GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS ENZIMAS PÉCTICAS

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1 Profesora Adjunta: Dra. Ing. Alicia Martos JTP: Magter Bqca. Emilce Roxana Zubreski GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS ENZIMAS PÉCTICAS Cátedra Química y Bioquímica de los Alimentos Carrera Ingeniería de los Alimentos 1. OBJETIVOS 1. Medir la actividad pectinolítica total, actividad poligalacturonasa y actividad pectinesterasa de los extractos enzimáticos producidos por una cepa de un microorganismo autóctono mediante fermentación en medio líquido. 2. Estudiar el efecto de la temperatura y el ph sobre la actividad de la enzima poligalacturonasa. 2. INTRODUCCION SUSTANCIAS PECTICAS Las sustancias pécticas pueden ser definidas como polisacáridos estructurales de elevado peso molecular, presentes principalmente en la lámina media y en la pared celular primaria de las plantas superiores, están químicamente unidas y mecánicamente inmersas dentro de otros constituyentes de la pared celular vegetal como celulosa y hemicelulosa,. Aunque están presentes en cantidades que generalmente no exceden el 1% del peso fresco, son responsables de la integridad y coherencia de los tejidos de las plantas. La lámina media es la capa cementante que se encuentra entre las células en los tejidos de las plantas y contienen principalmente, al igual que la pared celular primaria protopectina. La protopectina es el nombre dado a las sustancias pécticas insolubles en agua y que están fijas en el tejido vegetal, ligada a los componentes celulósicos de las paredes celulares. Las sustancias pécticas, están formadas por unidades de ácido D-galacturónico unidas por enlaces glicosídicos α-1,4 con los grupos carboxilos esterificados con metanol (Figura 1). Figura 1: Estructura de la molécula de pectina. 1

2 La esterificación de los grupos carboxilos del ácido galacturónico (AG) con metanol es una característica muy importante que le confiere a la pectina sus propiedades estructurales y funcionales. El grado de metilación (GM) se define como los moles de metanol presentes cada 100 moles de ácido galacturónico. Las pectinas con valores de GM > 50 se las denomina de alto contenido de metoxilo (cítricos, manzanas) y, con GM<50, se denominan pectinas de bajo metoxilo (papa, pera, receptáculos de girasol) ENZIMAS PÉCTICAS Las enzimas pécticas constituyen un grupo de enzimas que catalizan la degradación de los polímeros pépticos en la pared celular de las plantas. La depolimerización de la pectina esta generalmente asociada con el proceso de maduración de la fruta. Estas enzimas juegan un rol significativo en los cambios que ocurren en el almacenamiento post-cosecha de frutas y vegetales. Las enzimas pécticas están ampliamente distribuidas en la naturaleza, encontrándose en plantas superiores (citrus, tomate, banana, manzana, pera, papas, uvas etc.) y en microorganismos, tanto en bacterias, como en hongos y levaduras. Las pectinasas microbianas son importantes desde el punto de vista industrial principalmente por su uso en el procesamiento de frutas y vegetales (elaboración de vinos, extracción y clarificación de jugos de frutas, extracción de aceites vegetales, maceración de vegetales, etc) Clasificación de las enzimas pécticas Las enzimas pécticas han sido clasificadas en dos grandes grupos: enzimas desesterificantes y enzimas depolimerizantes. Enzimas desesterificantes: Pectinesterasa (PE) (EC ): La enzima PE cataliza la desesterificación de los grupos metil-ester de los galacturonanos de las sustancias pécticas liberando ácido péctico y metanol (Fig. 2). La actividad pectinesterasa puede ser medida por diferentes métodos, usualmente se mide por titulación de los grupos carboxilos producidos a partir de pectina. Otros métodos se basan en la determinación del metanol producido, en este método el metanol puede ser destilado y medido por oxidación a formaldehído, o bien se lo puede transformar en un nitrito metílico volátil que se determina por cromatografía gas-líquido. 2

3 Enzimas depolimerizantes Poligalacturonasas (PG): Endopoligalacturonasas (endo-pg) (EC ): Producen ruptura al azar de los enlaces glicosídicos -1,4 del ácido péctico (Fig.1), liberando monómeros de AG u oligómeros de dos o tres restos. Las endo-pg se miden por reducción de vioscosidad, ya que producen hasta un 50 % de caída en la viscosidad de una solución de pectina. Exopoligalacturonasas (exo-pg) (EC ): Hidrolizan las uniones -1,4 de los enlaces glicosídicos a partir del extremo no reductor de la cadena de ácido péctico, dando ácido galacturónico como producto mayoritario de la reacción (Fig. 2).La actividad exo-pgasa se mide con el método colorimétrico del 3,5-dinitrosalicilico, por el incremento de los grupos reductores. Pectinliasas (PL) (EC ): Rompen los enlaces glicosídicos -1,4 de la molécula de ácido péctico por un mecanismo de -eliminación, descubierto por Albersheim y col., 1960, formando un doble enlace entre los carbonos 4 y 5 por cada enlace glicosídico roto (Fig.2). Los mejores sustratos para esta enzima son las pectinas altamente esterificadas. El método más conveniente para medir la actividad de las pectinliasas es medir el incremento de la absorbancia a 235 nm a partir del aumento producido por la formación del doble enlace. Urónido PL Oligómero Pectina PE PG Ac poligalacturónico Ac. galacturónico PG Figura 2: Modo de acción de las enzimas pécticas 3

4 2.2.2 Aplicaciones industriales de las enzimas pécticas Las pectinasas microbianas son ampliamente utilizadas en el procesamiento industrial de frutas y vegetales, para facilitar la extracción del jugo y en la clarificación de jugos de frutas y vinos. En los jugos cítricos, son responsables de la pérdida de turbidez, siendo además usadas para clarificar jugos de manzana y uva. Algunas pectinasas (protopectinasas) tienen la capacidad de liberar sustancias pécticas cementantes de la pared celular de las plantas, produciendo la maceración de los tejidos vegetales En el proceso de maceración, la pectina insoluble presente en la laminilla media es degradada, con la consiguiente liberación de células individuales y agregados celulares. Para tal propósito, únicamente el material cementante intercelular y parte de la pared celular primaria de las plantas debe ser degradado, sin dañar la pared celular secundaria, a los efectos de evitar la lisis celular. Este método presenta ventajas sobre la disgregación mecánica ya que conserva intactos el flavor, los pigmentos y los componentes celulares, propiedades sumamente interesantes en ciertos productos alimenticios. Los procesos enzimáticos de maceración complementan a los procesos clásicos mecánicos y térmicos ya que estos generan pulpas y jugos de calidad no satisfactoria. La incorporación de enzimas macerantes mejora la calidad de los productos a consecuencia del suave tratamiento enzimático. Estos tratamientos son de interés en la producción de néctares de frutas, en la elaboración de purés vegetales (papa, zanahoria, etc.) y de alimentos infantiles en general así como también en el tratamiento preliminar del café, cacao y fibras de plantas con el fin de eliminar la pulpa de fruta no deseada 3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1. Extracto enzimático: se utilizará el extracto enzimático producido mediante fermentación en medio líquido por un microorganismo pectinolítico aislado en la cátedra de Biotecnología: la levadura Picchia anómala Determinación de la actividad poligalacturonasa (PGasa) * Por Determinación de grupos reductores La actividad PGasa se medirá por determinación de los grupos reductores liberados con el método de Somogy Nelson, usando ácido galacturónico como referencia. 4

5 Técnica enzimática Sustrato: ácido poligalácturónico (APG) al 0,2 % P/V en buffer acetato-ácido acético 0,2 M, ph 5,0. Reactivo Somogyi Nelson: Tartrato de sodio y potasio, Carbonato disódico anhidro, Sulfato de Cobre, Carbonato ácido de sodio, Sulfato desódico anhidro, Molibdato de amonio, Acido sulfúrico, Arsenito de sodio anhidro heptahidratado. Procedimiento: 1. Rotular los tubos correspondientes ( 3 tubos por muestra y 1 blanco de sustrato). 2. Colocar 180 µl del sustrato (APG al 0,2%) en cada tubo, los mismos se mantendrán en baño de agua-hielo. 3. Agregar a los tubos, 20 μl del extracto enzimático (menos a los blancos). 4. Incubar los tubos a 37 ºC, durante 10 min. 5. Sacar los tubos del baño y colocarlos en un baño de agua-hielo. 6. Agregar todos los tubos 200 μl del reactivo Somogyi a cada tubo. 7. Agregar a los blancos 20 μl del extracto enzimático dil. 1/ Llevar a ebullición (100ºC) durante 10 min. 9. Enfriar durante 10 min. A temperatura ambiente. 10. Agregar todos los tubos 200 μl del reactivo Nelson a cada tubo. 11. Dejar en reposo durante 30 min. 12. Agregar a cada tubo 1,8 ml de agua. Agitar. 13. Medir absorbancia a 660 nm. Utilizando la curva de calibración (Absorbancia vs Acido Galacturónico) se determinará la concentración de ácido galacturónico producido. Fundamento de la técnica: La determinación de azúcares reductores mediante el método de Somogyi-Nelson se basa en la capacidad de estos azúcares para reducir agentes oxidantes suaves como el Cu2+.. El Cu2+ se reduce a Cu+, y en presencia de arsenomolibdatoamónico forma un complejo de color azul, a partir del cual podemos conocer mediante espectrofotometría la cantidad de cobre reducido, y por lo tanto, de azúcar reductor. Una unidad de la actividad PGasa fue definida como la cantidad de enzima que libera un µmol de acido galacturónico por minuto bajo las condiciones de ensayo. 5

6 3.2.1 Efecto del ph sobre la actividad PGasa El efecto del ph sobre la actividad PGasa se determinará, incubando la mezcla de reacción a diferentes phs: 3,5, 4, 5 y 6, durante 10 min y posterior determinación de los grupos reductores liberados por el método de Somogy-Nelson. Procedimiento: 1. Rotular tubos finos y largos, colocando el correspondiente ph de reacción (2 tubos por ph) y agregar a cada tubo 180 µl del sustrato (sn de APG) preparado en el buffer correspondiente. Colocar estos tubos en baño de agua hielo. 2. Preparar un tubo para blanco de sustrato. 3. Agregar a los tubos del punto 1, el extracto enzimático diluido (20 µl) e incubar a 37 ºC durante 10 min, y proseguir según la técnica de Somogy-Nelson. ph de Absorbancia Abs.Muestra Abs. Blco. Producto de reacción (Acido UE/ml* reacción Muestra galacturónico) mg/l Efecto de la temperatura sobre la actividad PGasa Dentro de ciertos límites, la velocidad de reacción aumenta con la temperatura. En general la velocidad se duplica a cada incremento de unos 10 C y viceversa. Existe una temperatura óptima, por encima de esta, la velocidad decrece rápidamente por desnaturalización de la enzima. La temperatura de máxima actividad no corresponde necesariamente a la temperatura de máxima estabilidad. El efecto de la temperatura sobre la actividad PGasa se determinará, incubando la mezcla de reacción a diferentes temperaturas entre 5ºC - 37 ºC - 45 C - 55 ºC, durante 10 min. Procedimiento: 1. Rotular los tubos correspondientes a cada temperatura ( 2 tubos por muestra y 1 blanco): 5ºC - 37 ºC - 45 C - 55 ºC. 2. Idem técnica medida actividad poligalactuornasa por grupos reductores, pero incubar 6

7 a las temperaturas correspondientes (5ºC - 37 ºC -45 C - 55 ºC.) durante 10 min. Resultados Temp. de Absorbancia Abs.Muestra Abs. Producto de reacción UE/ml* reacción Muestra Blco. (Acido galacturónico) mg/l Conclusiones 4. Aplicación del extracto enzimático en la maceración de tejidos vegetales: Se evaluará el efecto del tiempo y la velocidad de agitacion (shear) sobre el proceso de maceracion de tejidos de papa con el extracto mediante un método semicuantitativo. Procedimiento: 1. Pelar y lavar con agua destilada las papas a ser utilizadas para los ensayos de maceración. 2. Cortar las papas en cilindros de 3 mm de diámetro y 4 mm de espesor utilizando un sacabocado de laboratorio. 3. Realizar el tratamiento térmico del material vegetal, inmediatamente después de obtenido, con calor (5 min, a vapor fluente) para inactivar las enzimas endógenas (pectinesterasa) y disminuir la carga microbiana. 4. Colocar 3 g de cilindros de papa en frascos Erlenmeyers de 50 ml y agregar 5 ml de BAc, ph 5. Agregar a cada Erlenmeyer, 5 ml de EE sin diluir y al blanco agregar 5 ml de agua destilada. 6. Incubar los Erlenmeyer con agitación en shaker reciproco a 37 C y 100 golpes/min durante 2 h. 7. Filtrar el contenido total de cada frasco a través de malla de 20 mesh. 8. Recolectar el filtrado en tubos cónicos de vidrio graduados de 10 ml. 9. Colocar los tubos cónicos en la heladera (5 C) durante 2 h para realizar el proceso de sedimentación. 10. Medir el volumen de células simples sedimentadas. 7

8 Resultados - Conclusiones 5. Determinación cualitativa de la actividad pectinolítica por el método del Hoyo (cup-plate assay) Técnica del hoyo: Se realizará un ensayo cualitativo y semi-cuantitativo para la determinación de la actividad pectinolítica mediante la técnica del hoyo (cup-plate assay) de los extractos enzimáticos obtenidos a partir de cultivo en medio líquido de los microorganismos Procedimiento: Se prepararán placas conteniendo un medio agarizado compuesto de: ácido poligalácturónico y agar. Utilizando un sacabocado se realizarán hoyos de 5 mm de diámetro y 4 mm de profundidad, los que se llenarán con 50 l del filtrado enzimático. Las cajas se incubarán en cámara húmeda, a 35 ºC durante 24 y 48 h. Luego de este tiempo se inundarán las placas con HCl. Se medirá el diámetro de los halos de hidrólisis formados. Cámara húmeda: las placas se incubarán en cámara húmeda a los efectos de evitar el desecamiento del medio durante el tiempo de incubación. La cámara húmeda se prepara colocando en el fondo de un recipiente una capa fina de algodón humedecido con agua. Las placas se colocan sobre la capa de algodón, el recipiente se cierra herméticamente y se coloca cuidadosamente en estufa. 8