19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: 2 197 164 1 Int. Cl. 7 : A61K 49/00 A61K 38/16 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: 9491933.6 86 Fecha de presentación: 03.06.1994 87 Número de presentación de la solicitud: 0711178 87 Fecha de publicación de la solicitud: 1.0.1996 4 Título: Composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre y procedimiento para su utilización. Prioridad: 09.06.1993 US 74319 73 Titular/es: THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION Fruit Street Boston, Ma 021, US 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: 01.01.04 72 Inventor/es: Bogdanov, Alexei A.; Weissleder, Ralph; Brady, Thomas J. y Callahan, Ronald 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: 01.01.04 74 Agente: Curell Suñol, Marcelino ES 2 197 164 T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 28036 Madrid
DESCRIPCIÓN Composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre y procedimiento para su utilización. 1 2 3 4 0 La presente invención se refiere al diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre mediante técnicas de medicina nuclear. El diagnóstico por imagen nuclear de la acumulación de sangre, es decir el diagnóstico por imagen de sangre marcada por radioactividad para permitir la visualización de una acumulación de sangre, es una herramienta clínica de diagnóstico bien probada. Las aplicaciones corrientes para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre son la determinación de la función cardíaca tras el infarto de miocardio y los estudios de hemorragia, es decir, la detección de zonas de hemorragia ocultas, típicamente en el tracto gastrointestinal. El documento EPA 0 233 619 da a conocer un compuesto de alto peso molecular unido a un elemento metálico radioactivo que comprende un compuesto de poliamina, p. ej.: polilisina, un compuesto formador de quelato y un elemento metálico radioactivo que está unido al quelato en el compuesto formador de quelato. El diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre se realiza marcando los glóbulos rojos de un paciente con un isótopo radioactivo, p. ej.: pertecnetato 99mTc. Algunos procedimientos de marcaje de la sangre necesitan la extracción de sangre del paciente para el marcaje in vitro, después de lo cual la sangre marcada se vuelve a introducir al paciente. Por consiguiente, tales procedimientos son relativamente de larga duración y llevan consigo riesgos inherentes de manipulación de la sangre, p. ej.: la transmisión de enfermedades infecciosas al inyectar la sangre marcada en el paciente impropio. Otros procedimientos de diagnóstico por imagen implican el marcaje in vitro de los glóbulos rojos, pero estos procedimientos producen típicamente eficacias de marcaje menores del 8%. Además, todos estos procedimientos requieren por lo menos a minutos de tiempo de preparación por paciente. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre que comprende un agente para el diagnóstico por imagen que comprende un eje central polimérico, grupos protectores y grupos quelantes, en el que cada uno de dichos grupos protectores y grupos quelantes están unidos por enlaces covalentes independientemente a un grupo amino presente en dicho eje central o a un grupo químico unido directamente a un grupo amino presente en dicho eje central y en el que dichos grupos protectores son polietilenglicol, derivados de polietilenglicol o copolímeros de polietilenglicol, un compuesto reductor y un tampón, p. ej.: un tampón que comprende acetato de sodio; y dicha composición comprende opcionalmente además un estabilizador. Las composiciones de la invención eliminan la necesidad de manipular y marcar los productos sanguíneos. El eje central polimérico puede ser un poliaminoácido con a residuos de aminoácido, opcionalmente polil-lisina. Los grupos protectores pueden comprender entre 17 y 2 grupos (OCH 2 CH 2 ), opcionalmente entre 4 y 0 grupos (OCH 2 CH 2 ); o pueden comprender derivados de polietilenglicol, opcionalmente metoxipolialquilenglicol o un polímero de polietilenglicol monoesterificado con un ácido dicarboxílico. Los grupos quelantes pueden unir cationes de elementos de transición y lantánidos, opcionalmente cationes de tecnecio o cationes de indio, tal como pertecnetato 99mTc. El grupo quelante se puede seleccionar de entre ácido dietilentriaminpentaacetico, mercaptoacetiltriglicina, etilendicisteína, 1-imina-4-mercaptobutano y ácido bis(aminoetanotiol) carboxílico; o puede contener fósforo o boro. El compuesto reductor puede ser cloruro estannoso (II) o ditionito de sodio. La relación molar de dicho compuesto reductor con relación a dicho agente para el diagnóstico por imagen puede estar comprendida entre :1 y 0:1. Si se emplea un estabilizador, se puede seleccionar de entre ascorbato de sodio, aminobenzoato de sodio, cisteína, citrato de sodio y mezclas de los mismos. Los grupos protectores pueden estar unidos a dicho eje central mediante un enlace biodegradable o no biodegradable. 6 2
Más preferentemente, el agente de diagnóstico por imagen es un compuesto de fórmula: 1 en la que los grupos 2 3 4 0 6 pueden estar unidos en cualquier orden, p. ej., la unidad con R 1 puede estar repetida varias veces en la cadena antes de que aparezca una unidad con R 2 y viceversa; en la que k es -; R 1 es (CH 2 ) 4 NHCO(CH 2 ) n COOCH 2 CH 2 A-B- OR 3, en el que n = 0-8, R 3 = H, (CH 2 ) p CH 3 ó (CH 2 ) p COOH, en el que p = 0-7, A = [OCH 2 CH 2 ] x, en el que x es 1-2 y B = [OCH 2 CH 2 ] x ó [OCH(CH 3 )CH 2 ] y, en los que y+x es -2; y R 2 es (CH 2 ) 4 -R 4, en el que R 4 es un grupo quelante. Por lo tanto, las composiciones de la invención contienen un agente para el diagnóstico por imagen que se puede marcar fácilmente con un isótopo radioactivo e inyectar a un paciente. El agente para el diagnóstico por imagen comprende un conjugado covalente de un portador polimérico con grupos protectores y grupos quelantes. El agente para el diagnóstico por imagen comprende preferentemente un eje central de aminoácido conjugado con grupos protectores de polietilenglicol y grupos quelantes derivados del ácido acético, más preferentemente el eje central es un conjugado de poli-l-lisina con un monometoxi éter de polietilenglicol-o-succinato y con ácido dietilentriaminpentaacético. La composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre incluye un agente para el diagnóstico por imagen de la invención, un tampón y un compuesto reductor. Cuando se añade un isótopo radioactivo a la composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre para marcar el agente de diagnóstico por imagen, el compuesto reductor reduce ventajosamente el estado de oxidación del isótopo radioactivo hasta un estado en que se une fácilmente a los grupos quelantes del agente para el diagnóstico por imagen. En este estado de oxidación, el isótopo se une rápidamente al agente para el diagnóstico por imagen y el agente para el diagnóstico por imagen marcado resultante proporciona un excelente diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre cuando se inyecta por vía intravenosa en un paciente. El tampón mantiene el ph de las composiciones a un nivel fisiológicamente aceptable. Las composiciones de la invención son particularmente adecuadas para el marcaje con tecnecio, isótopo que es ventajoso para su utilización en aplicaciones de diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre. El tecnecio, tal como se suministra habitualmente, no se une a agentes quelantes. De forma significativa, las composiciones de la invención se pueden marcar fácil y rápidamente con tecnecio, sin necesitar la purificación del tecnecio. La composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre puede estar en forma de solución, o se puede secar por congelación y liofilizar para formar un polvo. Preferentemente, la composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre tiene un ph comprendido entre aproximadamente 4 y 6, más preferentemente entre aproximadamente,1 y,2. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para diagnosticar por imagen una acumulación de sangre en un paciente. El procedimiento comprende proporcionar una composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre que comprende un agente para el diagnóstico por imagen radiomarcado de la invención, un compuesto reductor y un tampón y que introduce la composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre en el torrente sanguíneo del paciente. Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para preparar una composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre de la invención. El procedimiento incluye preparar una solución tampón, disolviendo el nuevo agente para el diagnóstico por imagen en la solución tampón y añadir un compuesto 3
1 2 3 4 0 6 reductor a la solución. Preferentemente la solución tampón tiene un ph de aproximadamente 9 a 11 y se añade una cantidad suficiente de un compuesto reductor solubilizado en ácido para llevar el ph de la solución a aproximadamente 4 a 6. Preferentemente, la solución tampón está prácticamente exenta de oxígeno, p. ej., no contiene oxígeno disuelto del aire apreciable y la relación molar del compuesto reductor con relación al agente para el diagnóstico por imagen está comprendida preferentemente entre :1 y 0:1. El término grupo protector, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula que impide que, una molécula del eje central y un grupo quelante procedente de la unión extensa del agua con sus cadenas, pueda inhibir el contacto con otras macromoléculas. El término grupo quelante, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una o más moléculas, o radicales químicos, o grupos, que proporcionan un medio favorable para unirse a un catión. La disociación del catión del medio está impedida debido a la estabilidad cinética o/y termodinámica del enlace al grupo quelante. El verbo marcar tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la unión de un isótopo radioactivo o de un catión que incluye el isótopo a un grupo quelante del agente para el diagnóstico por imagen mediante quelación. El término derivado tal como se utiliza en la presente memoria significa un compuesto cuya estructura central es la misma que, o se parece exactamente a la de un compuesto de la familia, pero que presenta una modificación química o física, tal como los grupos laterales diferentes o adicionales; el término incluye los copolímeros de los compuestos de la familia que pueden estar unidos a otros átomos o moléculas. A partir de la siguiente descripción de las formas de realización preferidas y a partir de las reivindicaciones, se pondrán de manifiesto otras características y ventajas de la invención. La Fig. 1 es un gráfico de la cinética de depuración de la sangre observada en conejos inyectados con una composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre según una forma de realización de la invención. La Fig. 2 es un gráfico de la cinética comparativa de depuración de la sangre observada en el mono Rhesus inyectado con una composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre y un mono Rhesus inyectado con glóbulos rojos marcados con tecnecio (Tc). La Fig. 3 es un gráfico de las relaciones corazón:órgano de un mono Rhesus inyectado con una composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre y un mono Rhesus inyectado con glóbulos rojos marcados con Tc. Las Figs. 4 y 4a representan imagenes del tórax y abdomen con cámara gamma, respectivamente, de un mono Rhesus inyectado con una composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre y un mono Rhesus inyectado con glóbulos rojos marcados con Tc. Los agentes para el diagnóstico por imagen preferidos incluyen un eje central polimérico con aminoácidos que están unidos covalentemente y grupos protectores. Se prefiere que aproximadamente entre el 2 y el % de los aminoácidos del eje central estén unidos covalentemente a grupos protectores y que los grupos amino restantes estén unidos covalentemente a grupos quelantes. Los ejes centrales preferidos incluyen poliaminoácidos, polietileniminas, sacáridos naturales, polisacáridos aminados, oligosacáridos aminados, poliamidoamina, ácidos poliacrílicos y polialcoholes. Los poliaminoácidos preferidos tienen a residuos de aminoácido, más preferentemente de a residuos de aminoácido, un peso molecular de 1.000 a 0.000 daltons y son preferentemente no proteicos. El poliaminoácido puede ser un polímero de una sola especie, o por lo menos de dos especies de aminoácido, o puede ser un copolímero de bloqueo. El poliaminoácido puede incluir fragmentos de poliaminoácido unidos por enlaces escindibles, p. ej.: enlaces S-S. En particular, el poliaminoácido puede ser, p. ej., poli-l-lisina, poli-d-lisina, poli-alfa,beta-(2-aminoetil)-d,l aspartamida o ácido poli-l-aspártico. Preferentemente, el eje central es una polilisina, más preferentemente poli-l-lisina, con un peso molecular de aproximadamente 2 a kd. Los ejes centrales poliméricos contienen preferentemente enlaces péptido. Los mismos enlaces están implicados en conjugar los grupos quelantes con los grupos amino de eje central. Los agentes para el diagnóstico por imagen, por lo tanto, son potencialmente biodegradables mediante varias peptidasas animales no específicas. Para favorecer la eliminación in vivo del agente para el diagnóstico por imagen, los elementos del eje central polimérico, los grupos protectores o los grupos quelantes podrían estar unidos conjuntamente mediante un enlace semiestable, tal como los enlaces S-S. Pequeñas cantidades de composiciones atrapadas pueden ser eliminadas del cuerpo por degradación a fragmentos más pequeños. Sin embargo, se puede utilizar una variedad de derivados activados de PEG para la preparación del agente para el diagnóstico por imagen haciéndoles de este modo prácticamente no degradables. Los compuestos adecuados para su utilización como grupos quelantes incluyen los que unen cationes de elementos de transición y lantánidos. Los agentes quelantes preferidos son los que unen cationes de tecnecio, p. ej.: pertecnetato 99 mtc y/o cationes de indio, p. ej.: In (III). Los grupos quelantes que unen tecnecio incluyen, áci- 4
1 do dietilentriamin-pentaacético (DTPA), mercaptoacetiltriglicina, etilendicisteína, 1-emina-3-mercaptobutano y ácido bis (aminoetanotiol) carboxílico. Otros grupos quelantes incluyen ácido trietilentetramina-hexaacético, ácido etilendiamin-tetraacético (EDTA), ácido 1,2-diaminociclo-hexano-N,N,N,N -tetra-acético, N,N -di(2-hidroxibencil) etilendiamina, ácido N-(2-hidroxietil)etilendiamintriacético, ácido nitrilotriacético, ácido etilen-bis(oxietilen-nitrilo) tetraacético, ácido 1,4,7,-tetraazaciclodo-decano-N,N,N,N -tetraacético, ácido 1,4,7,-tetraaza-ciclododecano- N,N,N -triacético, 1,4,7- tris(carboximetil)--(2 -hidroxipropil)-1,4,7,,tetraazociclodecano, ácido 1,4,7-triazaciclonano-N,N,N -triacético o el ácido 1,4,8,11-tetraazacicloteta-decano-N,N,N,N -tetraacético. Algunos grupos quelantes preferidos pueden contener átomos de fósforo o de boro. Los grupos protectores preferidos son los derivados de polietilenglicol (PEG). Los grupos protectores preferidos comprenden de 17 a 2, más preferentemente de 4 a 0 grupos (OCH 2 CH 2 ). Los grupos protectores pueden ser, p. ej.: polietilenglicol, metoxipolietilenglicol, un copolímero de polietilenglicol, metoxipolietilenglicol, o metoxipolipropilenglicol, o derivados de los mismos. Además, los grupos protectores pueden ser un copolímero de bloqueo de polietilenglicol y uno del grupo de poliaminoácidos, polisacáridos, poliamidoaminas, polietilenaminas o polinucleótidos. El grupo protector puede ser también un copolímero de polietilenglicol, incluyendo un monoéster de un ácido dicarboxílico. El grupo protector tiene preferentemente un peso molecular de 00 a.000 daltons. Los agentes para el diagnóstico por imagen de la invención pueden presentar de este modo, la fórmula: 2 en la que los grupos 3 4 0 6 pueden estar unidos en cualquier orden, p. ej., la unidad con R 1 puede estar repetida varias veces en la cadena antes de que aparezca una unidad R 2 y viceversa; en la que k es de a ; R 1 es (CH 2 ) 4 NHCO(CH 2 ) n COOCH 2 CH 2 A-B- OR 3, en el que n = 0-8, R 3 = H, (CH 2 ) p CH 3 ó (CH 2 ) p COOH, en el que p = 0-7, A = [OCH 2 CH 2 ] x, en el que x es de 1 a 2 y B = [OCH 2 CH 2 ] x ó [OCH(CH 3 )CH 2 ] y, en los que y+x es a 2; y R 2 es (CH 2 ) 4 -R 4, en el que R 4 es un grupo quelante. Los agentes para el diagnóstico por imagen para su utilización en la invención se pueden sintetizar utilizando un procedimiento preferido descrito a continuación en el Ejemplo 1. La composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre de la invención se forma mezclando el agente para el diagnóstico por imagen con una solución tampón y un compuesto reductor. Estos tres componentes se pueden mezclar utilizando procedimientos estándar conocidos en la materia. Preferentemente, el agente para el diagnóstico por imagen se disuelve en primer lugar en la solución tampón, después de lo cual el compuesto reductor se añade a ésta. En el Ejemplo 1 se describe un procedimiento adecuado. Las sales de tampón adecuadas para su utilización en la preparación de la solución tampón, incluyen las sales de ácidos mono o di-carboxílicos, o los ácidos 2-(N-morfolino) alquilsulfónicos. Una sal de tampón preferida es el acetato de sodio. Preferentemente, la solución tampón contiene además hidróxido de sodio para contrarrestar un ph decreciente. En el Ejemplo 1, más adelante, se describe un procedimiento preferido para preparar la solución tampón. Preferentemente, el tampón tiene una concentración desde aproximadamente 0,1 a 0,2 M. El agente para el diagnóstico por imagen se disuelve preferentemente en la solución tampón a una concentración de aproximadamente 0,1 a mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 1 a mg/ml. Los compuestos reductores adecuados incluyen el cloruro estannoso (II) o el ditionito de sodio. Un compuesto reductor preferido es una solución de cloruro estannoso (II) es ácido clorhídrico o acético concentrado. La solución
1 2 3 4 0 6 preferida presenta una molaridad de aproximadamente 80 a 90 mm. La cantidad de compuesto reductor (en moles) añadida a la solución tampón/agente para el diagnóstico por imagen es preferentemente menos de o igual a la cantidad molar de grupos quelantes en el agente para el diagnóstico por imagen. Más preferentemente, la relación molar de compuesto reductor con relación a los grupos quelantes es aproximadamente 0,:1 a 2:1, más preferentemente alrededor de 0,9:1 a 1:1. El ph de la solución resultante después de la adición del compuesto reductor es preferentemente alrededor de 4 a 6, más preferentemente alrededor de,1 a,2. Preferentemente, la composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre incluye un estabilizante, si la composición se ha de almacenar durante un periodo prolongado, p. ej.: más de 1 mes. Se puede utilizar cualquier estabilizante convencional, fisiológicamente aceptable, p. ej.: ascorbato de sodio, l-metionina, ácido p- aminobenzoico, aminobenzoato de sodio, cisteína, citrato de sodio y mezclas de los mismos. La composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre puede estar provista como una solución líquida, tal como se describió anteriormente, que se almacena preferentemente en viales estériles, en una atmósfera de gas inerte, p. ej., argón. Preferentemente, la composición se almacena a baja temperatura, más preferentemente menor o igual a -ºC. Por otra parte, la composición se puede someter a congelación en nieve carbónica y liofilización y almacenarse como polvo seco en una atmósfera de gas inerte. El polvo seco se puede almacenar típicamente a temperatura ambiente. Si la composición se suministra como solución, el agente para el diagnóstico por imagen se marca mezclando la composición con una solución patrón de un isótopo radioactivo. Si la composición se suministra en polvo, el polvo se redisuelve preferentemente en una solución estéril del isótopo en la solución salina fisiológica (NaCl al 0,9%). Típicamente el marcaje se completa en aproximadamente 3 minutos o menos, después de mezclar el isótopo y la composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre. La composición marcada se puede almacenar hasta aproximadamente 6 horas sin descomposición, aún si se marcó con una radiactividad de 0 mci/mg o mayor. Se puede utilizar cualquier isótopo radioactivo convencional procedente de los elementos de transición o lantánidos que se una a grupos quelantes. Tal como se expuso anteriormente, las composiciones para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre son particularmente útiles para marcar con tecnecio. Los isótopos de tecnecio son también preferidos para muchas aplicaciones, ya que proporcionan una calidad superior de diagnóstico por imagen y presentan una vida media corta, proporcionando baja exposición. Los isótopos preferidos comprenden el pertecnetato de 99 mtc, pirofosfato de 99 mtc y glucarato de 99 mtc. Dichos isótopos están disponibles en el comercio en, por ejemplo, Syncor Int l, (Chatsworth, CA), o en DuPont. Se utiliza una cantidad suficiente de isótopo para conseguir una radioactividad de 0,1 a GBq (gigabequerel) por mg del agente para el diagnóstico por imagen en la composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre. El volumen preferido y la radioactividad de la composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre que se ha de inyectar en un paciente particular variará en función de la aplicación del diagnóstico por imagen (p. ej.: cardiografía frente a estudios de hemorragia), de la masa corporal del paciente y de la sensibilidad del aparato para el diagnóstico por imagen que se ha de utilizar. Los volumenes preferidos pueden ser determinados fácilmente por el especialista, tomando estos factores en consideración. Típicamente, a un niño se administrará un volumen con una radioactividad de aproximadamente 1 a mci (37 a 370 GBq), mientras que a un adulto se administrará un volumen con una radioactividad de aproximadamente 1 a mci (37 a 7 GBq). El volumen necesario para proporcionar una radioactividad dada se puede determinar utilizando un contador Well u otro tipo de calibrador de dosis, tal como es sabido en la materia. Ejemplo 1 Se disolvió tampón de acetato de sodio en agua apirógena estéril en una concentración de 0,2 M (16, g/l). La solución tampón resultante se llevó a un ph de por adición de NaOH N, se hirvió durante 1 minuto y se enfrió a temperatura ambiente pasando una corriente lenta de nitrógeno a través de ella. Se preparó un agente para el diagnóstico por imagen de PEG-poli-l-lisina-DTPA, de la forma siguiente: Se disolvió 6 mg de poli-l-lisina (hidrobromuro de PL, peso molecular 41.0, (Sigma Chemical Co., DP: 196 residuos de l-lisina, grupos epsilon-amino 2 mm de hidrobromuro de l-lisina) en 112 ml de tampón de carbonato 0,1 M (ph 8,7). Se disolvió 2,9 g de metoxi polietilen glicolsuccinil hidroxisuccimidil éster (MPEGOSu, peso molecular.0) en ml de DMSO anhidro. Se añadió gota a gota la solución de MPEGOSu a la solución de PL en agitación y se incubó la mezcla durante 2 horas en agitación para formar una solución de MGEG-PL. Se preparó una suspensión de anhídrido cíclico de DTPA (0, g/ml en DMSO) añadiendo porciones de 0 µl (1, g del total de cdtpa) a la solución de MPEG-PL y ajustando el ph a 8 con NaOH N después de cada adición. (Por otra parte, se puede preparar la solución mezclando 2, mmol de DTPA, 0, mmol de N-hidroxisulfosuccinimida (ph 4) y 0, mmol de etil diaminopropilcarbodiimida en 0 ml de agua). Se mezcló la solución a continuación durante 3 min y se añadió a la mezcla la solución de MPEG-PL (ph 8). No se detectaron en este punto grupos amino valorables. Se diluyó a continuación la mezcla de reacción hasta 0 ml con citrato de sodio 0,2 M (ph 6), se filtró a través de filtro de nilón de 0,4 µm y se dializó en un célula de flujo descendente utilizando una membrana con un umbral de 0 kd (para proteínas globulares). Se concentró a continuación el producto hasta a 0 ml y se diluyó hasta 0 ml con citrato. Se repitió este procedimiento dos veces utilizando en la última etapa agua en lugar de citrato. Se consiguió la 6
purificación final pasando la solución a través de una resina de intercambio aniónico DEAE. Se recogió el producto en flujo descendente. Se filtró a continuación el producto a través de una membrana estéril de 0,2 µm, produciendo el agente para el diagnóstico por imagen final. 1 Este agente para el diagnóstico por imagen se disolvió a continuación en la solución tampón, a una concentración de 1 mg/ml. Se añadió a continuación el compuesto reductor, solución al 2% de cloruro estannoso (II) en ácido clorhídrico concentrado, a la solución tampón, en una proporción volumétrica de µl por ml. El ph resultante del tampón fue aproximadamente de,1. Para marcar el agente para el diagnóstico por imagen en la composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre, se mezcló la solución con una solución acuosa de pertecnetato 99mTc. El marcaje procedió rápidamente, reduciéndose aproximadamente el 98% del pertecnetato y asociándose íntimamente con los grupos quelantes del agente para el diagnóstico por imagen en aproximadamente 1 a 3 minutos. Ejemplo 2 2 Se inyectó a cuatro conejos blancos de Nueva Zelanda con 18 MBq ( mci) de la composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre del Ejemplo 1, diluida en 1 ml de solución salina. Se determinó el volumen correcto de solución requerido para proporcionar mci de radioactividad utilizando un contador Well. Se extrajeron muestras de sangre de la venas de la oreja de los conejos en 6 intervalos de tiempo y se determinó la radioactividad de cada muestra por contaje gamma, con los resultados representados en la Fig. 1. En la Fig. 1, la radioactividad observada de la muestra inyectada fue inicialmente el 0% de la radioactividad de la composición inyectada y disminuyó lentamente hasta aproximadamente el % después de alrededor de horas. Los datos de la Fig. 1 se corrigieron para la desintegración. Ejemplo 3 3 4 0 6 Se inyectó a un mono Rhesus macho con 18 MBq de la composición marcada para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre del Ejemplo 1 (+). En un experimento independiente, el mismo animal se inyectó con glóbulos rojos con 18 MBq marcados con Tc99m (*) (Tc99m-RBC). Se extrajeron muestras de sangre en varios intervalos de tiempo después de cada inyección y se determinó la radioactividad de cada muestra por contaje gamma, con los resultados representados en la Fig. 2. Tal como se representa en la Fig. 2, en ambos experimentos la radioactividad (% de dosis por gramo) disminuyó al principio rápidamente y a continuación permaneció el nivel relativamente durante aproximadamente 16 horas. Tal como se representa, la composición para el diagnóstico por imagen de la invención dio resultados comparables a los obtenidos utilizando glóbulos rojos marcados con Tc. Los datos se corrigieron para la desintegración. Ejemplo 4 Se inyectó a un mono Rhesus macho con 18 MBq de la composición marcada para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre del Ejemplo 1. En un experimento independiente, una semana después, el mismo animal se inyectó con glóbulos rojos con 18 MBq marcados con Tc99m (*) (Tc99m-RBC). Se determinaron las relaciones corazón:órgano para cada uno midiendo las cuentas en el pulmón y en el hígado con una cámara gamma. Las relaciones en el hígado y en el pulmón, respectivamente, para la composición del Ejemplo 1 se representan por los símbolos + y * y para Tc-RBC, mediante los símbolos y x. Ejemplo Se inyectó a un mono Rhesus macho con 18 MBq de la composición marcada para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre del Ejemplo 1. En un experimento independiente, una semana después, se inyectó el mismo animal con glóbulos rojos con 18 MBq marcados con Tc99m (*) (Tc99m-RBC). Se tomaron imagenes con una cámara gamma del tórax y del abdomen del mono Rhesus 1, 2 y 1 horas después de cada inyección, tal como se representa en la Fig. 4. Tal como se representa en las Figs. 1 a 4, se obtuvo una imagen estable inmediatamente después de la inyección con la composición para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre del Ejemplo 1 y la calidad del ventriculograma, es decir, las relaciones corazón/hígado y corazón/pulmón observadas, permaneció constante durante por lo menos 3 a 6 horas después de la inyección. Las figuras ilustran además que las composiciones preferidas para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre dan relaciones corazón/órgano muy similares a las relaciones obtenidas utilizando glóbulos rojos marcados con Tc. Otras formas de realización están comprendidas en las reivindicaciones. 7
REIVINDICACIONES 1 2 1. Compuesto para el diagnóstico por imagen de la acumulación de sangre, que comprende: un agente para el diagnóstico por imagen que comprende un eje central polimérico, grupos protectores y grupos quelantes, en el que cada uno de dichos grupos protectores y grupos quelantes están unidos por enlaces covalentes independientemente a un grupo amino presente en dicho eje central o a un grupo químico unido directamente a un grupo amino presente en dicho eje central y en el que dichos grupos protectores son polietilenglicol, derivados de polietilenglicol o copolímeros de polietilenglicol, un compuesto reductor, y un tampón, p. ej.: un tampón que comprende acetato de sodio; comprendiendo además dicha composición opcionalmente un estabilizador. 2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho eje central polimérico es un poliaminoácido con a residuos de aminoácido, opcionalmente poli-l-lisina. 3. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que: (a) dichos grupos protectores comprenden de 17 a 2 grupos (OCH 2 CH 2 ), opcionalmente de 4 a 0 grupos (OCH 2 CH 2 ); ó (b) dicho grupo protector es un derivado de polietilenglicol, opcionalmente unmetoxipolietilenglicol o un polímero de polietilenglicol monoesterificado con un ácido dicarboxílico. 4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho grupo quelante se une a cationes de elementos de transición y lantánidos, opcionalmente cationes de tecnecio o cationes de indio.. Composición según la reivindicación 4, en la que dicho grupo quelante se une a pertecnetato 99mTc. 6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a, en la que: 3 (a) dicho grupo quelante se puede seleccionar de entre ácido dietilentriamin-pentaacético, mercaptoacetiltriglicina, etilendicisteína, 1-imina-4-mercaptobutano y ácido bis(aminoetanotiol) carboxílico; o (b) dicho grupo quelante contiene fósforo o boro. 4 0 7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho compuesto reductor es cloruro estannoso (II) o ditionito de sodio. 8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la relación molar de dicho compuesto reductor con relación a dicho agente para el diagnóstico por imagen está comprendida entre :1 y 0:1. 9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además un estabilizante seleccionado de entre ascorbato de sodio, aminobenzoato de sodio, cisteína, citrato de sodio y mezclas de los mismos.. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dichos grupos protectores están unidos a dicho eje central con un enlace no biodegradable. 11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dichos grupos protectores están unida a dicho eje central con un enlace biodegradable. 12. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho agente de diagnóstico por imagen es un compuesto de fórmula: 6 8
en la que los grupos 1 pueden estar unidos en cualquier orden, p. ej., la unidad con R 1 puede estar repetida varias veces en la cadena antes de que aparezca una unidad con R 2 y viceversa; en la que k es -; R 1 es (CH 2 ) 4 NHCO(CH 2 ) n COOCH 2 CH 2 A-B- OR 3, en el que n = 0-8, R 3 = H, (CH 2 ) p CH 3 ó (CH 2 ) p COOH, en el que p = 0-7, A = [OCH 2 CH 2 ] x, en el que x es 1-2 y B = [OCH 2 CH 2 ] x ó [OCH(CH 3 )CH 2 ] y, en los que y+x -2; y R 2 es (CH 2 ) 4 -R 4, en el que R 4 es un grupo quelante. 2 3 4 0 6 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7--1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 9
ES 2 197 164 T3
11
12 ES 2 197 164 T3
13