English: Page 2 to 6 Deutsch: Seite 7 bis 11 Espanol: Página 12 a 17. Bibliography/ Literatur/ Bibliografía Page/ Seite/ Página 18

Transcripción

1 CA 125 Enzyme immunoassay for the quantitative determination of CA 125 in human serum or plasma Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von CA 125 in humanem Serum oder Plasma Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de CA 125 en suero o plasma humano Only for in-vitro diagnostic use English: Page 2 to 6 Deutsch: Seite 7 bis 11 Espanol: Página 12 a 17 Bibliography/ Literatur/ Bibliografía Page/ Seite/ Página 18 Symbols Key / Symbolschlüssel/ Símbolos Page/ Seite/ Página 19 Summary of Test Procedure/ Kurzanleitung/ Resumen de la técnica Page/ Seite/ Página 20 Product Number: DNOV061 (96 Determinations)

2 ENGLISH 1. INTRODUCTION CA-125, is an abbreviation for cancer antigen 125. CA-125 is a tumour marker; it is a glycoprotein as high molecular weight entity (Mr > 200,000). It is best known as a marker for ovarian cancer, but it may also be elevated in other malignant cancers, including those originating in the endometrium, fallopian tubes, lungs, breast and gastrointestinal tract. CA-125 may also be elevated in a number of relatively benign conditions, such as endometriosis, several diseases of the ovary, and pregnancy. It also tends to be elevated in the presence of any inflammatory condition in the abdominal area, both cancerous and benign. Thus, CA-125 is not perfectly specific for cancer nor is it perfectly sensitive since not every patient with cancer will have elevated levels of CA-125 in the blood. CA-125 is clinically approved for following the response to treatment and predicting prognosis after treatment. It is especially useful for detecting the recurrence of ovarian cancer. Its potential role for the early detection of ovarian cancer is controversial and has not yet been adopted for widespread screening efforts in asymptomatic women. Elevated levels in post-menopausal women are usually an indication that further screening is necessary. In premenopausal women, the test is less reliable as values are often elevated due to a number of non-cancerous causes. 2. INTENDED USE Immunoenzymatic colorimetric method for quantitative determination of CA-125 in human serum or plasma. 3. PRINCIPLE OF THE ASSAY In this method, CA-125 calibrators, patient specimens and/or controls containing the native antigen are first added to streptavidin coated wells. Biotinylated monoclonal and horseradish peroxidase (HRP) labelled antibodies are added and the reactants are mixed. The different types of antibodies used have high affinity and specificity and are directed against distinct and different epitopes of CA-125. Reaction between the various CA-125 antibodies and native CA-125 occurs in the microwells without competition or sterics hindrance forming a soluble sandwich complex. The interaction is illustrated by the following equation: E-Ab + AgCA BtnAb (m) Ka K-a E-Ab-AgCA-125-BtnAb(m) BtnAb(m) AgCA-125 E-Ab HRP-Ab(p)-AgCA-125-BtnAb(m) Ka K-a Byotinilated Monoclonal Antibody (Excess Quantity) Native Antigen (Variable Quantity) enzyme labelled Antibody (Excess Quantity) Antigen-Antibodies Sandwich Complex Rate Constant of Association Rate Constant of Dissociation Simultaneously, the complex is fixed to the well through the high affinity reaction of streptavidin and biotinylated antibody. This interaction is illustrated below: E-Ab- AgCA-125 -BtnAb (m)+streptavidin CW Immobilized Complex Streptavidin CW Streptavidin immobilized on well. Immobilized Complex Antibodies-Antigen sandwich bound. After equilibrium is attained, the antibody-bound fraction is separated from unbound antigen by aspiration. The native antigen concentration is directly proportional to the HRP activity in the antibody-bound fraction. The activity of the conjugated HRP is quantified by reaction with TMB substrate to produce blue colour. The reaction is terminated by adding stop solution which turns the blue colour into yellow. The absorbance is measured on a plate reader. 4. MATERIALS 4.1. Reagents supplied Coated Wells: 12 breakapart 8-well snap-off strips coated with streptavidin; in aluminium foil. Conjugate: 1 bottle containing 13 ml of horseradish peroxidase labelled anti- CA-125 antibodies and biotinylated monoclonal anti-ca-125 antibodies. TMB Substrate Solution: 1 bottle containing 15 ml 3, 3, 5, 5 -tetramethylbenzidine (H 2O 2-TMB 0.26 g/l) (avoid any skin contact). Wash solution 50x conc.: 1 bottle containing 20 ml (NaCl 45 g/l, Tween g/l) 2

3 Stop Solution: 1 bottle containing 15 ml sulphuric acid, 0.15 mol/l (avoid any skin contact). Standards: 6 bottles containing 1 ml standard solution with approx. the following concentration: Standard 0 Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard Materials supplied 0 U/ml 15 U/ml 50 U/ml 100 U/ml 200 U/ml 400 U/ml 1 Strip holder 1 Cover foils 1 Test protocol 1 Distribution and identification plan 4.3. Materials and Equipment needed ELISA microwell plate reader, equipped for the measurement of absorbance at 450 nm Manual or automatic equipment for rinsing wells Pipettes Distilled water Timer 5. STABILITY AND STORAGE The closed reagents are stable up to the expiry date stated on the label when stored at C in the dark. Opened reagents are stable for 60 days when stored at C. 6. REAGENT PREPARATION It is very important to bring all reagents, samples and standards to room temperature (22 28 C) before starting the test run! 6.1. Coated Snapp-off Strips The ready to use break apart snap-off strips are coated with streptavidin. Store at 2 8 C. Open the bag only when it is at room temperature. Immediately after removal of strips, the remaining strips should be resealed in the aluminium foil along with the desiccant supplied and stored at Conjugate The conjugate is ready to use CA-125 Standards The standards are ready to use. The standards, human serum based, were made using a >99% pure affinity purified preparation of CA-125. The preparation was calibrated against Centocor CA-125 IRMA test TMB Substrate Solution The bottle contains 15 ml of a tetramethylbenzidine/hydrogen peroxide system. The reagent is ready to use and has to be stored at C in the dark. The solution should be colourless or could have a slight blue tinge. If the substrate turns into blue, it may have become contaminated and should be thrown away Stop Solution The bottle contains 15 ml 0.15 M sulphuric acid solution (R 36/38, S 26). This ready to use solution has to be stored at C. 6.6 Wash Solution Dilute the concentrated wash solution to 1000 ml distilled or deionised water. For smaller volumes respect the 1:50 ratio. The diluted wash solution is stable for 30 days at 2 8 C. 7. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The specimens can be human serum or plasma and the usual precautions in the collection of venipuncture samples should be observed. For accurate comparison to established normal values, a fasting morning serum sample should be obtained. The blood should be collected in a plain redtop venipuncture tube without additives or anti-coagulants. Allow the blood to clot. Centrifuge the specimen to separate the serum from the cells. Samples may be refrigerated at 2 8 C for a maximum period of 5 days. If the specimen(s) cannot be assayed within this time, the sample(s) may be stored at temperatures of 20 C for up to 30 days. Avoid repetitive freezing and thawing. 3

4 Patient specimens with CA-125 concentrations above 400 U/ml may be diluted (for example 1/10 or higher) with normal male serum (CA-125 < 5 U/ml) and re-assayed. The sample s concentration is obtained by multiplying the result by the dilution factor (10). When assayed in duplicate, ml of the specimen is required Precaution Avoid the exposure of TMB substrate to direct sunlight, metal or oxidants. Do not freeze the solution. Maximum precision is required for dispensation of the reagents. 8. ASSAY PROCEDURE 8.1. Test Preparation Please read the test protocol carefully before performing the assay. Result reliability depends on strict adherence to the test protocol as described. Prior to commencing the assay, the distribution and identification plan for all specimens and controls should be carefully established on the result sheet supplied in the kit. Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder. Pipetting of samples should not extend beyond ten minutes to avoid assay drift. If more than one plate is used, it is recommended to repeat the dose response curve. Please allocate at least: 1 well (e.g. A1) for blank 2 wells (e.g. B1+C1) for standard 0 2 wells (e.g. D1+E1) for standard 1 2 wells (e.g. F1+G1) for standard 2 2 wells (e.g. H1+A2) for standard 3 2 wells (e.g. B2+C2) for standard 4 2 wells (e.g. D2+E2) for standard 5 It is recommended to determine standards and patient samples in duplicate. Perform all assay steps in the order given and without any appreciable delays between the steps. A clean, disposable tip should be used for dispensing each standard and each patient sample. 1. Dispense 25 µl standards and samples (and controls) into their respective wells. Leave A1 for blank. 2. Dispense 100 µl conjugate in each well. Leave A1 for blank. Cover with a foil. 3. Incubate for 60 min at room temperature (22 28 C). 4. When incubation has been completed, remove the foil, aspirate the content of the wells and wash each well three times with 300µl diluted wash solution. Avoid overflows from the reaction wells. The soak time between each wash cycle should be >5sec. At the end carefully remove remaining fluid by tapping strips on tissue paper prior to the next step! Note: Washing is critical! Insufficient washing results in poor precision and falsely elevated absorbance values. 5. Dispense 100 µl TMB Substrate Solution into all wells. 6. Incubate for 15 min at room temperature ( C) in the dark. 7. Dispense 100 µl Stop Solution into all wells in the same order and at the same rate as for the TMB Substrate Solution. Shake the microplate gently. Any blue colour developed during the incubation turns into yellow. 8. Measure the absorbance of the specimen at 450 nm within 30 min after addition of stop solution against blank. 9. QUALITY CONTROL Each laboratory should assay controls at normal, high and low levels range of CA-125 for monitoring assay performance. These controls should be treated as unknowns and values determined in every test procedure performed. Quality control charts should be maintained to follow the performance of the supplied reagents. Pertinent statistical methods should be employed to ascertain trends. The individual laboratory should set acceptable assay performance limits. In addition, maximum absorbance should be consistent with past experience. Significant deviation from established performance can indicate unnoticed change in experimental conditions or degradation of kit reagents. Fresh reagents should be used to determine the reason for the variations. 10. RESULTS Calculation of results Calculate the mean absorbance for each point of the standard curve and each sample. Plot the mean value of absorbance of the standards against concentration. Draw the best-fit curve through the plotted points. (e.g.: Four Parameter Logistic). Interpolate the values of the samples on the standard curve to obtain the corresponding values of the concentrations expressed in U/ml. 4

5 10.2. Reference values Healthy and non-pregnant subjects < 35 U/ml Please pay attention to the fact that the determination of a range of expected values for a normal population in a given method is dependent on many factors, such as specificity and sensitivity of the method used and type of population under investigation. Therefore each laboratory should consider the range given by the manufacturer as a general indication and produce their own range of expected values based on the indigenous population where the laboratory works. The serum CA-125 is elevated in 1% of normal healthy women, 3% of normal healthy women with benign ovarian diseases, 6% of patients with non-neoplastic conditions (including but not limited to first trimester pregnancy, menstruation, endometriosis uterine fibrosis, acute salphingitis, hepatic diseases and inflammation of peritoneum or pericardium). 11. SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS Sensitivity The lowest detectable concentration of CA-125 that can be distinguished from the standard 0 is 1.7 U/ml at the 95 % confidence limit Specificity In order to test the specificity of the used antibodies high concentrations of possible cross-reactants were added to known serum pools and assayed in parallel with base sera. Antigens Concentration % Cross-reactivity CA CA U/ml 0.00 CA U/ml 0.00 PSA 1 mg/ml 0.00 ß-HCG 250 ng/ ml 0.00 HCG 5000 U/ml 0.00 LH 1000 U/ml 0.00 According to the data the antibodies was found to be highly specific for CA Precision Intra Assay Variation Within run variation was determined by replicate determination (18x) of two different control sera in one assay. The within assay variability is 10.0%. Inter Assay Variation Between run variation was determined by replicate measurements (20x) of three different control sera in different lots. The between assay variability is 9.9% Correlation with RIA The NovaTec CA-125 ELISA was compared to another commercially available CA-125 assay. 142 serum samples were analysed according in both test systems. The linear regression curve was calculated: y = x r 2 = y = CA-125 Commercial kit x = CA-125 NovaTec kit 12. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of the specimen may affect the absorbance values. CA-125 has a low clinical sensitivity and specificity as a tumour marker. Clinically an elevated CA-125 value alone is not of diagnostic value as a test for cancer and should only be used in conjunction with other clinical manifestations (observations) and diagnostic parameters. 13. PRECAUTIONS AND WARNINGS In compliance with article 1 paragraph 2b European directive 98/79/EC the use of the in vitro diagnostic medical devices is intended by the manufacturer to secure suitability, performances and safety of the product. Therefore the 5

6 test procedure, the information, the precautions and warnings in the instructions for use have to be strictly followed. The use of the testkits with analyzers and similar equipment has to be validated. Any change in design, composition and test procedure as well as for any use in combination with other products not approved by the manufacturer is not authorized; the user himself is responsible for such changes. The manufacturer is not liable for false results and incidents for these reasons. The manufacturer is not liable for any results by visual analysis of the patient samples. Only for in-vitro diagnostic use by professional persons. Not for internal or external use in Humans or Animals. Follow Good Laboratory Practice (GLP) for handling blood products. All components of human origin used for the production of these reagents have been tested for anti-hiv 1+2 antibodies, anti-hcv antibodies and HBsAg and have been found to be non-reactive. Nevertheless, all materials should still be regarded and handled as potentially infectious. Do not interchange reagents or strips of different production lots. No reagents of other manufacturers should be used along with reagents of this test kit. Do not use reagents after expiry date stated on the label. Use only clean pipette tips, dispensers, and lab ware. Do not interchange screw caps of reagent vials to avoid cross-contamination. Close reagent vials tightly immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination. After first opening and subsequent storage check conjugate and control vials for microbial contamination prior to further use. To avoid cross-contamination and falsely elevated results pipette patient samples and dispense conjugate without splashing accurately to the bottom of wells. Samples microbiologically contaminated, highly lipemic or haemolysed should not be used in the assay. Plate readers measure vertically. Do not touch the bottom of the wells. Some reagents contain small amounts of Proclin 300 R as preservative. Avoid the contact with skin or mucosa The TMB substrate contains an irritant, which may be harmful if inhaled, ingested or absorbed through the skin. To prevent injury, avoid inhalation, ingestion or contact with skin and eyes. The stop solution consists of a diluted sulphuric acid solution. Sulphuric acid is poisonous and corrosive and can be toxic if ingested. To prevent chemical burns, avoid contact with skin and eyes. Addition of the TMB substrate solution initiates a kinetic reaction, which is terminated by the addition of the stop solution. Therefore, the TMB substrate and the stop solution should be added in the same sequence to eliminate any time deviation during the reaction. CA-125 has a low clinical sensitivity and specificity as a tumour marker. Clinically an elevated CA-125 value alone is not of diagnostic value as a test for cancer and should only be used in conjunction with other clinical manifestations (observations) and diagnostic parameters. WARNING: Sulphuric acid irritates eyes and skin. Keep out of the reach of children. Upon contact with the eyes, rinse thoroughly with water and consult a doctor! Disposal Considerations Residues of chemicals and preparations are generally considered as hazardous waste. The disposal of this kind of waste is regulated through national and regional laws and regulations. Contact your local authorities or waste management companies which will give advice on how to dispose hazardous waste. 14. ORDERING INFORMATION Prod. No.: DNOV061 CA 125 (96 Determinations) 6

7 DEUTSCH 1. EINLEITUNG CA-125 ist eine Abkürzung für Cancer Antigen 125. CA-125 ist ein Tumormarker. Es ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von > Es ist bekannt als Marker für Eierstockkrebs, aber es kann auch bei anderen malignen Krebserkrankungen erhöht sein, einschließlich solcher die ausgehen vom Endometrium, Eileiter, Lunge, Brust und Gastrointestinaltrakt. CA-125 kann auch unter relativ gutartigen Bedingungen erhöht sein, wie z. B. bei Endometriose, verschiedenen Erkrankungen der Eierstöcke und in der Schwangerschaft. Es zeigt ebenfalls die Neigung bei entzündlichen Beschwerden des Abdomens, sowohl maligne als auch gutartig, erhöht zu sein. Somit ist CA-125 weder 100% spezifisch für Krebs noch absolut sensitiv, da nicht jeder Krebs zu erhöhten CA-125 Konzentrationen im Blut führt. CA-125 ist klinisch erprobt für das Monitoring der Therapie und für die Prognose nach der Behandlung. Es ist besonders hilfreich für die Aufdeckung von Eierstockkrebsrezidiven. Seine Bedeutung bei der Früherkennung von Eierstockkrebs wird kontrovers diskutiert und es ist bisher noch nicht angepasst an das flächendeckende Screening von symptomlosen Frauen. Erhöhte Konzentrationen bei post-menopausalen Frauen sind gewöhnlich ein Hinweis darauf, dass ein weiteres Screening notwendig ist. Bei pre-menopausalen Frauen ist der Test weniger verlässlich, da die Werte öfter aufgrund verschiedener nicht krebsabhängiger Faktoren erhöht sind. 2. VERWENDUNGSZWECK Immunenzymatische kolorimetrische Methode für die quantitative Bestimmung von CA-125 in humanem Serum oder Plasma. 3. TESTPRINZIP CA-125 Standards, Patientenproben und/oder Kontrollen, die alle das native Antigen enthalten, werden zuerst in die mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte pipettiert. Anschließend werden biotinylierte monoklonale und mit Meerschweinchenperoxidase (HRP) markierte Antikörper zugegeben und gemischt. Die verwendeten Antikörper haben eine hohe Affinität und Spezifität und sind gegen unterschiedliche distinkte Epitope des CA-125 gerichtet. Die Reaktion zwischen den verschiedenen CA-125 Antikörpern und dem nativen CA-125 findet in der Mikrotiterplatte ohne Kompetition oder sterische Behinderung statt. Es entsteht ein löslicher Sandwich Komplex. Die Interaktion wird durch die folgende Gleichung illustriert: E-Ab + AgCA BtnAb (m) Ka K-a E-Ab-AgCA-125-BtnAb(m) BtnAb(m) Ag CA-125 E-Ab HRP-Ab(p)-Ag CA-125-BtnAb(m) Ka K-a Byotinylierte monoklonal Antikörper (Überschuss) Natives Antigen (unterschiedliche Menge) Enzymmarkierte Antikörper (Überschuss) Antigen-Antikörper Sandwich Komplex Assoziationskonstante Dissoziationskonstante Gleichzeitig bindet der Komplex aufgrund der hohen Affinität von Streptavidin und Biotin an die Mikrotiterplatte. Diese Interaktion wird durch die folgende Gleichung dargestellt: E-Ab- AgCA-125 -BtnAb (m)+streptavidin CW Immobilized Complex Streptavidin CW Streptavidin immobilisiert an der Mikrotiterplatte Immobilized Complex Antikörper-Antigen Sandwich Bindung Nachdem sich ein Gleichgewicht eingestellt hat, wird die gebundene Antikörperfraktion durch Absaugen von dem ungebundenen Antigen getrennt. Die Konzentration des nativen Antigens ist direkt proportional zu der HRP-Aktivität in der Antikörper-gebundenen Fraktion. Die Aktivität der konjugierten HRP wird über die Farbentwicklung der TMB Reaktion quantifiziert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von Stopplösung beendet wodurch die blaue Farbe gelb wird. Die Absorption wird mit einem Mikrotiterplatten-Photometer gemessen. 4. MATERIAL 4.1. Mitgelieferte Reagenzien Beschichtete Mikrotiterplatte: 12 teilbare 8er-Streifen, beschichtet mit Streptavidin; in Aluminiumbeutel. Konjugate: 1 Flasche mit 13 ml HRP markierten anti- CA-125 Antikörpern und biotinylierten monoklonalen Maus anti-ca-125 Antikörpern. 7

8 TMB Substrat Solution: 1 Flasche mit 15 ml 3, 3, 5, 5 -tetramethylbenzidine (H 2O 2-TMB 0.26 g/l) (Hautkontakt vermeiden). Waschlösung 50x konz.: 1 Flasche mit 20 ml (NaCl 45 g/l, Tween g/l) Stopplösung: 1 Flasche mit 15 ml Schwefelsäure, 0.15 mol/l (Hautkontakt vermeiden). Standards: 6 Flaschen mit je 1 ml Standardlösung mit ungefähr folgender Konzentration: Standard 0 Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5 0 U/ml 15 U/ml 50 U/ml 100 U/ml 200 U/ml 400 U/ml 4.2. Mitgeliefertes Zubehör 1 selbstklebende Abdeckfolie 1 Rahmenhalter 1 Arbeitsanleitung 1 Ergebnisblatt 4.3. Erforderliche Materialien und Geräte Photometer mit Filtern 450/620 nm Manuelle oder automatische Waschvorrichtung Mikropipette Aqua dest. Timer 5. STABILITÄT UND LAGERUNG Die original verschlossenen Reagenzien sind bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfalldatum haltbar, wenn sie bei C im Dunkeln gelagert werden. Geöffnete Reagenzien sind bei C 60 Tage haltbar. 6. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Alle Reagenzien, Proben und Kontrollen sind vor ihrer Verwendung auf Raumtemperatur ( C) zu bringen! 6.1. Mikrotiterplatte Die abbrechbaren Streifen sind mit Streptavidin beschichtet. Die gebrauchsfertigen Vertiefungen sind bei C aufzubewahren. Den Aluminiumbeutel nur öffnen, wenn er Raumtemperatur hat. Nichtverbrauchte Vertiefungen im Aluminiumbeutel zusammen mit dem Trockenmittel sofort wieder verschließen und bei C lagern 6.2. Konjugat Das Konjugat ist gebrauchsfertig CA-125 Standards Die Standards sind gebrauchsfertig. Die Standards basieren auf humanem Serum und wurden mit Hilfe einer > 99% reinen Affinitätsreiningung hergestellt. Die Präparation wurde gegen den Centocor CA-125 IRMA Test kalibriert TMB Substratlösung Das Fläschchen enthält 15 ml eines Tetramethylbenzidin/Wasserstoffperoxidgemisches. Die gebrauchsfertige Lösung ist bei C vor Licht geschützt aufzubewahren. Die Lösung ist leicht hellblau. Sollte die TMB-Substratlösung dunkelblau sein, ist sie kontaminiert und kann nicht im Test verwendet werden Stopplösung Das Fläschchen enthält 15 ml 0.15 M Schwefelsäure (R36/38, S26). Die gebrauchsfertige Lösung ist bei C aufzubewahren. 6.6 Waschlösung Verdünne die konzentrierte Waschlösung mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 1000 ml. Für kleinere Volumen das 1:50 Verhältnis beachten. Die verdünnte Waschlösung ist bei 2 8 C 30 Tage stabil. 8

9 7. ENTNAHME UND VORBEREITUNG DER PROBEN Als Probenmaterial kann humanes Serum oder Plasma verwendet werden, das unter Beachtung der üblichen Vorsichtsmaßnahmen gewonnen wurde. Für einen genauen Vergleich mit den etablierten Normalwerten ist es wichtig, dass der Patient bei der morgendlichen Probennahme nüchtern ist. Das Blut sollte durch Punktion einer Vene in einem einfachen Probengefäß mit rotem Deckel ohne Zusatz von Additiven oder anti-koagulantien gewonnen werden. Das Blut gerinnen lassen. Abtrennung der Zellen vom Serum durch Zentrifugation. Die Proben können bei 2 8 C für maximal 5 Tage im Kühlschrank gelagert werden. Falls eine Bearbeitung in dieser Zeit nicht möglich ist, können die Proben bei -20 C für bis zu 30 gelagert werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden. Patientenproben mit CA-125 Konzentrationen über 400 U/ml können (z.b. 1/10) mit normalem männlichen Serum (CA- 125 < 5 U/ml) verdünnt und erneut gemessen werden. Die Konzentration in der Probe erhält man dann durch Multiplikation des Ergebnisses mit dem Verdünnungsfaktor (10). Bei Doppelbestimmung werden 0,050 ml Probe benötigt Vorsichtsmaßnahmen TMB Substrat keinem direkten Sonnenlicht, Metall oder Oxidantien aussetzen. Das Substrat nicht einfrieren. Das Rekonstituieren und Pipettieren der Reagenzien erfordert maximale Präzision. 8. TESTDURCHFÜHRUNG 8.1. Testvorbereitung Gebrauchsinformation vor Durchführung des Tests sorgfältig lesen. Für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist es notwendig, die Arbeitsanleitung genau zu befolgen. Die folgende Testdurchführung ist für die manuelle Methode validiert. Vor Testbeginn auf dem mitgelieferten Ergebnisblatt die Verteilung bzw. Position der Patientenproben und Standards auf den Mikrotiterstreifen genau festlegen. Die benötigte Anzahl von Mikrotiterstreifen (Kavitäten) in den Streifenhalter einsetzen. Das Pipettieren der Proben sollte maximal 10 Minuten dauern um einen Drift innerhalb des Testes zu vermeiden. Wenn mehr als eine Mikrotiterplatte gemessen wird, wird empfohlen für jede Platte eine Standardkurve zu erstellen. 1 Vertiefung (z.b. A1) Blank 2 Vertiefungen (z.b. B1+C1) für Standard 0 2 Vertiefungen (z.b. D1+E1) für Standard 1 2 Vertiefungen (z.b. F1+G1) für Standard 2 2 Vertiefungen (z.b. H1+A2) für Standard 3 2 Vertiefungen (z.b. B2+C2) für Standard 4 2 Vertiefungen (z.b. D2+E2) für Standard 5 Prinzipien der Qualitätssicherung in der Laboratoriumsmedizin erfordern zur höheren Sicherheit für Kontrollen und Patientenproben mindestens Doppelbestimmungen. Den Test in der angegebenen Reihenfolge und ohne Verzögerung durchführen. Für jeden Pipettierschritt der Kontrollen und Proben saubere Einmalspitzen verwenden. 1. Dispensiere 25 µl Standards und Proben (und Kontrollen) in die entsprechenden Vertiefungen. A1 für den Blank freilassen. 2. Dispensiere 100 µl Konjugat in jede Vertiefung. A1 für den Blank freilassen. Die Streifen mit der mitgelieferten Abdeckfolie bedecken. 3. Inkubiere für 60 min bei Raumtemperatur (22 28 C). 4. Nach der Inkubation die Folie entfernen und den Inhalt der Die Streifen mit der mitgelieferten Abdeckfolie bedecken. Absaugen und jede Vertiefung dreimal mit 300µl verdünnter Waschlösung waschen. Überfließen von Flüssigkeit aus den Vertiefungen vermeiden. Intervall zwischen Waschen und Absaugen sollte mindestens 5 sec betragen. Nach dem Waschen die Teststreifen mit den Öffnungen nach unten kurz auf Fliesspapier ausklopfen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen. Beachte: Der Waschvorgang ist wichtig, da unzureichendes Waschen zu schlechter Präzision und falsch erhöhten Messergebnissen führt! µl TMB-Substratlösung in alle Vertiefungen pipettieren. 6. Inkubiere für 15 min bei Raumtemperatur (22 28 C) im Dunkeln. 7. In alle Vertiefungen 100µl Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und mit den gleichen Zeitintervallen wie bei der TMB-Substratlösung Zugabe pipettieren. Die Mikrotiterplatte leicht schütteln. Während der Inkubation gebildete blaue Farbe schlägt in gelb um. 8. Die Extinktion der Lösung in jeder Vertiefung bei 450/620 nm innerhalb von 30 min nach Zugabe der Stopplösung gegen den Blank messen 9

10 9. QUALITÄTSKONTROLLE Jedes Labor sollte Kontrollen im normalen, hohen und niedrigen Bereich für CA-125 messen, um die Leistungsfähigkeit des Testes zu überprüfen. Diese Kontrollen sollten wie unbekannte Proben behandelt und bei jedem Testlauf mitbestimmt werden. Qualitätskontrollaufzeichnungen sollten geführt werden, um die Performance der gelieferten Reagenzien zu überwachen. Um Trends erkennen zu können, sollten angemessene statistische Methoden etabliert werden. Jedes Labor sollte Annahmekriterien für die Testperformance aufstellen. Zusätzlich sollte die maximale Absorption mit früheren Messungen konsistent sein. Signifikante Abweichungen von der etablierten Leistungsfähigkeit können ein Indikator sein für unbemerkte Veränderungen der experimentellen Bedingungen oder Instabilität von Kitreagenzien. Um die Ursache der Abweichung zu ermitteln sollten frische Reagenzien verwendet werden. 10. ERGEBNISSE Berechnung der Ergebnisse Berechne den Mittelwert der Absorption jedes Punktes der Standardkurve und jeder Probe. Trage die Mittelwerte der Absorption gegen die Konzentration der Standards auf. Zeichne die am besten passende Kurve durch die Punkte (z.b. 4 Parameter Fit). Interpoliere die Werte der Proben anhand der Standardkurve, um die zugehörige Konzentration in U/ml zu erhalten Referenzwerte Gesunde und nicht-schwangere < 35 U/ml Bei 1% der gesunden Frauen, 3% der gesunden Frauen mit gutartigen Eierstockerkrankungen und 6% der Patienten mit nicht-neoplastischen Bedingungen (einschließlich aber nicht begrenzt auf das erste Trimester der Schwangerschaft, Menstruation, Endometriose, Myome der Gebärmutter, akute Sapingitis, hepatische Erkrankungen und Entzündungen des Peritoneums oder Perikards) ist der CA-125 Wert erhöht. 11. TESTMERKMALE Sensitivität Die niedrigste nachweisbare Konzentration an CA-125, die vom Standard 0 unterschieden werden kann ist 1,7 U/ml bei 95% Konfidenzintervall Spezifität Um die Spezifität des verwendeten Antikörperpaares zu untersuchen, wurden gepoolte Seren mit hohen Konzentrationen möglicher kreuzreagierender Substanzen versetzt und parallel mit den Basisseren gemessen. Antigene Konzentration % Kreuzreaktivität CA CA U/ml 0.00 CA U/ml 0.00 PSA 1 mg/ml 0.00 ß-HCG 250 ng/ ml 0.00 HCG 5000 U/ml 0.00 LH 1000 U/ml 0.00 Die Daten zeigen, dass das verwendete Antikörperpaar für CA-125 hoch spezifisch ist Präzision Intraassay-Varianz Die Variation innerhalb eines Testlaufs wurde ermittelt durch die wiederholte Bestimmung (18x) von zwei verschiedenen Kontrollseren in einem Test. Die Intraassay-Varianz beträgt 10,0%. Interassay-Varianz Die Variation zwischen verschiedenen Testläufen wurde ermittelt durch die wiederholte Bestimmung (20x) von drei verschiedenen Kontrollseren in verschiedenen Lots. Die Interassay-Varianz beträgt 9,9% Korrelation mit RIA Der NovaTec CA-125 ELISA wurde verglichen mit einem anderen kommerziell erhältlichen CA-125 Test. 142 Serumproben wurden in beiden Systemen gemessen. Die lineare Regressionskurve wurde berechnet. y = x r 2 = y = CA-125 Kommerzieller Kit x = CA-125 NovaTec Kit 10

11 12. GRENZEN DES VERFAHRENS Kontamination der Proben durch Bakterien oder wiederholtes Einfrieren und Auftauen können zu einer Veränderung der Messwerte führen. CA-125 hat eine geringe Sensitivität und Spezifität als Tumormarker. Klinisch erhöhte CA-125 Werte allein reichen für eine Diagnose nicht aus. Die Diagnose einer Tumorerkrankung darf nicht allein auf der Basis des Ergebnisses einer Bestimmung gestellt werden. Die anamnestischen Daten sowie die Symptomatologie des Patienten müssen zusätzlich zu den serologischen Ergebnissen in Betracht gezogen werden. 13. SICHERHEITSMASSNAHMEN UND WARNHINWEISE Gemäß Art. 1 Abs. 2b der EU-Richtlinie 98/79/EG legt der Hersteller die Zweckbestimmung von In-vitro-Diagnostika fest, um deren Eignung, Leistung und Sicherheit sicherzustellen. Daher sind die Testdurchführung, die Information, die Sicherheitsmaßnahmen und Warnhinweise in der Gebrauchsanweisung strikt zu befolgen. Bei Anwendung des Testkits auf Diagnostika-Geräten ist die Testmethode zu validieren. Jede Änderung am Aussehen, der Zusammensetzung und der Testdurchführung sowie jede Verwendung in Kombination mit anderen Produkten, die der Hersteller nicht autorisiert hat, ist nicht zulässig; der Anwender ist für solche Änderungen selbst verantwortlich. Der Hersteller haftet für falsche Ergebnisse und Vorkommnisse aus solchen Gründen nicht. Auch für falsche Ergebnisse aufgrund von visueller Auswertung wird keine Haftung übernommen. Nur für in-vitro-diagnostik durch Fachpersonal vorgesehen, welches die Arbeitstechniken einwandfrei beherrscht.. Alle verwendeten Bestandteile menschlichen Ursprungs sind auf Anti-HIV-AK, Anti-HCV-AK und HBsAG nichtreaktiv getestet. Dennoch sind alle Materialien als potentiell infektiös anzusehen und entsprechend zu behandeln. Reagenzien unterschiedlicher Chargen nicht untereinander austauschen. Keine Reagenzien anderer Hersteller zusammen mit den Reagenzien dieses Testkits verwenden. Nicht nach Ablauf des Verfallsdatums verwenden. Nur saubere Pipettenspitzen, Dispenser und Labormaterialien verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verschlusskappen der einzelnen Reagenzien nicht untereinander vertauschen. Flaschen sofort nach Gebrauch fest verschließen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Nach dem ersten Öffnen Konjugat- und Standardfläschchen vor weiterem Gebrauch auf mikrobielle Kontamination prüfen. Zur Vermeidung von Kreuzkontamination und falsch erhöhten Resultaten Patientenproben und Konjugat sorgfältig in die Kavitäten pipettieren. Mikrobiologisch kontaminierte Proben sollten nicht verwendet werden. Entsprechendes gilt für hoch lipämische oder hämolytische Proben. Miktrotiter Photometer messen vertikal. Der Boden der Mikrotiterplatte sollte daher nicht berührt werden. Einige der Reagenzien enthalten geringe Mengen an Proclin 300. Das TMB Substrat enthält einen Reizstoff, der schädlich sein kann beim Inhalieren, Verschlucken oder Hautkontakt. Zur Vermeidung von Verletzungen sollte die Inhalation, das Verschlucken sowie Haut- und Augenkontakt vermieden werden. Die Stopplösung besteht aus verdünnter Schwefelsäure. Schwefelsäure ist giftig und korrosiv und kann beim Verschlucken toxisch wirken. Zur Vorbeugung von chemischen Verbrennungen sollte der Kontakt mit Haut und Augen vermieden werden. Durch die Zugabe des TMB Substrates wird eine chemische Reaktion gestartet, die durch die Zugabe der Stopplösung beendet wird. Daher sollten das TMB Substrat und die Stopplösung in der gleichen Reihenfolge zugegeben werden, um jegliche Zeitunterschiede während der Inkubation zu vermeiden. CA-125 hat eine niedrige klinische Sensitivität und Spezifität als Tumormarker. Klinisch gesehen ist ein erhöhter CA-125-Wert allein ohne diagnostische Bedeutung als Nachweis für Krebs und sollte nur in Verbindung mit anderen klinischen Beobachtungen und diagnostischen Maßnahmen genutzt werden. WARNUNG: Schwefelsäure reizt Augen und Haut. Nach Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser spülen und einen Arzt aufsuchen Entsorgungshinweise Chemikalien und Zubereitungen sind in der Regel Sonderabfälle. Deren Beseitigung unterliegt den nationalen abfallrechtlichen Gesetzen und Verordnungen. Die zuständige Behörde informiert über die Entsorgung von Sonderabfällen. 14. BESTELLINFORMATION Produktnummer: DNOV061 CA 125 (96 Bestimmungen) 11

12 ESPANOL 1. INTRODUCCIÓN CA-125, es la abreviación para el antígeno del cáncer 125. El CA-125 es un marcador tumoral, se trata de una glicoproteína de alto peso molecular (Mr> ). Es mejor conocido como un marcador de cáncer de ovario, pero también puede estar elevado en otros tipos de cáncer malignos, incluidos aquellos originados en el endometrio, trompas de Falopio, pulmones, seno y tracto gastrointestinal. El CA-125 puede elevarse en un número relativo de condiciones benignas, como la endometriosis, enfermedades severas en los ovarios y el embarazo. También tiende a elevarse en presencia de procesos inflamatorios en el área abdominal, en casos cancerosos o benignos. Así el CA-125 no es perfectamente específico para cáncer ni es perfectamente sensible debido a que no todos los pacientes con cáncer tienen niveles elevados de CA-125 en sangre. El CA-125 está clínicamente aprobado para el seguimiento de respuesta al tratamiento y predecir el pronóstico después del tratamiento. Es especialmente usado para la detección de la recurrencia de cáncer de ovario. Su posible papel en la detección temprana de cáncer ovario es controversial y aún no ha sido adoptado para la revisión generalizada a pesar de los esfuerzos como una prueba de tamizaje en mujeres asintomáticas. Niveles elevados en mujeres post-menopáusicas son usuales, es una indicación que el tamizaje es necesario, en mujeres pre-menopáusicas, por lo tanto la prueba es menos confiable debido a que los valores son elevados debido a numerosas razones no relacionadas con la presencia de cáncer. 2. USO Método inmunoenzimático competitivo y colorimétrico para la determinación cuantitativa de CA-125 en suero o plasma humano. 3. FUNDAMENTO DE LA PRUEBA En este método, los calibradores, las muestras de los pacientes y/o controles, los cuales contienen el antígeno nativo, son adicionados de primero a los pozos recubiertos con estreptavidina. Luego se adicionan los anticuerpos biotinilados y los anticuerpos marcados con peroxidasa de rabano picante, y se mezclan los reactivos. Los diferentes tipos de anticuerpos usados tienen una alta afinidad y especificidad y están dirigidos contra diferentes epitopes del CA-125: La reacción entre los diferentes anticuerpos contra el CA-125 y el CA-125 nativo ocurre en los micropozos sin competencia ni impedimento estérico para formar un complejo soluble tipo sándwich La interacción es ilustrada por la siguiente ecuación: Ka E - Ac + AgCA BtnAc(m) E Ac AgCA BtnAc (m) K-a BtnAc(m) AgCA-125 E-Ac HRP Ac(p)-AgCA-125-BtnAc(m) Ka K-a Anticuerpos Monoclonales Biotinilizados (Cantidad en exceso) Antigeno Nativo (Cantidad variable) Anticuerpo marcado con al enzima (Cantidad en exceso) Antigeno- Anticuerpo complejo sandwich Tasa Constante de asociación Tasa constante de disociación. Simultáneamente, el complejo se fija en el pozo a través de una reacción de alta afinidad de la estreptavidina y anticuerpos biotinilizados. Esta interacción se ilustra a continuación: E - Ac-AgCA BtnAc (m) + Estreptavidina CW Complejo inmovilizado Estreptavidina CW Complejo inmovilizado Estreptavidina inmovilizada sobre el pozo Unión Antígeno-Anticuerpo tipo sándwich Luego que el equilibrio es alcanzado, la fracción de anticuerpo unido es separada de la fracción de antígeno no unido. La concentración de antígeno nativo es directamente proporcional la actividad de la HRP. La actividad de la HRP conjugada es cuantificada por la reacción con el substrato de TMB el cual produce un color azul. La reacción es determinada por la adición de la solución de parada convirtiendo el color azul en color amarillo. La absorbancia es medida en el plato de reacción. 12

13 4. MATERIALES 4.1. Reactivos suministrados Microplacas Recubiertas: 12 tiras de 8 pozos separables. Los pozos están recubiertas con estreptavidina empacados en una bolsa de papel de aluminio resellable. Conjugado: 1 vial contiene 13 ml de anticuerpos anti-ca125 marcados con peroxidasa de rábano y anticuerpos monoclonales anti- CA-125. Solución de sustrato TMB: 1 vial con 15 ml de 3, 3 ', 5, 5'-tetrametilbenzidina (H 2O 2-TMB 0,26 g/l) (evitar cualquier contacto con la piel). Solución de lavado 50x conc.: 1 vial con 20 ml (NaCl 45g/, Tween g/l) Solución de parada: 1 vial con 15 ml de ácido sulfúrico 0,15 mol/l (evitar cualquier contacto con la piel). Estándares de CA-125: 6 botellas, contienen un 1 ml de solución estándar con aproximadamente la siguiente concentración: Estándar 0: 0 U/ml Estándar 1: 15 U/ml Estándar 2: 50 U/ml Estándar 3: 100 U/ml Estándar 4: 200 U/ml Estándar 5: 400 U/ml 4.2. Materiales suministrados 1 Soporte para tiras 1 Lámina sellante 1 Protocolo de procesamiento 1 Plan de distribución e identificación 4.3. Materiales y equipos necesarios Lector de de ELISA equipado para medir absorbancia a 450 nm Equipo manual o automático para el lavado de los pozos Pipetas Agua destilada Temporizador 5. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO Los reactivos cerrados son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta cuando se almacenan a C en la oscuridad. Los reactivos abiertos son estables por 60 días cuando se almacenan a C. 6. PREPARACION DE LOS REACTIVOS Es muy importante tener todos los reactivos, muestras, controles y estándares a temperatura ambiente (22 28 C) antes de iniciar la ejecución de la prueba! 6.1. Tiras de micropozos Las tiras vienen listas para ser usadas y se rompen para separar los pozos. Están recubiertas con estreptavidina. Se deben conservar a una temperatura de entre C. Abra la bolsa sólo cuando ésta se encuentre a temperatura ambiente. Inmediatamente después de retirar las tiras que va a utilizar, asegúrese de guardar las tiras que no van a ser usados dentro de la bolsa de aluminio resellable junto con el desecante suministrado y almacenarla a una temperatura entre C; las tiras son estables hasta la fecha de caducidad Conjugado El conjugado esta lista para su uso Estándares de CA-125 Los estándares están listos para su uso. Están hechos a partir de suero humano, se obtuvieron usando una preparación de CA-125 purificada por afinidad para obtener una pureza > 99%. La preparación fue calibrada con la prueba Centocor CA-125 IRMA Solución de sustrato TMB El frasco contiene 15 ml de un sistema de tetrametilbencidina/peróxido de hidrógeno. El reactivo está listo para ser usado y debe ser almacenado a C en oscuridad. La solución debe estar incolora o puede tener un ligero tinte azul. Si el sustrato se torna azul, esto indica que puede haberse contaminado y por lo tanto debe desecharse. 13

14 6.5. Solución de parada El frasco contiene 15 ml de solución de ácido sulfúrico 0.15M (R 36/38, S26). Esta solución esta lista para su uso y debe ser almacenada a C Solución de Lavado Diluya la solución de lavado concentrada en 1000 ml de agua destilada o desionizada. Para volúmenes más pequeños asegúrese de de respetar la relación 1:50. La solución diluida es estable por 30 días almacenado de 2 a 8 C. 7. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Las muestras de suero o plasma humano deben ser tomadas teniendo en cuenta las precauciones habituales para la recolección de muestras y de venopunción. Para la comparación exacta a los valores normales establecidos, el suero debe ser tomado en horas de la mañana con el paciente en ayunas. La sangre se debe recolectar en un tubo tapa roja sin aditivos o anti-coagulantes por venopunción simple. Permitir que la sangre se coagule. Centrifugar la muestra para separar el suero de las células. Las muestras pueden ser refrigeradas de C por un período máximo de 5 días. Almacenar las muestras a -20 C. Si la determinación no se realiza en el mismo día de la toma de muestras por un periodo máximo de 30 días. Evite congelar y descongelar repetidamente. Las muestras de los pacientes con CA-125 con concentraciones por encima de 400 U/ ml puede diluirse (por ejemplo 1/ 10 o superior) con suero normal masculino (CA-125 <5 U/ ml) y volver a analizarse. La concentración de la muestra se obtiene multiplicando el resultado por el factor de dilución (10). Para analizar la muestra por duplicado se necesita 0.050ml de la muestra Precauciones Evitar la exposición del substrato TMB a la luz solar directa, metal u oxidantes. Non congelar la solución. La máxima precisión es necesaria al momento de dispensar los reactivos 8. PROCEDIMIENTO 8.1. Preparación para la prueba Por favor, lea detenidamente el protocolo de la prueba antes de realizar el ensayo. La confiabilidad de los resultados depende del seguimiento estricto del protocolo de la prueba tal cual se describe en el inserto. Antes de comenzar el ensayo, se debe establecer cuidadosamente la distribución e identificación de las muestras y los estándares en la hoja Plan de distribución e identificación suministrada con el kit. Seleccione el número necesario de tiras de microtitulación o pozos e insértelos en el soporte. Por favor asigne por lo menos: 1 pozo (por ejemplo, A1) para el blanco 2 pozos (por ejemplo, B1+C1) para el estándar 0 2 pozos (por ejemplo, D1+E1) para el estándar 1 2 pozos (por ejemplo, F1+G1) para el estándar 2 2 pozos (por ejemplo, H1+A2) para el estándar 3 2 pozos (por ejemplo, B2+C2) para el estándar 4 2 pozos (por ejemplo, D2+E2) para el estándar 5 Se recomienda determinar los estándares y muestras por duplicado. Realice todos los pasos del ensayo en el orden indicado y sin retrasos apreciables entre los pasos. Debe usar una punta desechable limpia para la dosificación de cada estándar y cada muestra del paciente. 1. Agregue 25 µl de estándares, controles y muestras en sus respectivos pozos. Deje el pozo A1 libre para el blanco del substrato. 2. Agregue 100 µl de conjugado a cada pozo. Deje el pozo A1 libre para el blanco del substrato. Cubra los pozos con la lámina sellante incluida en el paquete. 3. Incube durante 60 min a temperatura ambiente (22-28 C). 4. Cuando se complete el tiempo de incubación, retire la lámina sellante, aspire el contenido de los pozos y lave cada pozo tres veces con 300 µl de solución de lavado. Evite desbordamientos entre los pozos de reacción. El tiempo de remojo entre cada ciclo de lavado debe ser >5 seg. Al finalizar, retire con cuidado el líquido sobrante golpeando las tiras sobre una toalla de papel antes de seguir al siguiente paso! Nota: El lavado es crítico! Un lavado insuficiente resulta en una mala precisión y valores de absorbancia falsamente elevados. 5. Agregue 100 µl de solución de sustrato TMB en todos los pozos. 6. Incube durante exactamente 15 minutos a temperatura ambiente ( C) en oscuridad. 7. Agregue 100 µl de solución de parada en todos los pozos en el mismo orden y a la misma velocidad que agregó la solución de sustrato TMB. Agitar la microplaca con cuidado. Cualquier color azul desarrollado durante la incubación se convertirá en amarillo. 8. Mida la absorbancia de la muestra a 450 nm 30 minutos después de haber adicionado la solución de parada. 14

15 9. CONTROL DE CALIDAD Cada laboratorio debe evaluar sus controles que correspondan a niveles normal, alto y bajo del CA-125 para supervisar el desempeño del ensayo. Estos controles deben ser tratados como muestras desconocidas y se deben determinar sus valores cada vez que se realice el ensayo. Se deben llevar gráficas de éstos controles de calidad para hacerle seguimiento al desempeño de los reactivos. Se deben emplear los métodos estadísticos pertinentes para verificar las tendencias. Cada laboratorio debe establecer los límites aceptables de desempeño para el ensayo. Otros parámetros que se deben controlar son los interceptos al 80, 50 y 20% de la curva estándar para evaluar la reproducibilidad intercorrida. Además, la absorción máxima debe ser consistente con la experiencia del laboratorio. Una desviación significativa del desempeño establecido puede indicar un cambio en las condiciones experimentales o la degradación de los reactivos. Deben usarse reactivos frescos para determinar la razón de las variaciones. 10. RESULTADOS Calculo de los resultados Calcule la absorbancia media para cada punto de la curva estándar y cada muestra. Grafique el valor medio de absorbancia de los estándares versus la concentración. Dibuje la curva que mejor se ajuste a los puntos trazados (Ej.: Logística de cuatro parámetros). Interpole los valores de las muestras en la curva estándar para obtener los valores correspondientes para las concentraciones expresadas en U/ml Valores de referencia Sujetos sanos y no embarazadas <35 U/ ml. Es importante senalar que la determinación de un rango de valores esperados en un método dado para una población normal depende de muchos factores, tales como la especifidad y sensibilidad del método en uso, y la población en estudio. Por lo tanto, cada laboratorio debe considerar el intervalo especificado por el fabricante como una gúia general y producir su propio rango de valores calculados en base al estadístico obtenido por el laboratorio, donde reside la población local. En el suero el CA-125 puede elevarse en el 1% de las mujeres sanas normales, 3% de lo normal las mujeres sanas con las enfermedades de ovario benignos, el 6% de los pacientes con condiciones no neoplásicas (incluyendo pero no limitado a, el embarazo en el primer trimestre, la fibrosis menstruación, endometriosis uterina, salpingitis aguda, enfermedades hepáticas y la inflamación del peritoneo o pericardio). 11. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE DESEMPEÑO Sensibilidad Los valores más bajos que pueden ser detectados de CA-125 pueden ser distinguidos en el estándar 0, como 1.7 U/ml con el 95% de confiablidad Especificidad Con el fin de comprobar la especificidad se usaron anticuerpos en altas concentraciones que posiblemente tuvieran reacciones cruzadas, se adicionaron a mezclas de suero con concentraciones conocidas de CA-125 y se analizaron en paralelo con el suero sin los anticuerpos: ANTIGENOS CONCENTRACIÓN % DE REACCIÓN CRUZADA CA CA U/ml 0.00 CA U/ml 0.00 PSA 1 mg/ml 0.00 β- HCG 250 ng/ml 0.00 HCG 5000 U/ml 0.00 LH 1000 U/ml 0.00 Según los datos de los anticuerpos se encontró que era altamente específico para CA Presición Variación intraensayo La variación intracorrida fue determinada por mediciones repetidas (18x) de dos sueros controles diferentes en un mismo ensayo. La variabilidad intracorrida del ensayo es 10.0%. Variación interensayo La variación intercorrida fue determinada por mediciones repetidas (20x) de tres sueros controles diferentes con lotes distintos. La variabilidad interensayo es 9.9%. 15

16 11.4. Comparación Con RIA El CA-125 de NovaTec por ELISA, fue comparado con otro ensayo de CA-125 comercial disponible. Se analizaron 142 muestras acuerdo a los procedimientos de cada uno de los kits. La curva de regresión lineal se calculó: y= x r 2 = y= CA-125 comercial kit x= CA*125 kit de NovaTec. 12. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La contaminación bacteriana o los ciclos repetidos de congelación de la muestra puede afectar a los valores de absorbancia. CA-125 tiene una baja sensibilidad y especificidad clínica como marcador tumoral. Clínicamente una elevación de CA-125 de valor por sí sola no es de valor diagnóstico como una prueba para el cáncer y sólo debe utilizarse en combinación con otras manifestaciones clínicas (observaciones) y los parámetros de diagnóstico. 13. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS En cumplimiento con el Artículo 1, Párrafo 2b de la Directiva 98/79/CE del Parlamento Europea sobre el uso de dispositivos médicos para diagnóstico in vitro, es responsabilidad del fabricante asegurar la idoneidad, desempeño y seguridad del producto. Por lo tanto, el procedimiento de prueba, la información, precauciones y advertencias contenidas en las instrucciones de uso deben ser seguidas estrictamente. El uso de los kits con analizadores y equipos similares debe ser validado. No esta autorizado realizar ningún cambio en el diseño, composición y procedimiento del ensayo, así como ningún uso en combinación con otros productos no aprobados por el fabricante; el usuario es responsable de tales cambios. El fabricante no se hace responsable por resultados falsos o por cualquier incidente causado por esta razón. El fabricante no se responsabiliza por los resultados obtenidos mediante el análisis visual de las muestras de los pacientes. Sólo para uso en diagnóstico in vitro y por personal experto. No es para uso interno o externo en humanos o animales. Siga las Bueneas Prácticas de Laboratorio (GL) en el manejo de las muestras sanguíneas y sus derivados. Todos los componentes de origen humano utilizados para la producción de estos reactivos han sido examinado para determinar la presencia de anticuerpos anti-vih, anticuerpos anti-hcv y anticuerpos anti-hbsag y se ha determinado que no son reactivos. Sin embargo, todo el material debe ser considerado y tratado como potencialmente infeccioso. No intercambiar reactivos o tiras de diferentes lotes de producción. No se deben utilizar reactivos de otros fabricantes en combinación con los reactivos de este kit. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Use sólo puntas para micropipeta, dispensadores y material de laboratorio limpio. No intercambie las tapas de los viales. Esto evita la contaminación cruzada. Cierre los viales de los reactivos con fuerza inmediatamente después de usarlos para evitar la evaporación y contaminación microbiana. Después de abrir el kit por primera vez y almacenarlo, verifique que los viales del conjugado y los estándares no presenten contaminación microbiana antes continuar usándolo. Para prevenir la contaminación cruzada y la obtención de resultados falsamente elevados, pipetee las muestras de los pacientes y dispense el conjugado con precisión hacia el fondo de los pozos evitando que se produzcan salpicaduras. No usar muestras con contaminación microbiana, altamente hemolizadas o lipémicas. Los lectores de microplacas leen las DO verticalmente, por tanto no debe tocarse el fondo de los pocillos. Algunos reactivos contienen pequenas cantidades de Proclin 300 R como conservante. Evite el contacto con la piel y las mucosas. El cromógeno TMB contiene un irritante que puede ser danino si se inhala, se ingiere o se absorbe a través de a piel. Para prevenir lesiones, evitar la inhalación, la ingestión o el contacto con la piel y con los ojos. La solución de parada está formada por una solución de ácido sulfúrico diluido. El ácido sulfúrico es venenoso y corrosivo, y puede ser tóxico si se ingiere. Para prevenir posibles quemaduras químicas, evitar el contacto con la piel y con los ojos. Al anadir el sustrato TMB se inicia una reacción cinética que termina al agregar la solución de parada. Tanto el sustrato TMB como la solución de parada deben agregarse en las misma secuencia para evitar diferentes tiempos de reacción. El CA 125 tiene baja sensibilidad y especifidad clínica como marcador tumoral. Clinicamente, un valor elevado de CA 125 por sí solo no representa un valor de diagnóstico como ensayo para el cáncer y deberia usarse solamente en combinación con otras manifestaciones clínicas y otros parámetros de diagnóstico. ADVERTENCIA: El ácido sulfúrico irrita los ojos y piel. Manténgase fuera del alcance de los niños. Al entrar en contacto con los ojos, lave cuidadosamente con agua y consulte a un doctor. 16

17 13.1. CONSIDERACIONES PARA EL DESCARTE Los residuos de productos y preparaciones químicos generalmente son considerados como residuos peligrosos. La eliminación de éste tipo de residuos está regulada por leyes y regulaciones nacionales y regionales. Póngase en contacto con las autoridades locales o empresas de manejo de residuos para que lo asesoren sobre cómo eliminar los residuos peligrosos. 14. INFORMACIÓN PARA PEDIDOS Prod. No.: DNOV061 CA 125 (96 Determinaciones) 17

18 BIBLIOGRAPHY/ LITERATUR/ BIBLIOGRAFÍA Zamcheck N, Adv Intern Med, 19, 413 (1974) Rayncao G, Chu TM, JAMA, 220, 381 (1972) Harrison, Principles of Internal Medicine., McGraw Hill Book Company, New York. 12th. Ed. Wild D, The Immunoassay Handbook., Stockton Press (1994) Hasholzner U, Tumor Diagnosis & Ther 15: (1994) Hasholzner U, Int J Cancer 69: (1996) Ovarian Cancer NIH Conference. JAMA 273: (1995) Daoud E. Clin Chem 37: (1991) De Bruijn HWA, Curr Opin Gynecol 9:8-13 (1997) Sikorska H, Cancer Detection Preview 12: (1988) NIH CA-125 Ann.Inter.Med. 94: (1981) 18

19 Symbols Key/ Symbolschlüssel/ Explication des symboles / Legenda / Símbolos/ Tabela de símbolos Manufactured by / Hergestellt von/ Fabriqué par/ Prodotto da/ Fabricado por / Fabricado por In Vitro Diagnostic Medical Device/ In Vitro Diagnosticum/ Dispositif médical de diagnostic in vitro/ Diagnostico in vitro/ Producto para diagnóstico In vitro / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro Lot Number/ Chargenbezeichnung/ Numéro de lot/ Lotto/ Número de lote / Número de lote Expiration Date/ Verfallsdatum/ Date de péremption/ Scadenza/ Fecha de caducidad / Data de Validade Storage Temperature/ Lagertemperatur/ Température de conservation/ Temperatura di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de Armazenamento CE Mark/ CE-Zeichen/ Marquage CE / Marchio CE/ Marca CE / Marca CE Catalogue Number/ Katalog Nummer/ Référence du catalogue/ Numero di codice/ Número de Catálogo / Número de Catálogo Consult Instructions for Use/ Gebrauchsanweisung beachten/ Consulter la notice d utilisation/ Consultare le istruzioni/ Consulte las Instrucciones de Uso / Consultar as Instruções de Utilização Microplate/ Mikrotiterplatte/ Microplaque/ Micropiastra/ Microplaca / Microplaca Conjugate/ Konjugat/ Conjugué/ Coniugato/ Conjugado / Conjugado CALl Calibrator resp. Standard/ Kalibrator bzw. Standard/ Callibrateur resp Etalon / Calibratore ossia Standard / Calibrador o bien Estándar Stop solution/ Stopplösung/ Solution d arrêt/soluzione bloccante / Solução de paragem TMB Substrate solution/ TMB-Substratlösung/ Substrat TMB/ soluzione substrato TMB/ solución substrato TMB / Solução substrato TMB Washing solution 50x concentrated/ Waschlösung 50x konzentriert/ Solution de lavage concentré 50 x/ soluzione di lavaggio concentrazione x50/ solución de lavado concentrado x50 / Solução de lavagem concentrada 50x Contains sufficient for n tests/ Ausreichend für n Tests/ Contenu suffisant pour n tests/ Contenuto sufficiente per n saggi/ Contenido suficiente para n tests / Conteúdo suficiente para n testes 19

20 SCHEME OF THE ASSAY CA 125 Test Preparation Prepare reagents and samples as described. Establish the distribution and identification plan for all specimens and controls on the result sheet supplied in the kit. Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder. Assay Procedure blank Standard 0-5 Sample Standard µl - Sample µl Conjugate µl 100 µl Cover wells with foil supplied in the kit Incubate for 60 min at room temperature Wash each well three times with 300 µl diluted Wash Solution TMB 100 µl 100 µl 100 µl Incubate for exactly 15 min at room temperature in the dark Stop solution 100 µl 100 µl 100 µl Shake the microplate gently. Photometric measurement at 450 nm NovaTec Immundiagnostica GmbH Technologie & Waldpark Waldstr. 23 A6 D Dietzenbach, Germany Tel.: +49 (0) Fax: +49 (0) info@novatec-id.com Internet: DNOV061-engl,dt,es CS 20