Introducción y fundamentos de RMN. Rodolfo Rasia, Biofísica 2018

Transcripción

1 Introducción y fundamentos de RMN Rodolfo Rasia,

2 Que nos puede decir la RMN de proteínas? 2

3 Cálculo de estructuras 3

4 Dinámica 4

5 Proteínas desestructuradas 5

6 Análsis de alteraciones estructurales Wild-type Partially destabilized Partially destabilized & heterogeneous Unfolded 6 Ohi et al., NSB (2003)

7 Interacción proteína-ligando (Arai et al., JACS 2013) 7

8 Diseño de drogas 8

9 Metabolómica 9

10 Estudios estructurales in vivo 10

11 Estados excitados 11

12 Y no está limitado a moléculas pequeñas 12

13 El límite es la imaginación J O el dinero L 13

14 De qué vamos a hablar? (outline) } Un poquito de física (núcleos, spin ) y de instrumentos } Bastante de desplazamientos químicos } Dispersión } Información } Asignación } Un pantallazo de cálculo de estructuras } Un buen rato de interacciones y relajación/dinámica 14

15 Que es RMN (NMR!) }Nuclear }Magnética }Resonancia 15

16 Nuclear y Magnética: Spin nuclear } Núcleo, spin nuclear, momento de spin } Estados cuantizados m = I,I-1,, -I+1, -I } I múltiplo de 1/2 } Nos interesan solamente núcleos con I = ½ } I>1/2 à relaja rápido, más dificil de trabajar. } m=±1/2 } Asociado al spin, momento magnético } µ=γ I 16

17 En presencia de B 0 } Interacción de µ con B 0 } Se pierde la degeneración } Para núcleos de spin ½, 2 estados } Los llamamos α (-1/2) y β (1/2) } RMN à transiciones entre α y β B 0 =0 B 0 >0 b a ˆ 1 b >=! b > 2 ˆ 1 a >= -! a > 2 I z I z 17

18 Por qué resonancia? } Energía de un espín en un campo magnético E= mγhb 0 /2π E α =-1/2γhB 0 /2π E β =1/2γhB 0 /2π E=γhB 0 /2π D E= hn n = g B 0 / 2p La frecuencia depende del campo (B 0 ) y de la constante giromagnética (!) 18

19 Poniendo números } γ( 1 H)=26.75 x 10 7 (rad/t.s) } Para núcleos de 1H en magnetos de uso en RMN } Bo= T }!= MHz. } Para 1H a! = 600 MHz (Bo = 14.1 T) } E= 5.5 x 10-5 kcal / mol << RT (0.593 kcal/mol) } N α /N β = e E / RT = } Magnetización macroscópica (señal) proporcional a la diferencia de población muy poquito L 19

20 Qué implica esto? } Baja relación señal-ruido (acumular experimentos) } Regreso al equilibrio (relajación) lento (limita repetición) } Estado excitado: tiempos de vida media µs, ms } Medición con mucha precisión J } A > B 0 > sensibilidad } Núcleos con > γ son más sensibles } 1 H C N } Cada núcleo absorbe a una! determinada 600 MHz 150 MHz 60 MHz 1 H 13 C 15 N 20

21 Propiedades de los isótopos } Elementos en proteínas } Lo ideal: spin ½ y abundancia natural alta Isótopo Spin I Abundancia Natural [%] g [10 7 *rad/(t*s) ] Sensibilidad relativa Sensibilidad absoluta 1 H 1/ H C C 1/ N N 1/ O O 5/ P 1/

22 Isótopos útiles en bio-rmn } Elementos en biomoléculas: C, H, O, N, S, P } Sólo 1 H y 31 P son naturalmente abundantes } 13 C y 15 N } baja abundancia } baja sensibilidad } Enriquecimiento isotópico } O no sirve 1 H 13 C 15 N 31 P 22

23 Resumiendo I } En RMN se miden transiciones de spin nuclear } Las diferencias de energía son bajas } Baja S/N } Alta precisión } En proteínas trabajamos con núcleos de spin ½: 1H (natural), 13C y 15N (precisan enriquecimiento isotópico) } Cada núcleo resuena a una frecuencia particular, dependiendo de su γ 23

24 El espectrómetro } An NMR machine is basically a big and expensive FM radio B o N S Magnet B 1 Frequency Generator Recorder Detector 24

25 En proteínas, campos altos } Muuuchas señales! H, C, N à Resolución } Muestras diluidas (típicamente 0.1-1mM) à sensibilidad } Criosondas!! Ca 3x S/N ó 9x más rápido } O maior, imán de 1 GHz (Lyon, France) 11.7 millones } Imán 700 MHz (Rosario, Argentina) USD 1.08 millones 25

26 Para qué gastar tanta plata? Un núcleo Una señal Una sonda Parámetros Espectrales Propiedades de cada núcleo (δ, J, T 1, T 2 ) Interacciones spin-spin 26

27 Cómo luce un espectro de RMN? } Estricnina en CDCl 3, 22 1 H } 400 MHz } Cada 1 H da una señal identificable 27

28 En proteínas es más complicado 28

29 El desplazamiento químico (δ) } Elelctrones à spin I =1/2. } Producen pequeños campos magnéticos que se oponen a B 0 } Cada núcleo siente un B 0 efectivo diferente HO-CH 2 -CH 3 low field high field 29 w o

30 Dependencia con el campo! Desplazamiento químico en ppm } ν entre dos núcleos es proporcional a B 0 } En diferentes campos, los espectros serían diferentes } Para simplificar, el desplazamiento químico se expresa en partes por millón de la frecuencia base δ = (ν ν ref )/ν ref 10 6 (ppm) δ indep. B 0! ν ref à compuesto de referencia: TMS, DSS, TSP Rangos de δ variables: 1 H, ca. 15 ppm 13 C, ca. 200 ppm 113 Cd, ca. 300 ppm 30

31 Desplazamientos químicos 1H en prots. 31

32 Desplazamientos químicos 13C en prots. 32

33 Dispersión de δà plegamiento Plegado Sac Y, regulador bacteriano (50 aa) 600 MHz Desplegado Manival et al EMBO Journal (1997) 16,

34 Chemical shif index } Desplazamiento químico del esqueleto depende de estruct. secundaria à determinación αhélice/láminaβ Nucleus a-helix b-strand 1 Ha HN Ca C` N

35 Determinación de estructuras 35

36 Interacciones entre núcleos } Proveen información sobre conectividad (asignación) y estructural } Interacciones escalares (a través de enlaces) } Conexion por enlace } Ángulos diedros } Interacciones dipolares (a través del espacio) } Distancia } Orientación relativa 36

37 Acoplamiento escalar } Influencia del estado de un núcleo sobre otro mediada por e- à a través de enlace } n J, n= nº de enlaces } Constante en Hz } Separación de líneas H eff (A) = H o ± H ind (B) 37

38 Acoplamientos vecinales entre 1H } J entre 1H vecinales depende del ángulo diedro } Relacionados por la ecuación de Karplus 2 J ( q ) = Acos ( q ) + B cos( q ) + C } A, B y C, determinación empírica } Estimación de la conformación molecular J(q) 38 q

39 Acoplamiento vecinal HN-Hα 39

40 Acoplamientos escalares en proteínas 40

41 Acoplamiento dipolar } Directa a través del espacio } Si θ=cte, muy grande } En solución, se promedia a 0 pero es la contribución más importante a la relajación à NOE! ν D = γ 1γ 2 h(3cos 2 θ 1) 8π 2 r 3 41

42 En resumen } Núcleos en B 0, E à medición } Desplazamiento químico, una resonancia por núcleo en un entorno } Interacciones entre núcleos } A través de enlace } A través del espacio } Correlación entre núcleos 42

43 Ya está? Qué queda? } Cómo y por qué se obtiene la señal en espectrómetros de FT? } Cómo se transmite la información entre núcleos? Cómo lo puedo aprovechar? } Cómo hago para separar señales? Puedo seleccionar que veo y que no? } Cuánto dura la señal? Qué me importa? } Finalmente Cómo aplico la RMN a biomoléculas? Qué datos puedo sacar? Cuáles no? Por qué? 43