PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES DE PROTEÍNAS DE PASTA DE AJONJOLÍ

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3 PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES DE PROTEÍNAS DE PASTA DE AJONJOLÍ Aguilera BA b, Díaz ZLE a, Reis STC b, Gómez SJG b, Mariscal LG c, Gasca GT b, Bernal SMG b a Licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Ciencias Naturales,. Universidad Autónoma de Querétaro., b Doctorado en Ciencias Biológicas. Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro., b Instituto Nacional de Investigaciones Forestales y Agropecuarias. RESUMEN La producción de anticuerpos monoclonales y policlonales es fundamental para una gran variedad de técnicas experimentales en casi todas las disciplinas científicas. El adyuvante más empleando en la producción de anticuerpos es el de Freund, el cual se suministra junto con el antígeno, sin embargo, es extremadamente inflamatorio y puede causar reacciones anafilácticas. Por lo que el objetivo de este trabajo fue producir anticuerpos policlonales contra proteínas específicas de la pasta de ajonjolí (PA) empleando como adyuvante la acrilamida. La PA desgrasada se sometió a una extracción de albúminas y globulinas, se liofilizó el extracto y se separaron las proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Las bandas correspondientes a 62, 36, 15 y 14 kda de los geles de poliacrilamida se recortaron y se homogeneizaron en 1.5 ml de PBS a ph 7.4. Con este extracto de proteínas antigénicas-acrilamida se inmunizaron intradérmicamente cuatro

4 conejos de raza Nueva Zelanda durante cuatro semanas en intervalos de una semana. En cada semana se realizó un sangrado de la vena marginal de la oreja, previa a cada inmunización para determinar la titulación de anticuerpos mediante el procedimiento de Dot-Blot, usando como control el suero pre-inmunización de cada conejo. Para determinar la presencia de anticuerpos en los sueros obtenidos se hizo uso de un anticuerpo de burro contra un anticuerpo de conejo de uso comercial. El uso de acrilamida como adyuvante dio buenos resultados en la producción de anticuerpos policlonales de proteínas específicas de PA, así como una menor inflamación en el dorso de los conejos durante el proceso de inmunización comparado con experiencias previas, favoreciendo un mayor bienestar al animal. Un uso directo de éstos anticuerpos será en el análisis del proceso de digestión de las proteínas específicas de la PA en diferentes compartimentos digestivos de lechones alimentados con dietas conteniendo PA mediante Western Blot. INTRODUCCIÓN Es importante conocer la digestibilidad de las proteínas en los diferentes compartimentos digestivos, para lo cual es necesaria la elaboración de métodos experimentales que nos permitan corroborar más precisamente la cinética digestiva de ciertas proteínas que aparentan ser más resistentes a la digestión durante su trayecto por el sistema digestivo. Por tanto, es necesario contar con anticuerpos específicos contra proteínas de alimentos proteicos para su posterior empleo en la determinación de presencia o ausencia de las mismas a lo largo de los diferentes compartimentos digestivos de los animales en diferentes tiempos después del consumo de una dieta (Rivest et al., 2000; Salgado et al., 2002). La producción de anticuerpos monoclonales y policlonales es fundamental para una gran variedad de técnicas experimentales en casi todas las disciplinas científicas. Los adyuvantes se emplean con frecuencia para reforzar la reacción inmunitaria cuando un antígeno tiene inmunogenicidad baja o sólo se dispone de cantidades pequeñas de él. Una respuesta de anticuerpos se cuantifica determinando la concentración de anticuerpo que existe en el suero de animales inmunizados. El adyuvante más empleado en la producción de anticuerpos es el adyuvante de Freund, el cual puede causar reacciones anafilácticas. Este contiene antígeno en solución acuosa, aceite mineral y un agente emulsificador, como monooleato de manida, que dispersa el aceite en gotitas pequeñas que rodean al antígeno; a continuación, este último se libera con gran lentitud del sitio de inoculación. Sin embargo el adyuvante de Freund ocasiona una respuesta muy fuerte provocando lesiones secundarias a los animales (Kindt et al., 2007). El objetivo del presente trabajo fue producir anticuerpos policlonales contra proteínas específicas de la pasta de ajonjolí (PA) empleando como adyuvante la acrilamida. MATERIAL Y MÉTODOS. Para determinar las proteínas específicas sobre las que se producieron los anticuerpos policlonales, se realizó la separación electroforética de proteínas contenidas en las digestas de estómago, duodeno, yeyuno e íleon de lechones alimentados con dietas incluyendo pasta de ajonjolí a diferentes horas postconsumo (3, 6, 9 y 12 h). Las muestras de digesta se desgrasaron en frío con metanol-cloroformo (Folch et al., 1957) y se desnaturalizaron con dodecilsulfato de sodio (SDS) contenido en el buffer de carga y calentándolas en baño maría a ebullición durante 5 min. Las fracciones de proteínas de las muestras de digesta se separaron mediante una electroforesis SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) (Laemmli, 1970) a una concentración de acrilamida de 14% para poder evaluar las proteínas de alto y bajo peso molecular respectivamente. Las electroforesis se corrieron a 120 V. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie R-250 y se digitalizaron mediante un fotodocumentador Bio-Rad para analizar los geles

5 por medio del programa Quantity One de Bio-Rad para estimar el peso molecular (PM) de las proteínas que conforman cada fracción proteica en la PA, comparando su movilidad electroforética con la de un estándar de PM de proteínas de amplio espectro ( Bio-Rad): miosina (200 kda), β-galactosidasa ( kda), fosforilasa b (97.4 kda), albúmina sérica (66.2 kda), Ovoalbúmina (45 kda), anhidrasa carbónica (31 kda), inhibidor de tripsina (21.5 kda), lisozima (14.4 kda) y aprotinina (6.5 kda). Al analizar los geles se identificaron 4 bandas proteicas (64, 36, 15 y 14 kda) que se observaron desde el estómago hasta el íleon a diferentes horas posconsumo, lo que indica que no son digeridas. Teniendo estas bandas ya identificadas, se procedió a separar electroforéticamente las proteínas de la PA desgrasada y desnaturalizada con SDS como anteriormente se describió. Se cargaron 20 μg de proteína soluble (Bradford, 1976) de la PA en cada pozo del gel de acrilamida al 14%. Las bandas de los geles se evaluaron para estimar el peso molecular (PM) de las proteínas que conforman cada fracción proteica en la pasta (Figura 1). Las bandas correspondientes a 14, 15, 36 y 64 kda se cortaron con bisturí. De 3 a 4 bandas de cada peso molecular se cortaron por cada inmunización y se homogeneizaron en 1.5 ml de PBS con un ph de 7.4. El extracto homogeneizado de proteínas antigénicas más acrilamida se utilizó para inmunizar cuatro conejos raza Nueva Zelanda de 3 meses de edad alojados en jaulas separadas. La inmunización se llevó a cabo de manera intradérmica en la parte dorsal de los animales durante cuatro semanas en intervalos de una semana. La acrilamida sustituyó al adyuvante de Freund para producir los anticuerpos a las fracciones proteicas de la PA, para evitar una inflamación excesiva y dolorosa para los conejos. El día cero se realizó un sangrado de la vena marginal de la oreja de cada conejo previo a la inmunización el cual se tomó como control en el Dot-Blot, posteriormente cada semana se realizó un sangrado previó a la inmunización. Una vez que concluyó el tiempo de los sangrados se sacrificaron los conejos de forma humanitaria por desnucamiento seguido de su exanguinación para obtener la mayor cantidad de suero conteniendo los anticuerpos producidos. Posteriormente se midió la titulación de los anticuerpos en los diferentes sueros de los 4 conejos empleando la técnica de Dot-Blot y el uso de un anticuerpo comercial producido en burro contra anticuerpo de conejo (A P Bethyl Labs), para definir el suero y la concentración del mismo a usar en la determinación de las proteínas específicas de la PA. Ya definidas estas variables, se probaron los anticuerpos producidos en un Western Blot de PA empleando un estándar de PM Kaleidoscopio ( Bio-Rad). kd 66.2 Estándar de albúmina sérica 64 kda kda (66.2 kda) kda 14 kda Figura 1. Perfil electroforético de PA

6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tras la realización de la técnica de Dot-Blot (Figura 2) se determinó que el suero obtenido del conejo con mayor respuesta inmunológica, en su último sangrado, fue el que presentó una mayor titulación de anticuerpos contra las proteínas de la PA, por lo que se determinó emplearlo en la técnica de Western Blot en una relación 1:50 [anticuerpo (primero) obtenido por la inmunización de los conejos: buffer de bloqueo] y 1:2000 [anticuerpo (segundo) anticonejo comercial: buffer de bloque] por ser la más económica y con mayor resolución. 1:1000 1:2000 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:4000 1:8000 Figura 2. Dot-Blot del anticuerpo de proteínas específicas de PA en el conejo con mayor respuesta inmunológica. En la prueba realizada en una muestra de PA se observó claramente la presencia de las bandas correspondientes a 14 y 64 kda y levemente la de 15 y 36 kda (Figura 3). De manera similar, en un estudio realizado por Chen et al., 1998 obtuvieron anticuerpos de proteínas específicas de cuerpos oleosos (27, 37 y 39 kda), de oleínas de 15 kda y de la subunidad 1S de 23 kda de proteínas de reserva de semilla de ajonjolí empleando el adyuvante de Freund en gallinas, obteniendo exitosamente los anticuerpos en los huevos de las ponedoras. kda kda 64 kda kda 14 kda Figura 3. Western Blot de pasta de ajonjolí con el anticuerpo de proteínas específicas de PA

7 CONCLUSIONES La acrilamida sustituyó al adyuvante de Freund dando buenos resultados en la producción de anticuerpos para proteínas específicas de PA y ocasionando trastornos menores en los animales productores de los anticuerpos, mejorando su calidad de vida. La obtención de anticuerpos para proteínas específicas de PA será fundamental en la valoración de la digestión de estas proteínas en los diferentes compartimentos digestivos de lechones alimentados con dietas conteniendo PA mediante la técnica de Western Blot. Un uso directo de éstos anticuerpos será el análisis del proceso de digestión de las proteínas específicas de la PA en diferentes tiempos y compartimentos digestivos de lechones alimentados con dietas conteniendo PA mediante Western Blot. BIBLIOGRAFÍA Bradford M.M A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: Chen E.C.F., Tai S.S.K., Peng C.C., Tzen J.T.C Identification of three novel unique proteins in seed oil bodies of sesame. Plant Cell Physiol. 39: Folch J., Lees M., Stanley G.H.S A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 226: Laemmli H.K Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of Bacteriophage T4. Nature 227: Kindt T.J., Goldbsy R.A., Osborne B.A Inmunología de Kuby. 6 Edición, McGraw Hill. Rivest J., Bernier J.F., Pomar C A dynamic model of protein digestion in the small intestine of pigs. J. Anim. Sci.78: Salgado P., Montagne L., Freire J.P.B., Ferreira R.B., Teixeira A., Bento O., Abreu M.C., Toullec R., Lallès J.P Legume grains enhance ileal losses of specific endogenous serine-protease proteins in weaned pigs. J. Nutr. 132: Sesión Científica: Producción Medicamentos y Vacunas