EVALUACIÓN DEL ZOOPLANCTON COMO VECTOR DEL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV)

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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR ÁREA DE CONOCIMIENTOS DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA EVALUACIÓN DEL ZOOPLANCTON COMO VECTOR DEL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE: BIOLOGO MARINO PRESENTA: SUSANA BERENICE TERÁN DÍAZ DIRECTOR: M. EN C. JOSÉ FERNANDO MENDOZA CANO LA PAZ, B.C.S. NOVIEMBRE DE 2012

2 CONTENIDO Página RESUMEN.. i LISTA DE FIGURAS ii 1. INTRODUCCION ANTECEDENTES 3 3. JUSTIFICACIÓN AREA DE ESTUDIO HIPÓTESIS OBJETIVOS METODOLOGÍA Colecta de organismos. 18 Preparación del inoculo viral 18 Inoculación experimental en zooplancton.. 19 Inoculación viral experimental de Palaemon. 19 Inoculación viral experimental de Lysmata 20 Extracción de ARN 20 Eliminación de ADN genómico contaminante Cuantificación y determinación de pureza del ARN total 21 Detección de ADN genómico contaminante.. 21 Síntesis de cdna y detección de VP Identificación morfológica y molecular 22 Análisis de secuencias RESUTADOS. Identificación molecular 24 Detección de WSSV en organismos colectados.. 27

3 Detección de ADN genómico contaminante.. 29 Infección experimental en Calanus pacificus californicus Infección experimental en Palaemon ritteri 32 Infección experimental en Lysmata califórnica DISCUSIÓN CONCUSIONES RECOMENDACIONES LITERATURA CITADA... 42

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5 Dedicatoria A Dios por brindarme salud y por permitirme llegar a esta etapa tan importante en mi vida. A mis padres Jesús y Susana, por su incondicional apoyo, por quererme tanto, y aguantarme. Todo este trabajo ha sido posible gracias a ellos. A mis hermanos, Tito, Caleb, Diana y Dan, por hacerme reír todo el tiempo y por estar siempre conmigo. A mi esposo Adrián, por brindarme su apoyo y confianza, por quererme tal como soy.

6 Agradecimientos Agradezco al CIBNOR, que me brindó conocimientos y que me ayudo para el desarrollo de mi tesis. Agradezco de manera especial a mi director de tesis Fernando Mendoza Cano, gracias por toda su paciencia, esfuerzo y dedicación. Al Dr. Jorge Hernández López y al Dr. Arturo Sánchez, que me brindaron su sabiduría. A todos los integrantes del CIBNOR Campus Hermosillo, que me brindaron su ayuda. A mis maestros y revisores de tesis, gracias por su disponibilidad y paciencia.

7 RESUMEN El Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) ha ocasionado cuantiosas pérdidas económicas a la industria del cultivo de camarón. Este virus se describió por primera ocasión en Taiwán en 1992, y aparentemente fue introducido a Estados Unidos en 1995 a través de la importación de camarón congelado. Aunque el WSSV infecta una amplia gama de crustáceos, la identificación de especies susceptibles a la infección por este virus permitirá prevenir o limitar su dispersión. En base a lo anterior, mediante la infección experimental con WSSV, se determinó la susceptibilidad del copépodo Calanus pacificus californicus (principal componente encontrado en el zooplancton), Lysmata californica y Palaemon ritteri a WSSV. Los resultados demuestran que el WSSV posee la capacidad de infectar y replicarse en copépodos, L. californica y P. ritteri, esto basado en la detección de transcritos para VP28 a partir de las 48 horas post infección. En conclusión, los resultados demuestran la susceptibilidad del copépodo C. pacificus californicus, los organismos L. californica y P. ritteri a la infección con WSSV, colocando estos organismos en la lista de vectores potenciales de este virus. i

8 LISTA DE FIGURAS PÁGINAS Figura 1.- Morfología de la partícula viral de WSSV..6 Figura 2. Área de Estudio, Bahía de Kino, Sonora, Colecta de organismos (A).15 Figura 3. Electroforesis del fragmento 16s, de los organismos colectados, Marcador de peso molecular (M), L. californica (L), P. ritteri (P) y Copépodos (C) Figura 4. Análisis de las secuencia obtenidas de los organismos colectados pertenecientes a la clase copépoda (A) y (B) Calanus pacificus californicus (GenBank: AF ) Los puntos similitud entre secuencias. * indica inserción de nucleótido..25 Figura 5. Análisis de las secuencia obtenidas de los organismos palemonidos colectados (A) y Palaemon ritteri (B) (No. GenBank JF ). Los puntos indican similitud entre secuencias..26 Figura 6. Análisis de la secuencia obtenida de los organismos del género Lysmata colectados (A) y Lysmata californica (B) (GenBank: HQ ) Los puntos indican similitud entre secuencias..27 Figura 7. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qpcr para la detección del transcrito para VP28 en las muestras colectada de C. pacificus californicus (C), P. ritteri (P) y L. californica (L) Figura 8. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qpcr para la detección de ADN contaminante en las muestras colectada de C. pacificus californicus (C), P. ritteri (P) y L. californica (L) 30 Figura 9. Análisis de disociación de fragmentos generados por qpcr para la detección de transcritos para VP28 en las muestras colectadas de C. pacificus californicus, 24 horas (A), 48 horas (B) y 84 horas (C)...31 Figura 10. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qpcr para la detección de ARNm en las muestras colectada de P. ritteri, 24 horas (A), 48 horas (B) y 72 horas (C)..32 Figura 11. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qpcr para la detección de VP28 en las muestras de L. californica, 0 (A), 72 (B) y 48 hpi (C) 33 Tabla I. Hospederos de WSSV infectados experimentalmente o de forma natural..8 ii

9 INTRODUCCIÓN La acuicultura es una actividad que genera alimentos e ingresos a numerosos países del mundo. Esta actividad aporta beneficios sociales debido a que la pesca ha dejado de crecer desde los años 80 s y ha alcanzado su máximo rendimiento sostenible (FAO., 2010). El camarón es un crustáceo de gran importancia económica, es el producto pesquero más solicitado del mundo. Cada año se capturan 3.5 millones de toneladas métricas (TM) y se producen 2.4 millones TM mediante pesca y acuicultura respectivamente (FAO, 2010). Aunque existen diversos tipos de camarones de interés comercial que han sido cultivados alrededor del mundo (Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus californiensis, Feneropenaeus indicus, Penaeus monodon y L. vannamei), desde hace más de una década en México L. vannamei (camarón blanco del Pacifico) es la única especie de peneido producida mediante acuicultura, esto debido a sus cualidades zootécnicas (crecimiento, resistencia a enfermedades, fecundidad y adaptabilidad) (Cifuentes., 1999). Actualmente, los principales estados productores de camarón mediante acuicultura son Sinaloa, Sonora y Nayarit. La camaronicultura en México es la actividad pecuaria de mayor crecimiento durante los últimos diez años y ha aumentado de 23,000 a 142,170 TM en el periodo (CONAPESCA 2009), la región Noroeste del país (Sinaloa y Sonora) aportan el 80% del total de la producción. Aunque los datos antes mencionados demuestran el éxito de esta 1

10 actividad, es fundamental enfatizar que el rápido desarrollo de esta industria, y la intensidad con la que se realiza, han tenido como consecuencia la aparición de enfermedades exóticas o endémicas (Lightner 2011). Durante el desarrollo de la camaronicultura se han manifestado diversas enfermedades producidas por hongos, bacterias y virus (Morales y Cuellar 2008), siendo estas últimas las más devastadoras. La producción en Sonora durante los ciclos fue en promedio de 81,000 TM, sin embargo, en el ciclo esta producción se redujo un 60%, debido a la presencia del Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV, por sus siglas en inglés) (COSAES 2011). Actualmente no se disponen tratamientos contra este virus (Morales y Cuellar 2008), sin embargo, la filtración del agua que ingresa a los sistemas de cultivo, empleo de organismos libres de patógenos específicos y la eliminación de vectores, son estrategias que reducen el riesgo de entrada de este patógeno (Lightner & Redman 1998) La producción de camarón en México se realiza en ambientes cerrados y abiertos. El primero de ellos (cerrado) es llevado a cabo en los laboratorios de producción de larvas, en donde el abastecimiento de agua, alimento y organismos reproductores en la mayoría de las instalaciones se emplean estrictos controles sanitarios. Por otro lado, una vez que las postlarvas son introducidas a los estanques de engorda, son sometidas a un ambiente abierto en donde los organismos en cultivo comparten ambiente con diversos crustáceos (jaibas, 2

11 cangrejos y camarones silvestres), fitoplancton (microalgas) y zooplancton (copépodos y rotíferos) (OIE 2003). ANTECEDENTES Con el aumento de la camaronicultura se han manifestado enfermedades infecciosas, las cuales son causadas por hongos, parásitos, bacterias y virus (Morales y Cuellar 2008). Cuatro pandemias de virus han afectado negativamente a la industria mundial de camarones desde El Virus de la Necrosis Hipodérmica y Hematopoyética Infecciosa (IHHNV), Virus de la Cabeza Amarilla (YHV), Virus del Síndrome de Taura (TSV), y el Virus del Síndrome de Mancha Blanca (WSSV) ( Lightner 2003). Enfermedades virales del camarón: El Virus de Necrosis Hipodérmica y Hematopoyética Infecciosa (IHHNV), es el más pequeño de los virus conocidos en peneidos, tiene un diámetro de 22 nm (nanómetros), sin envoltura, con cadena sencilla de ADN, y su cápside se compone de cuatro polipéptidos, infecta casi todos los órganos y tejidos del camarón (Morales 2004) se ha sido clasificado como un miembro de la Familia Parvoviridae y un miembro del género Brevidensovirus (Gómez- Gill et al.,2001) Este virus fue detectado en 1981en Hawái, en juveniles de P. stylirostris, donde ha causado mortalidades por arriba del 90% (Tang y Lightner 2001). La mayoría de las especies de peneidos pueden resultar infectadas con IHHNV, incluyendo las 3

12 principales especies cultivadas, P. monodon, L. vannamei y L. stylirostris. La infección por IHHNV en el camarón azul del Pacífico (L. stylirostris), se caracteriza por causar epizootias aguda y mortalidades masivas (> 90%), en L. vannamei produce como enfermedad crónica el síndrome de la deformidad y del enanismo (RDS) donde los principales efectos son un crecimiento reducido e irregular y deformidades cuticulares (Lightner, 2002). El Virus de la Cabeza Amarilla (YHV), es un virus de ARN de cadena sencilla, de forma cilíndrica y varia en tamaño en un rango de 150 nm a 200 nm de longitud por 40 nm a 50 nm de ancho, posee envoltura, pertenece a la familia Roniviridae (OIE. 2003) Contiene tres proteínas estructurales presentes en los viriones en abundancia relativamente iguales, gp 116, gp 64 y p20 (Perlman el al., 2008) se inactiva por calentamiento a 60 C durante minutos, pero puede sobrevivir en temperaturas que oscilan entre los C en agua de mar al menos cuatro días (King et al., 2011). Los camarones infectados pueden mostrar una coloración amarillenta en el cefalotórax y en hepatopáncreas, y branquias blanquecinas (Morales y Cuellar 2008). Este virus fue reportado por primera vez al estar asociado con mortalidades masivas de P. monodon cultivados en Tailandia en 1990 (Walker y Subasinghe 2000), pero se ha demostrado experimentalmente que puede causar infecciones en otros camarones peneidos (L. vannamei, L. stylirostris, P. setiferus, P. aztecus y P. duorarum), sin embargo las postlarvas de P. merguensis no presentan ningún signo de la enfermedad (Morales y Cuellar 2008). 4

13 El Virus Del Síndrome De Taura (TSV), fue identificado en 1992 en granjas del río Taura, en Ecuador y posteriormente se esparció en América Latina y en la actualidad ha sido detectado en P. vannamei en cultivos de China (FAO 2005). Es un virus pequeño, consiste en una cadena sencilla de ARN de 9 kb (Gómez- Gill et al., 2001). Se ubica taxonómicamente como un miembro del género Cripavirus de la familia Dicistroviridae. (Mayo 2002). La mortalidad causada en L. vannamei, por el TSV han oscilado entre 40 a 90% en poblaciones cultivadas de postlarvas, juvenil y sub-adulto (Lightner 1996). Provoca lesiones severas en las células del epitelio del estomago, cuticular y de las branquias. En América latina este virus causó serias pérdidas en los ingresos de la década de los 90s, de 1-1,3 miles de millones de dólares EE.UU y en 1992, Ecuador representó una pérdida de hasta 400 millones de dólares EE.UU (FAO, 2005) El Virus del Síndrome de La Mancha Blanca (WSSV), fue detectado por primera vez en Taiwán en 1992, posteriormente se extendió a Japón y casi a todos los países asiáticos. El primer caso de WSSV en América ocurrió en 1995 en una granja de camarón al sur de Texas (Hasson et al., 2006). Los camarones infectados con WSSV desarrollan calcificaciones (manchas blancas) que van desde 0.5 hasta 3.0 mm de diámetro en el exoesqueleto, apéndices y dentro de la epidermis. Desde su aparición en 1992, el agente causal de esta enfermedad viral ha sido nombrado en varias maneras, pero se convirtió en una nueva familia llamada Nimaviridae (del género Whispovirus). 5

14 Las partículas virales de WSSV son de forma ovoide o bacilar con un diámetro de y nm de longitud, La envoltura viral es de 6-7 nm de espesor, la nucleocápside está compuesta por subunidades globulares de proteína de 10 nm de diámetro, con estrías verticales situadas cada 22 nm, dándole una apariencia estriada (Figura 1) (Escobedo-Bonilla et al., 2008 y Sánchez-Paz 2010). Figura 1.- Morfología de la partícula viral de WSSV (Sánchez-Paz 2010). El genoma del virus es una molécula de doble cadena de ADN circular de aproximadamente 300 kilobases (kb). Se han encontrado diferencias de 14 kb en los genomas de Tailandia, China y Taiwán (Sánchez-Paz 2010). El virus es viable por lo menos a 30 días a 30 C en agua de mar y en condiciones de laboratorio de 6

15 3-4 días, tiene un ciclo de replicación aproximadamente de 20 horas a 25 C (Chang et al., 1998), se distribuye a lo largo de Asia oriental, sudoriental y meridional, Norte, Sur y Centro América, y recientemente se han reportado brotes en Europa (EFSA 2007). El virus WSSV recibe su nombre, debido a que la infección puede inducir la disfunción del tegumento que resulta en la acumulación de sales de calcio dentro de la cutícula y dando lugar a manchas blancas. Otros signos de la enfermedad son: cambio de coloración a rojo en el cuerpo y apéndices, provocada por la expansión de los cromatóforos, letargo y reducción en el consumo de alimentos (Escobedo-Bonilla et al., 2008 y Sánchez-Paz 2010). Se han determinado más de 40 proteínas para el virus WSSV. Por lo menos 38 proteínas estructurales se han situado en el virión, de las cuales 21 forman parte de la envoltura viral, 10 se han ubicado como componentes de la nucleocápside y cinco en el tegumento (una estructura situada entre la envoltura y la nucleocápside (Escobedo-Bonilla et al., 2008). Las proteínas del virus son importantes ya que estas son las primeras moléculas que interactúan con el huésped (Tsai et al., 2006). Las más abundantes de la envoltura viral del WSSV son la VP28 y la VP26, lo que representa aproximadamente el 60%. Diversos estudios resaltan el importante papel de la proteína VP28, puesto que se ha sugerido que interviene como una proteína de unión del virus a las células del camarón, además de ayudarle a introducirse en el citoplasma. La proteína VP26 puede ayudar al WSSV 7

16 a moverse hacia el núcleo mediante la interacción con la actina (Sánchez-Paz 2010). Se han enlistado al menos 93 vectores u hospederos de WSSV (Tabla. I) que incluyen camarones peneidos, langostas, jaibas, cangrejos, langostinos, poliquetos, copépodos y rotíferos (Sánchez-Paz 2010). Además, se ha reportado la adhesión del WSSV a microalgas y es transportado por el zooplancton en la columna de agua, pero deben contener suficiente virus para inducir una infección en el camarón, (Esparza et al., 2009). Un estudio realizado con Artemia sp., sugiere la posibilidad de que este organismo puede ser un vector del WSSV (Zhang et al., 2009), al igual que el copépodo Nitocra sp. (Zhang et al., 2007). Resultados similares se han reportado con el rotífero Brachionus urceus (Zhang et al., 2006). Actualmente se reconoce que los organismos del plancton pueden ser portadores del WSSV, y se ha demostrado que tiene la capacidad de replicarse en el copépodo Apocyclops royi, en el cual encontraron los genes tempranos ie1 y los genes tardíos vp664 y VP28 (Chang et al., 2011). Tabla I. Hospederos de WSSV infectados experimentalmente o de forma natural. (tomado de Sánchez-Paz, 2010.) Orden Familia Especie Tipo de infección Anostraca Artemiidae Artemia sp. E A. franciscana E Calanoida Pseudodiaptomidae Schmackeria dubia N Decapoda Alpheidae Alpheus brevicristatus N A. lobidens N 8

17 Decapoda Astacidae Astacus astacus E A. leptodactylus E Pacifastacus leniusculus E Decápoda Calappidae Calappa lophos E C. philargius E Decápoda Callianassidae Callianassa sp N Decápoda Cancridae Cancer pagurus E Decápoda Cambaridae Orconectes limosus E O. punctimanus N Procambarus clarkii E Decápoda Dorippidae Paradorippe granulata E Decápoda Eriphiidae Menippe rumphii E Decápoda Grapsidae Grapsus albolineatus E Metopograpsus messor E y N Decápoda Leucosiidae Philyra syndactyla E Decápoda Lithodidae Lithodes maja E Decápoda Majidae Doclea hybrida E Decápoda Matutidae Matuta miersi N M. planipes N Decápoda Ocypodidae Gelasimus marionis nitidu N Macrophthalmus sulcatus N Uca pugilator E Decápoda Palaemonidae Exopalaemon orientis E Macrobrachium idella E M. lamarrei E M. rosenbergii E y N Palaemon adspersus E Decápoda Palinuridae Panulirus homarus E P. longipes E P. ornatus E P. penicillatus E P. polyphagus E P. versicolor E Decápoda Parastacidae Cherax destructor albidus E C. quadricarinatus E Decápoda Parathelphusidae Parathelphusa hydrodomous E P. pulvinata E Decápoda Parthenopidae Parthenope prensor E Decápoda Penaeideae Metapenaeus brevicornis E M. dobsoni E y N M. ensis E y N M. lysianassa N M. monoceros E Parapeneopsis stylifera N 9

18 Penaeus aztecus E y N P. chinensis E y N P. duorarum E y N P. indicus E y N P. japonicus E y N P. merguiensis N P. monodon E y N P. penicillatus E y N P. schmitti E P. semisulcatus E y N P. setiferus E y N P. stylirostris E y N P. vannamei E y N Trachypenaeus curvirostris E Decápoda Portunidae Callinectes arcuatus N C. sapidus N Carcinus maenas E Charybdis annulata N Ch. cruciata N Ch. granulata E Ch. feriatus N Ch. japonica N Ch. lucifera E y N Ch. natator E Liocarcinus depurator E Lio. puber E Podophthalmus vigil E Portunus pelagicus E y N P. sanguinolentus E y N Scylla serrata E y N S. tranquebarica E Thalamita danae N Decápoda Scyllaridae Scyllarus arctus E Decápoda Sergestidae Acetes sp. E y N Decápoda Sesarmidae Sesarma oceanica N Decápoda Solenoceridae Solenocera indica N Decápoda Varunidae Helice tridens N Pseudograpsus intermedius N Decápoda Xanthidae Atergatis integerrimus E Demania splendida E Halimede ochtodes E Liagore rubromaculata E Diptera Ephydridae Ephydrida sp N Stomatopod Squillidae Squilla mantis N 10

19 a Eunicida Eunicidae Marphysa gravelyi N Ploimida Brachionidae Brachionus urceus N N (infección natural) E (Infección experimental) En Sonora y Sinaloa, cerca de las zonas de cultivo, se han encontrado organismos silvestres con la presencia del WSSV, sin embargo no se conoce si su replicación se lleva a cabo en estos hospederos ya que la incidencia del virus aumenta con el brote de las granjas y disminuye al terminar el ciclo de cultivo (Mañon-Rios et al., 2010). Los virus, al carecer de mecanismos para su propia replicación, utilizan enzimas y precursores de la célula hospedero. Para que se lleve a cabo el proceso de infección viral ocurren una serie de eventos que inician con la adhesión y penetración de la partícula viral hacia el interior de la célula, y continua con el ingreso de la partícula viral al núcleo en donde se inicia el proceso de transcripción de los ARNm virales, (molécula sirve como molde para la síntesis de proteínas virales). A partir de la transcripción los virus requieren de algunos orgánelos celulares para traducir el ARNm en proteínas virales (proteínas implicadas en la activación de la expresión de genes tempranos y tardíos), enzimas necesarias para la síntesis del ADN viral y proteínas estructurales necesarias para el montaje del virión (Kasamatsu y Nakanishi 1998). El primer paso en el ciclo de replicación de un virus es la adhesión y la entrada a la célula, las proteínas de adhesión del virus deben ser capaces de unirse a los receptores de la superficie celular. Una vez adherido este debe atravesar la 11

20 membrana nuclear, luego el virus debe desensamblarse, eliminando o degradando la cápside para permitir que el genoma quede en el citoplasma, para la transcripción del ARNm y replicación del virus que está asociada con el ARN polimerasa. El ensamblaje, comprende el proceso por el cual se forma la partícula viral inmadura, y puede ser en el citoplasma, el núcleo o en la membrana plasmática. La maduración del virus ocurre cuando se vuelve infeccioso, las proteínas de la cápside sufren una escisión proteolítica para aumentar la estabilidad del virus, por último los virus formados se liberan al ambiente externo después de la lisis a través de la membrana plasmática (Shors 2009). 12

21 JUSTIFICACIÓN Los camarones en cultivo comparten el ambiente con diversos crustáceos, fitoplancton y zooplancton, siendo este último una fuente importante de alimento natural. Por tal motivo, es importante determinar si el Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV), tiene la capacidad de infectar y replicarse en el zooplancton. Generar este conocimiento permitirá determinar los posibles mecanismos de dispersión y de entrada del virus a los estanques. 13

22 ARÉA DE ESTUDIO El muestreo se llevó a cabo en Bahía de Kino, ubicado en las coordenadas meridianos Oeste y paralelos Norte, se encuentra sobre el lado oriental del Golfo de California, a 110 km al oeste de Hermosillo, Sonora, México (Grijalva-Chon y Barraza-Guardado 1991). Bahía de Kino se encuentra en un área de surgencia y parece presentar una productividad primaria constante (Moreno et al., 2005). El área de muestreo es la laguna costera La Cruz, localizada en los meridianos y Oeste, entre los paralelos y Norte, presenta un área de 2.3 km 2 y se encuentra separada por una barrera de arena de aproximadamente 3 km de longitud, del Golfo de California (Grijalva-Chon et al., 1996), con un clima semicálido, muy seco, con una temperatura promedio anual de 20 C y lluvias muy escasas (Valdez-Holguín 1993). Es importante señalar que Bahía de Kino alberga una de las principales zonas de producción de camarón, la cual, a partir del ha aportado en promedio el 24.5% de la producción total de camarón por acuicultura en el Estado de Sonora (COSAES 2011). Sin embargo, en el año 2011, Bahía de Kino disminuyó su producción un 70% con respecto al ciclo 2008 (16, TM) debido a la presencia de WSSV en los estanques de cultivo (COSAES 2011). 14

23 * * * * Figura 2. Área de Estudio, Bahía de Kino, Sonora, Colecta de organismos (A) modificado de (Rio Salas 2011). Los asteriscos señalan las diferentes zonas de producción de camarón. 15

24 HIPÓTESIS Si el Virus del Síndrome de la Mancha Blanca se replica en el zooplancton y en los crustáceos del género Lysmata y Palaemon, entonces estos organismos son susceptibles a la infección por el virus y por lo tanto pueden considerarse vectores potenciales de este patógeno. 16

25 OBJETIVO GENERAL Determinar si WSSV tiene la capacidad de infectar y replicarse en el zooplancton colectado en Bahía de Kino, Sonora. México. OBJETIVOS PARTICULARES Detectar mediante qrt-pcr la presencia de ARNm para la proteína estructural VP28 involucrada en el proceso de infección del virus de la mancha blanca en el zooplancton. Detectar mediante qrt-pcr la presencia de ARNm para la proteína estructural VP28 involucrada en el proceso de infección del virus de la mancha blanca en los organismos Palaemon sp. y Lysmata sp. Identificar a nivel especie los organismos colectados mediante el análisis de secuencia con el gen ribosomal 16S. 17

26 METODOLOGIA Colecta de organismos Se colectaron muestras de zooplancton con una red tipo bongo de 50 micras, los organismos colectados se transportaron con aireación constante a las instalaciones del CIBNOR campus Hermosillo y se colocaron en contenedores de plástico con agua marina a 35 ppm, se mantuvieron a 28 C y se alimentaron diariamente con una mezcla de microalgas (Chaetoceros, Dunaliella, Tetraselmis). Adicionalmente, organismos del género Palaemon sp., y Lysmata sp se colectaron con una red de acuario. Estos organismos se transportaron a las instalaciones del CIBNOR campus Hermosillo y se mantuvieron por separado en contenedores de plástico con agua marina a 35 ppm, a temperatura 29 C, aireación continua, y se alimentaron con alimento comercial balanceado para camarón, una vez al día. Preparación del inoculo viral A partir de un organismo naturalmente infectado con WSSV se preparó el inoculo viral de acuerdo a la siguiente metodología. En una licuadora se colocó tejido muscular con solución salina fisiológica (SSF). Posteriormente, el tejido se homogeneizó durante 30 segundos en baño de hielo. A continuación, la suspensión obtenida fue transferida a microtubos de1.7 ml y se centrifugó a 3,000 x g durante 20 min a 4 C. El sobrenadante fue transferido a tubos nuevos y se centrifugaron, una vez más, a 13,000 x g durante 20 min a 4 C. El sobrenadante 18

27 colectado se filtró a través de una membrana (Acrodisc) de 20 μm y colectado en un tubo de plástico de 15 ml y almacenado a -80 C hasta su utilización Inoculación experimental de zooplancton Para la inoculación de estos organismos, se emplearon las técnicas descritas por Zhang et al., 2008, la cual se fundamenta en la ingesta de virus adheridos a microalgas. Para realizar la adhesión del virus a las microalgas, se homogeneizaron durante 30 min 50 ml de microalgas (Chaetoceros, Dunaliella, Tetraselmis) con 5 ml de inoculo viral y posteriormente con esta mezcla se alimentaron los organismos. Los organismos del zooplancton fueron colectados mediante una red de 50 micras a las 24, 48 y 84 horas post-inoculación (hpi). Todos los organismos colectados fueron almacenados a -80 C hasta su posterior análisis. Inoculación viral experimental de Palaemon. Debido al tamaño de los organismos, una fracción del tejido utilizado en la preparación del inoculo, se maceró y se suministró a los acuarios conteniendo 60 organismos del genero Palaemon sp. Durante el desarrollo experimental, la colecta de los organismos se realizó a las 24, 48, 72, hpi. Todos los organismos colectados fueron almacenados a -80 C hasta su posterior análisis. 19

28 Inoculación viral experimental de Lysmata. Los organismos del genero Lysmata, fueron inoculados por vía intramuscular, para lo cual se inyectaron mediante una jeringa de 1 ml, 50 µl del inoculo viral entre el tercer y cuarto segmento abdominal. Adicionalmente fueron inoculados organismos con solución salina fisiológica (SSF) como organismos controles. Para los análisis posteriores fueron colectados cinco organismos a las 48 y 72 hpi y almacenados a -80 C hasta su análisis. Extracción de ARN La extracción de ARN se realizó a partir de los organismos colectados utilizando el método TRIzol LSReagent, iniciando la homogenización de la muestra con 750 µl de TRIzol por cada mg de tejido. La lisis del tejido se realizó con la ayuda de un pistilo de plástico estéril. A continuación, se agregaron 200 µl de cloroformo, se agitó vigorosamente durante 15 s, y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, la muestra se centrifugó a 12,000 x g por 15 min a 4 C. A continuación, la fase acuosa (conteniendo el ARN), fue transferida a un nuevo tubo, y se agregaron 500 µl de alcohol isopropilico y se incubó por 10 min a temperatura ambiente. Una vez transcurrido este periodo, la muestra se centrifugó a 12,000 x g durante 10 min a 4 C. El pellet formado en la centrifugación anterior, se resuspendió en 1 ml de etanol al 75% (4 C) y se centrifugó a 7,500 x g por 5 min a 4 C. El sobrenadante fue desechado por decantación y el precipitado se secó invirtiendo el tubo sobre en papel absorbente 20

29 por 10 min. La muestra se resuspendió agregándole 50 µl de agua DEPC e inmediatamente después incubado a 55 C por 10 min. Eliminación de ADN genómico contaminante. Los aislados de ARN fueron tratados con DNAasa (Invitrogen), incubando durante 15 min un µg de ARN total, 1 µl 10X Buffer de reacción, 1 µl DNAasa (1 U/µL) y 10 µl agua DEPC. La inactivación de la DNAasa se realizó adicionando 1 µl de solución 25 mm EDTA. Cuantificación y determinación de la pureza del ARN total. Se determinó la concentración ARN total midiendo la absorbancia a 260 nm mediante el equipo NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) y se determinó el índice de pureza utilizando la relación 260/280. Por último, los diferentes aislados se conservaron a 80 C hasta su análisis. Detección de ADN genómico contaminante Para la detección del ADN correspondiente a VP28 del virus WSSV se utilizo la metodología descrita por Moser et al., (2012), mediante el kit iq SYBR Green Supermix y el par de primes VP28F (5 -CTGCTGTGATTGCTGTATTT y VP28R 5 - CAGTGCCAGAGTAGGTGAC). Las condiciones de amplificación que se utilizaron fueron las siguientes: 5 min a 95 C, 35 ciclos de PCR y detección (30 s a 95 C, 30 s a 60 C y 72 C 10 s). Posterior a la amplificación se realizó un análisis de disociación de los fragmentos amplificados por PCR. Este análisis se basa en la temperatura de fusión o Tm 21

30 (melting temperature) por sus siglas, corresponde a la temperatura en la cual el 50% de los fragmentos amplificados se encuentran en doble cadena de ADN. Cuando el ADN se separa, induce un decremento de la fluorescencia del producto de PCR. La curva de fluorescencia en función de la temperatura es transformada en sus derivadas negativas (-df/dt) formando gráficamente unos picos cuyo máximo es la Tm. La presencia del transcrito para VP28 se baso en aquellas muestras cuyo valor de Tm fue similar o igual al control positivo. Síntesis de cdna y detección de VP28 La síntesis de cdna a partir del ARNm que codifica la proteína VP28 del virus WSSV, se realizó mediante el kit iscript One-Step RT-PCR con SYBR Green y los primers VP28F y VP28R siguiendo el protocolo del fabricante. Posteriormente, la amplificación se realizo mediante la metodología antes descrita para la detección de VP28. Identificación morfológica y molecular La identificación morfológica de los organismos del zooplancton colectados, se realizó utilizando las claves de clasificación de los crustáceos (Bassedas 1947) y la Guía FAO para la identificación de especies para los fines de la pesca (Fischer et al, 1995). Para la identificación molecular de los organismos se aisló ADN genómico mediante una matriz de sílica (Glass milk, MP biomedicals) y se cuantificó (nanodrop). 22

31 Posteriormente se amplificó, mediante PCR, un fragmento del gen 16S ribosomal utilizando el kit puretaq Ready-To-Go y los primers 16SAR (5'- CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3' y 16SBR 5'-ATTCAACATCGAGGTCACAAAC- 3') reportados por Lindeque et al., La amplificación se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial (5 min. a 95 C), 35 ciclos de 45 seg. 95 C, 45 s 50 C y 45 seg 72 C. Finalmente, con una extensión final de 10 min a 72 C. El equipo utilizado fue un termociclador TECHNE TC-412. Posteriormente, se realizó el análisis electroforético mediante un gel de agarosa al 1.2% (E-Gel con Syber Safe TM de Invitrogen), un transiluminador de luz ultravioleta (UVP ) y un sistema de documentación de imágenes digital (Kodak Imaging System). Los productos de PCR fueron purificados mediante el kit GFX TM PCR DNA and Gel Band de illustra TM, siguiendo las especificaciones del fabricante, y enviados a secuenciar al Instituto de Biotecnología (UNAM). Análisis de secuencias Las secuencias obtenidas de los diferentes organismos fueron sometidas a un análisis de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, por sus siglas en ingles), en donde se determinó el porcentaje de similitud con los diferentes registros de secuencias reportadas en National Center for Biotechnology Information (NCBI), (Altschul et al., 1990). 23

32 RESULTADOS En base a sus características morfológicas se identificaron los diferentes organismos colectados y empleados en los experimentos. El grupo de los copépodos fue el más abundante (98%) en la muestra colectada. Estos organismos (copépodos) fueron los utilizados en la realización del bioensayo de infección. Por otro lado, se logró la identificación de los organismos de la especie Palaemon ritteri y Lysmata californica Identificación molecular Mediante la utilización de los primers 16SAR reportados por Lindeque et al., 1999, se amplificó un fragmento de 550 pares de bases (pb) a partir de cada una de las muestras de los copépodos, P. ritteri y L. californica empleados en los diferentes bioensayos (Fig.3). pb M L P C 500 pb Figura 3. Electroforesis del fragmento 16s, de los organismos colectados, Marcador de peso molecular (M), L. californica (L), P. ritteri (P) y Copépodos (C) 24

33 Posterior al proceso de purificación y secuenciación, cada una de las secuencias obtenidas fue sometida a un análisis de BLAST. Este análisis se observó que los organismos de la clase copépoda presentan en su secuencia un grado de identidad del 99% con Calanus pacificus californicus (GenBank: AF ). Figura 4. Análisis de las secuencia obtenidas de los organismos colectados pertenecientes a la clase copépoda (A) y (B) Calanus pacificus californicus (GenBank: AF ) Los puntos similitud entre secuencias. * indica inserción de nucleótido. 25

34 El análisis de BLAST de la secuencia de obtenida de la amplificación de un fragmento del gen 16S de los organismos palemonidos presentan un grado de identidad del 98% con la secuencia perteneciente a Palaemon ritteri (GenBank: JF ). Figura 5. Análisis de las secuencia obtenidas de los organismos palemonidos colectados (A) y Palaemon ritteri (B) (No. GenBank JF ). Los puntos indican similitud entre secuencias. 26

35 Los organismos del género Lysmata presentan un grado de identidad del 99% con la secuencia perteneciente a Lysmata californica (GenBank: HQ ). Figura 6. Análisis de la secuencia obtenida de los organismos del género Lysmata colectados (A) y Lysmata californica (B) (GenBank: HQ ) Los puntos indican similitud entre secuencias. Detección de WSSV en organismos colectados Los resultados obtenidos indican que, la muestra de C. pacificus californicus (C), los organismos P. ritteri (P) y L. californica (L), se encontraban libres de WSSV al momento de su colecta y antes de realizarse la infección experimental con WSSV, esto basado en el análisis realizado mediante qpcr y la posterior gráfica generada por el análisis de disociación (Figura 7). 27

36 df /dt (+) C, P, L (-) Temperatura ( C) Figura 7. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qpcr para la detección del transcrito para VP28 en las muestras colectada de C. pacificus californicus (C), P. ritteri (P) y L. californica (L). En la figura 7 se ilustra que los fragmentos amplificados y pertenecientes al control positivo (+) presenta una temperatura de disociación de 85.8 C en comparación con los diferentes organismos colectados (C, P, L) los cuales no presentan fragmentos amplificado. 28

37 Detección de ADN genómico contaminante Aunque se empleó un kit para extracción de ARN y se utilizó DNAsa, existe la posibilidad que durante el proceso de aislamiento y purificación de ARN, pudiera contener ADN. La presencia de ADN en las muestras interferiría en la interpretación de resultados, ya que la detección de moléculas de ADN por PCR, indicaría la presencia del genoma. Sin embargo, la detección de ARN, elucidaría si el virus ha infectado y replicado en los diferentes organismos empleados en el estudio. El análisis realizado mediante qpcr y la posterior gráfica generada por el análisis de disociación (Figura 8), demuestran la ausencia de ADN viral contaminante en los aislados de ARN de las diferentes muestras de C. pacificus californicus (C), P. ritteri (P) y L. californica (L), esto sustentado por la ausencia de fragmentos amplificados. Adicionalmente, para garantizar que el qpcr se realizó correctamente, se incluyó una muestra positiva a WSSV (+). 29

38 df /dt (+) (C, P, L) (-) Temperatura ( C) Figura 8. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qpcr para la detección de ADN contaminante en las muestras colectada de C. pacificus californicus (C), P. ritteri (P) y L. californica (L). Infección experimental en Calanus pacificus californicus. Los resultados de la infección experimental en copépodos, basado en el análisis realizado mediante qpcr y la posterior gráfica generada por el análisis de disociación (Figura. 5), indican que, a las 24 hpi no se detectan transcritos para VP28. Sin embargo, en las muestras de copépodos colectadas a las 48 y 84 hpi, 30

39 df / dt se detectaron transcritos para VP28 demostrando que el virus se encuentra en fase de replicación en estos organismos al virus de WSSV. (+) (C) (B) (-) (A) Temperatura ( C) Figura 9. Análisis de disociación de fragmentos generados por qpcr para la detección de transcritos para VP28 en las muestras colectadas de C. pacificus californicus, 24 horas (A), 48 horas (B) y 84 horas (C) 31

40 Infección experimental en Palaemon ritteri En P. ritteri, se demostró la susceptibilidad de la especie a la infección experimental con WSSV. El análisis de disociación de fragmentos realizado mediante qpcr (Figura. 6), demuestra que tanto a las 48 como a las 72 hpi se detectan fragmentos amplificados a partir de transcritos que codifican la proteína VP28 y este presenta una temperatura de disociación de 83.4 C semejante a al control positivo. No se observaron productos de amplificación (o amplicones) en el control negativo. 32

41 df / dt (+) (C) (B) (-) (A) Temperatura ( C) Figura 10. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qpcr para la detección de ARNm en las muestras colectada de P. ritteri, 24 horas (A), 48 horas (B) y 72 horas (C) 33

42 df / dt Infección experimental en Lysmata californica Mediante el análisis de disociación de fragmentos realizado por la técnica de qpcr se demostró la susceptibilidad de L. californica a WSSV (Figura 11), en donde se demuestra que a las 48 y 72 hpi se detectó ARNm de fragmentos amplificados, pertenecientes a transcritos de la proteína VP28 en estos organismos. Los amplicones presentan una temperatura de disociación de 83.4 semejante a al control positivo. En cuanto al control negativo y el tiempo inicial (cero horas), no se observaron fragmentos amplificados. (+) (C) (B) (-) (A) Temperatura ( C) 34

43 Figura 11. Análisis de disociación de los fragmentos generados por qpcr para la detección de VP28 en las muestras de L. californica, 0 (A), 72 (B) y 48 hpi (C). DISCUSIÓN La acuicultura tiene como retos: satisfacer el incremento del consumo per-cápita de productos acuáticos, ofrecer alternativas para enfrentar el hambre en el mundo y abastecer la demanda de alimentos generada por el crecimiento de la población mundial (Magallón-Barajas et al., 2007). Los eventos epidémicos inducidos por la presencia de patógenos, particularmente los ocasionados por la presencia del virus de la mancha blanca han ocasionado profundas repercusiones económicas y sociales (Macías-Rodríguez et al., 2010). Es de suma importancia para esta actividad económica elucidar como los agentes patógenos que afectan a la camaronicultura penetran en los estanques de producción. Esparza-Leal et al., 2009, reportó que en fracciones líquidas y particuladas de 0.45 a 100 μm, el WSSV se detecta por PCR, indicando que el virus esta asociado con sub-poblaciones del plancton, tales como microplancton ( μm) y nanoplancton (2-20 μm). Diversos modelos de infección con WSSV han sido propuestos. Entre ellos se incluye la inmersión de camarones en agua marina conteniendo partículas virales (Chou et al., 1998; Chen et al., 2000). Adicionalmente, este patógeno puede infectar crustáceos al exponer partículas virales a fitoplancton (microalgas) y su posterior ingesta (Zhang et al., 2006, y Liu et al., 2007), En crustáceos, (Tan et al., 35

44 2001; Durant y Lightner 2002; Granja et al., 2006), reportan infecciones con WSSV vía la ingestión de homogenizados de tejido infectado (per os). La inyección de inóculos virales vía intramuscular es otro método empleado para lograr infecciones con WSSV en organismos (Dhar, et al., 2001, Huang, et al., 2001, Wu et al., 2002, You et al., 2010 y Moser et al., 2012). En el presente trabajo, debido principalmente al tamaño de los organismos, se emplearon diferentes métodos de infección: los copépodos fueron infectados mediante la ingesta de partículas virales de WSSV adheridos a microalgas, los organismos P. ritteri mediante el suministro de tejido infectado con WSSV a los contenedores, y los organismos pertenecientes al genero Lysmata fueron inoculados por inyección intramuscular. Los tres tipos de infección empleados en el presente trabajo lograron infectar a los organismos, esto basado en el resultado del análisis de qpcr en el tiempo 0 y la detección en las muestras de los organismos del ARNm para VP28 a partir de las 48 hpi. Se han reportado al menos 93 vectores u hospederos de WSSV que incluyen camarones peneidos, langostas, jaibas, cangrejos, langostinos, poliquetos, y diferentes componentes del zooplancton como artemia, cladóceros, rotíferos y copépodos (Sánchez-Paz, 2010). Sin embargo, es importante señalar que la detección por PCR de WSSV no confirma la susceptibilidad de los organismos al virus, esto debido a que la técnica se basa en la presencia o ausencia de fragmentos del genoma viral, es decir, el genoma del virus pudiera localizarse intracelularmente, en la superficie o en el contenido intestinal del animal. Para 36

45 poder confirmar una infección viral pudiera emplearse diversas técnicas como histología, hibridación in situ, o microscopía electrónica de transmisión. El presente trabajo, basado en que durante el proceso de infección de un virus, es necesario la producción de proteínas virales a través de la traducción de ARNm, la detección de esta molécula para la proteína estructural VP28 mediante PCR en este trabajo, indica que el virus infectó a los diferentes organismos experimentales (P. ritteri y L. califórnica y C p. californicus). Por lo cual los resultados de este estudio demuestran que las tres especies de crustáceos anteriormente mencionadas son susceptibles a la infección experimental con WSSV. Existe baja probabilidad de que P. ritteri y L. californica se encuentren en los estanques de cultivo de camarón, sin embargo es importante estudiar el efecto del virus en poblaciones silvestres de crustáceos ya que estos camarones son especializados en la limpieza de parásitos, como en la langosta espinosa de California (Panulirus interraptus) (Allen et a, 2006). Debido a que experimentalmente se reporta que diversas especies del género Panulirus son susceptibles al virus de WSSV (Sánchez-Paz, 2010) Los copépodos son el mayor y más abundante componente zooplanctónico en los estanques de cultivos de camarón y en el agua de mar, y con frecuencia son utilizados como alimento vivo de postlarvas de camarón durante el primer mes de la cría después de la siembra en el estanque (Reymond y Lagardere, 1990). Se ha demostrado que los copépodos pueden actuar como vectores mecánicos de patógenos bacterianos (Huq y Colwell, 1996). El primer registro que se tiene de 37

46 detección de WSSV en copépodos fue en Schmackeria dubia(overstreet et al., 2009). Sin embargo, no se ha establecido si el virus se replica y causa la enfermedad en estos organismos (Lo et al., 1996). Recientemente, Chang et al., (2011) demostró mediante la detección por RT-PCR de transcritos, que WSSV se replica en el copépodo A. royi. Los resultados en el presente experimento, coinciden con lo reportado por Chang et al., (2011), en el cual es posible la detección de mensajes que codifican la síntesis de proteínas virales, sin embargo es importante señalar que los resultados de la presente investigación en comparación con lo reportado por Chang et al., (2011), en donde señala la detección de transcritos para VP28 en el copépodo A. royi hasta las 24 hpi, en la especie de copépodo colectada en Bahía de Kino, se detectan mensajes en el muestreo realizado a las 48 hpi. Esta diferencia de 24 horas en la detección de los transcritos de VP28, pudieran deberse a la susceptibilidad de las diferentes especies utilizadas en los experimentales o al número de copias virales que contenía el inóculo. Reportes en peneidos, indican que la expresión de esta proteína (VP28), ocurre en las primeras 6 hpi (Zhang et al., 2002). Lotz y Lightner (1999) señalan que el agua es una vía para entrada de WSSV a una instalación de acuicultura. Otros estudios apoyan la hipótesis que diversos componentes del fitoplancton y zooplancton son portadores de WSSV, además, que pueden transportar partículas infecciosas de WSSV y, cuando son ingeridos por el camarón, son potencialmente infecciosos (Esparza-Leal et al., 2009). Martorelli (2010), señala la posibilidad que WSSV pueda ser transportado por corrientes marinas a través de hospederos reservorios o vectores mecánicos. 38

47 Las especies de microalgas Isochrysis zhanjiangensis (Zhang et al.,2006; Zhang et al.,2008; Zhang et al., 2010) I. galbana (Liu et al 2007; Chang et al., 2011) Platymonas subcordiformis (Zhang et al.,2008) Skeletonema costatum, Chlorella sp., Scrippsiella trochoidea, y Dunaliella salina (Liu et al 2007) se han propuesto como vectores mecánicos de WSSV, en el presente estudio, se demostró que las tres especies de microalgas empleadas en el experimento de infección de copépodos, Chaetoceros, Dunaliella, Tetraselmis, pudieran ser vectores de este patógeno, sin embargo es necesario realizar investigaciones acerca de la interacción de la adhesión del virus WSSV- microalgas, como el trabajo reportado por Jiang (2012) en el cual se demostró mediante hibridación in situ con fluorescencia la adhesión de WSSV a dinoflagelados Alexandrium tamarense y A. minutum. Recientemente se relacionaron los eventos epidémicos de WSSV y las corrientes marinas del Golfo de California, debido a que, los eventos de mortalidad en la costa noroeste de México, inician en el Estado de Nayarit y finalizando en el Estado de Sonora, es decir presentan un patrón hacia el interior del Golfo (Esparza-Leal 2010). Se ha reportado que la circulación de las corrientes marinas del Golfo de California es predominantemente estacional, el agua superficial entra al Golfo por el lado este, dirigiéndose hacia el Noroeste en la mayoría de los casos en verano, y durante el invierno, el flujo se dirige hacia el exterior por el lado de la península en dirección suroeste (Rosas-Cota 1977 y Jiménez et al., 2005). Rosas- Cota (1977) señala que las corrientes en el Golfo de California, se relacionan con la distribución espacio-temporal de las poblaciones de plancton. En base a lo 39

48 anterior, y a que el presente trabajo indica que los copépodos son organismos susceptibles a WSSV, es factible que su dispersión geográfica y en los estanques sea a través del zooplancton infectado. Existen reportes de WSSV en organismos silvestres (peces, jaibas, moluscos y camarones) que habitan en lugares adyacentes a la zonas de cultivo (Mañon-Rios et al., 2010). En la zona de Bahía de Kino, se encontró que P. ritteri, L. califórnica y copépodos son organismos susceptibles al virus, y que estos pudieran ser reservorios de este patógeno. 40

49 CONCLUSIONES El virus del Síndrome de la Mancha Blanca, posee la capacidad de infectar y replicarse en los copépodos C. pacificus californicus colectados en Bahía de Kino, Sonora. Esto basado en la detección de transcritos que codifican la proteína viral estructural VP28. Con base en la detección de transcritos de la proteína viral estructural VP28, el virus del Síndrome de la Mancha Blanca, infecta y se replica en los organismos Lysmata california y Palaemon ritteri colectados en Bahía de Kino, Sonora. Se demostró que al menos una especie de microalga (Chaetoceros, Dunaliella o Tetraselmis) empleada en el experimento de infección de copépodos, pudiera ser vector mecánico de este patógeno. 41

50 RECOMENDACIONES Debido a que los copépodos son el mayor y más abundante componente zooplanctónico en los estanques de cultivos de camarón y en el agua de mar, es necesario continuar con la búsqueda de especies de copépodos susceptibles a WSSV. Adicionalmente de copépodos, el zooplancton es constituido por larvas de moluscos, crustáceos, erizos, estrellas de mar, poliquetos, formas adultas de rotíferos y fases juveniles de peces. Por lo tanto realizar trabajos de susceptibilidad a WSSV en estos organismos aportaría o descartaría vectores potenciales de WSSV y alertaría un posible daño potencial a las poblaciones silvestres de estos organismos en el Golfo de California, México. 42

51 LITERATURA CITADA Allen L. G. Pondella, D.J, y M. H. Horn of marine fishes: California and adjacent waters. University of California Press. 660p Altschul S.F. Gish W., Miller W., Myers E.W. and Lipman D.J Basic local alignment search tool. Journal of molecular biology, 215(3), Brusca R. C Findley L. T, Hastings P. A, Hendrickx M. E, Torre J, van der Heiden A. M Macrofaunal biodiversity in the Gulf of California. En: Cartron JLE, Cevallos G,editors. Biodiversity, ecosystems and conservation in northern Mexico p.oxford: Oxford University Press; Castro-Longoria R. y Grijalva-Chon. J. M (1991. Variabilidad Espacio-Temporal de Nutrientes y Seston En La Laguna Costera La Cruz, Sonora. Ciencias Marinas. Vol. 17 No p. Chang P. S., Chen, L. J. y Y. C. Wang, The effect of ultraviolet irradiation, heat, ph, ozone, salinity and chemical disinfectants on the infectivity of white spot syndrome baculovirus. Aquaculture, 166, 1-17 Chang Y. S Chen T. C Liu W. J. Hwang J. S, Kou G. H y C. F. Lo Assessment of the Roles of Copepod Apocyclops royi and Bivalve Mollusk 43