es inmediata. Aproximadamente a las 20 horas post inseminación, se observa en el centro del ovocito, la presencia de los dos pronúcleos (masculino y femenino), morfológicamente indistinguibles. Desde el punto de vista morfológico, la fecundación no se completa hasta haberse producido la primera división embrionaria ya que en la especie humana al igual que en otras especies de mamíferos, los dos pronúcleos se disponen muy próximos entre sí pero sin llegar a fusionarse. Se produce sincronización metafásica pero no singamia. Es al inicio de la primera división embrionaria cuando desaparecen las membranas de los pronúcleos y se sitúan los dos complementos cromosómicos en la misma placa metafásica. Embrión humano, fecundado in vitro, en su tercer día de desarrollo embrionario 6

8 Al tercer-cuarto día de desarrollo embrionario el embrión alcanza el estadio de mórula (16-32 células). Hasta este momento, las células aun no están diferenciadas y son totipotentes. A continuación se produce la compactación y la formación del blastocisto. Este consta de aproximadamente células y se compone de dos líneas celulares distintas: la masa celular interna y el trofectodermo. La masa celular interna dará lugar al embrión, la vesícula vitelina y parte de las membranas amnióticas (amnios) y el trofectodermo originará el corion. La implantación es el proceso mediante el cual se establece contacto celular especializado entre el trofoblasto del embrión y la capa interna del útero o endometrio. Se considera que se inicia el embarazo a partir del momento de la implantación (día 6-7 de desarrollo embrionario). En los procesos de fecundación in vitro (FIV), se ha observado que la principal causa de los fallos de implantación es la interrupción temprana del desarrollo embrionario. Se estima que menos del 50% de los ovocitos fecundados alcanzan el estadio de blastocisto siendo la tasa de implantación inferior al 25%. La interrupción del desarrollo se produce frecuentemente en el estadio de 8 células o estadios precoces y pueden existir distintos factores responsables de ello. Alteraciones morfológicas tales como la fragmentación citoplasmática, la división asincrónica o la degeneración de las células, son frecuentemente observadas en los embriones preimplantacionales in vitro. Sin embargo, existen también alteraciones genéticas que no se manifiestan morfológicamente. La práctica de un diagnostico genético preimplantacional permite detectar embriones genéticamente anormales que en esta fase de desarrollo y únicamente basándonos en criterios morfológicos, se hubieran considerado como viables. En la actualidad pueden diagnosticarse algunas alteraciones génicas (mutaciones de uno o más genes que codifican para una determinada enfermedad) y cromosómicas, ya sean de tipo numérico (aneuploidias y poliploidias) o estructural (translocaciones, inversiones etc.). Estudios realizados mediante estas técnicas ponen de manifiesto que aproximadamente un 60% de los embriones procedentes de pacientes con mal pronostico (edad avanzada y/o ciclos previos de FIV fallidos) son genéticamente anormales. Alrededor del día 14º de desarrollo embrionario se forma la línea primitiva y aparecen los primeros elementos del sistema nervioso. Es a partir de ese momento cuando el embrión puede considerarse como una entidad separada de las membranas extraembrionarias y asimismo corresponde al último estadio en que pueden producirse gemelos monocigóticos. Clonación y Reproducción Asistida Las técnicas de reproducción asistida tienen como finalidad principal el tratamiento de la esterilidad. Algunos autores plantean la posibilidad de incorporar técnicas de clonación como un tratamiento más de reproducción asistida. Las posibles aplicaciones de la clonación en este campo estarían encaminadas a incrementar el número de embriones disponibles en mujeres de baja respuesta a la estimulación ovárica o cuando el número de embriones sanos es escaso. En estos casos, la técnica de partición o separación de blastómeros sería la indicada. 7

9 La clonación mediante transferencia de núcleo se ha planteado también como una opción reproductiva en aquellos individuos que pretenden la clonación de uno mismo (personas solas, parejas homosexuales o parejas heterosexuales con o sin problemas de esterilidad) o de otra persona (mujeres menopausicas que no aceptan donación de ovocitos, mujeres homosexuales que no aceptan inseminación de donante, parejas estériles, personas que desean clonar algún ser fallecido etc.). Sin entrar en consideraciones éticas y legales, y considerando únicamente el aspecto científico, la posibilidad de aplicar dicha tecnología para tales efectos dista mucho de ser posible en la actualidad. Las técnicas de reproducción asistida generan embriones que por no ser transferidos al útero de la mujer en el propio ciclo se guardan congelados a la espera de su utilización en ciclos posteriores. Sin embargo, situaciones imprevistas pueden afectar el futuro de dichos embriones. La falta de un proyecto parental por parte de los progenitores y la no aceptación, en algunos casos, de su donación a terceros con fines reproductivos plantea la posibilidad de utilizar dichos embriones para investigación como alternativa a su destrucción. La donación de estos embriones para investigación podría emplearse tanto para optimizar las propias técnicas de reproducción asistida como para lo que se conoce como clonación terapéutica. La utilización de dichos embriones en proyectos de investigación para la creación de stem cells o líneas celulares establecidas para el desarrollo in vitro de células y tejidos diferenciados es una de las principales reivindicaciones que la comunidad cientifica tiene en la actualidad. 8

10 Células madre y clonación Franz Martín Bermudo Instituto de Bioingeniería, Universidad Miguel Hernández, Alicante. Las células madre pluripotenciales son líneas celulares indiferenciadas que poseen la capacidad de originar casi cualquier tipo celular del organismo y de crecer de un modo indefinido cuando se cultivan en el laboratorio. Estas dos características las hacen muy importantes para la investigación básica y aplicada. En este sentido, se pueden utilizar para el estudio de los procesos básicos que tienen lugar en el desarrollo de un embrión y como fuente de tejidos para sustituir a aquellos que estén dañados. Las fuentes de células madre pueden ser diversas. Según su origen, las células madre se pueden clasificar en: (i) embrionarias (ES), cuando proceden de la masa celular interna de un embrión en fase de blastocisto; (ii) germinales (EG), obtenidas de las gónadas de fetos; (iii) carcinogénicas (EC), derivadas de tumores de la línea germinal, y (iv) adultas (AS), procedentes de tejidos ya maduros. Finalmente, las células madre embrionarias difieren en cuanto al origen del embrión. Este puede proceder de blastocistos congelados, sobrantes de procesos de fecundación in vitro, o de técnicas de transferencia nuclear. En este último método, el núcleo de una célula somática de un paciente se introduce en un óvulo enucleado y se le deja desarrollar in vitro hasta la fase de blastocisto. Una alternativa a esta última aproximación consiste en introducir el núcleo de una célula somática en el citoplasma de una célula ES. Precursores neurales obtenidos a partir de células ES de ratón. 9

11 La aplicación más importante que actualmente poseen en medicina las células madre es la de restaurar la función de un tejido dañado mediante su trasplante. El problema que plantean las células ES obtenidas de procesos de fecundación in vitro es el de su rechazo tras el trasplante, pues las células ES humanas, a medida que se van diferenciando, van expresando antígenos de histocompatibilidad de clase I. Por lo tanto, la obtención de células ES mediante transferencia nuclear permite trasplantar a un paciente líneas de células ES perfectamente compatible inmunológicamente, evitándose la administración de drogas inmunosupresoras y el posible rechazo de las células trasplantadas. 10