LEER CAMBIOS SOMBREADOS

LEER CAMBIOS SOMBREADOS bioelisa HBsAg 3. 3-1158 96 tests 3-1159 48 tests Test de ELISA para la detección de antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en suero o plasma humano para ser utilizado en laboratorios clínicos y como prueba de cribado en bancos de sangre. Sumario La hepatitis B es una enfermedad causada por una infección vírica. A lo largo de la infección aparecen varios marcadores serológicos entre los cuales está el HBsAg. En 1964 Blumberg y col. 1 detectaron por primera vez en el suero de un aborigen australiano un antígeno que reaccionaba con un anticuerpo del suero de un paciente hemofílico de Nueva York. Posteriormente este antígeno se identificó como el antígeno de superficie de la hepatitis B. El descubrimiento del HBsAg significó un gran paso para el conocimiento y diferenciación de las hepatitis víricas. La presencia de HBsAg en suero o plasma constituye el marcador más importante para el diagnóstico de una infección por virus de la hepatitis B (HBV). En 1971 Engvall y Perlmann 2 y van Weemen y Schuurs 3 describieron por primera vez un enzimoinmunoensayo. El desarrollo posterior de la técnica y la utilización de microplacas por Voller y col. 4,5, han permitido confeccionar kits de diagnóstico de alta precisión y sensibilidad. Principio bioelisa HBsAg 3. es un método inmunoenzimático directo, de tipo «sandwich», en el que los pocillos de una microplaca han sido recubiertos con anticuerpo de cobaya anti-hbs que actúa como anticuerpo de captura y que utiliza como conjugado anticuerpo de cabra anti-hbs marcado con peroxidasa. La muestra a analizar se incuba en uno de los pocillos de la microplaca. Si la muestra contiene HBsAg éste se fijará al anticuerpo anti-hbs unido a la placa. Después de lavar para extraer el material no fijado, se añade el anticuerpo de cabra anti-hbs conjugado con peroxidasa, que reaccionará con el posible complejo antígeno-anticuerpo formado en la primera incubación. Después de esta segunda incubación y posterior lavado se procede a la adición del sustrato enzimático que contiene un cromógeno, lo que dará como resultado la aparición de color azul si la muestra es positiva para HBsAg. El color azul cambia a amarillo después de parar la reacción con ácido sulfúrico. La intensidad del color es proporcional a la concentración de HBsAg en la muestra. Componentes 1. MCPL MICROPLACA: 12 x 8 pocillos recubiertos con anticuerpo de cobaya anti-hbs. Pocillos separables individualmente. 2. CONJ 51x CONJUGADO CONCENTRADO: Anticuerpo de cabra anti-hbs conjugado con peroxidasa. Contiene colorante rojo, proteínas estabilizadoras, Bronidox al,2% y sulfato de gentamicina al,1%. A diluir 1/51 con el diluyente del conjugado antes de usarse. 3. DIL CONJ DILUYENTE DEL CONJUGADO: Tampón Tris que contiene colorante amarillo, aditivos, Bronidox al,2% y sulfato de gentamicina al,1%. Para diluir el conjugado concentrado. 4. WASH SOLN 1x SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA: Tampón fosfato concentrado (1x) que contiene Tween 2 al 1% y mertiolato sódico al,1%. Diluir 1/1 con agua destilada o desionizada antes de usarlo. 5. SUBS BUF TAMPÓN SUSTRATO: Tampón citrato-acetato que contiene peróxido de hidrógeno. 6. SOLN TMB CROMÓGENO: 3,3', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) disuelta en dimetilsulfóxido (DMSO). Contiene colorante rojo. 7. CONTROL + CONTROL POSITIVO: Suero humano normal diluido en tampón fosfato que contiene HBsAg purificado e inactivado y azida sódica al,2%. Contiene colorante verde. Listo para usar. 8. CONTROL CONTROL NEGATIVO: Suero humano negativo para HBsAg diluido en tampón fosfato que contiene azida sódica al,2%. Contiene colorante amarillo. Listo para usar. 459 3-1158 R3 6.212 spa.doc

9. H 2 SO 4 1N SOLUCIÓN DE PARADA (sólo en el kit de 1 placa): Ácido sulfúrico 1N. Listo para usar. 1. SEALS LÁMINAS ADHESIVAS: Para cubrir la microplaca durante las incubaciones. 11. BAG BOLSA DE PLÁSTICO: Para guardar las tiras sin usar. Precauciones bioelisa HBsAg 3. es sólo para el diagnóstico IN VITRO. Para uso exclusivo por profesionales. ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO. Todo el material de origen humano utilizado en la preparación de este producto ha sido encontrado negativo a la presencia de anticuerpos de los virus HIV-1/HIV-2 y HCV, así como a la del antígeno de superficie de la hepatitis B, utilizando un método comercial aprobado, excepto cuando necesariamente positivo. El HBsAg contenido en el control positivo ha sido inactivado a 6 C durante 1 horas. Sin embargo, dado que ningún método puede ofrecer la total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos, este producto debe manejarse con precaución: - No permitir que los reactivos entren en contacto con la piel o los ojos; si esto ocurre, lavar con abundante cantidad de agua. - Usar guantes. - No pipetear ningún reactivo con la boca. - No fumar. - Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Los restos de muestras, controles, reactivos aspirados y puntas desechables deben recogerse en un recipiente destinado al efecto y autoclavarse una hora a 121 C, o tratarse con hipoclorito sódico a una concentración final del 1%, durante 3 minutos. (Los restos que contengan ácido deben ser neutralizados antes de añadir el hipoclorito sódico). - Algunos reactivos de este kit contienen azida sódica como conservante. La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante. Precauciones de manejo: - Ajustar el lavador al tipo de placa utilizado (fondo plano), para realizar un buen lavado. - No mezclar reactivos procedentes de diferentes lotes. - No usar los reactivos una vez hayan caducado. - No utilice el reactivo si observa algún cambio de apariencia en cualquier componente incluido en el kit. - Deben extremarse las precauciones para evitar contaminaciones microbianas y contaminación cruzada entre los reactivos. - Utilizar una nueva punta desechable para pipetear cada muestra o reactivo. - Es muy importante preparar la solución de sustrato-tmb justo 5-1 minutos antes de ser empleada. Mantenerla en un recipiente bien tapado y al abrigo de la luz. - Restos de jabones y/o agentes oxidantes en los recipientes utilizados para la preparación de la solución sustrato-tmb, pueden interferir en la reacción. En caso de que se utilicen recipientes de vidrio, es conveniente lavarlos con ácido sulfúrico o clorhídrico 1N, enjuagarlos bien con agua destilada y secarlos antes de usarlos. Usar preferiblemente material plástico desechable. Conservación y estabilidad Los componentes permanecerán inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conservan entre 2-8 C. La bolsa que contiene la microplaca debe llevarse a temperatura ambiente antes de abrirla para evitar condensación en los pocillos. Una vez abierta la bolsa, la microplaca es estable por 3 meses guardada a 2-8 C en la bolsa de plástico bien cerrada, con la bolsita de silicagel. La solución de lavado, una vez diluida, es estable durante dos semanas si se conserva entre 2-8 C. El conjugado, una vez diluido es estable por 7 días a 2-8 C. Guardar el cromógeno al abrigo de la luz. La solución sustrato-tmb una vez preparada no es estable, por lo que se deben seguir estrictamente las indicaciones para su utilización. 459 3-1158 R3 6.212 spa.doc

Presentaciones disponibles - Kit de 1 placa (96 tests), REF 3-1158. Contiene: 1 placa, 1 x,4 ml conjugado concentrado, 1 x 16 ml diluyente del conjugado, 2 x 5 ml solución de lavado concentrada, 1 x 14 ml tampón sustrato, 1 x 1,5 ml cromógeno, 1 x 1,7 ml control positivo, 1 x 5 ml control negativo, 1 x 12 ml solución de parada, 1 bolsa de plástico y láminas adhesivas. - Kit de 5 placas (5 x 96 tests), REF 3-1159. Contiene: 5 placas, 1 x 1,3 ml conjugado concentrado, 2 x 3 ml diluyente del conjugado, 3 x 1 ml solución de lavado concentrada, 5 x 14 ml tampón sustrato, 1 x 1,5 ml cromógeno, 1 x 1,7 ml control positivo, 1 x 5 ml control negativo, 1 bolsa de plástico y láminas adhesivas. Material necesario no incluido - Agua destilada o desionizada. - Pipetas multicanal y micropipetas (1 µl) y puntas desechables. - Incubador (seco o con humedad) a 37 C 1 C. - Cronómetro. - Lector de microplacas con filtro de 45 nm. Recomendable filtro de referencia de 62 ó 63 nm. - Sistema de lavado manual o automático. - Solución de parada (kit de 5 placas): ácido sulfúrico 1N. También puede emplearse ácido sulfúrico 2N ó 4N. Recolección de la muestra Usar suero fresco o plasma (citrato/edta). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Las muestras pueden ser conservadas durante 3 días entre 2-8 C. Si es por un período de tiempo más largo las muestras deben ser congeladas (-2 C). Debe evitarse congelar y descongelar las muestras repetidamente. Partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. Los sueros o plasmas no deben ser inactivados por calor, ya que puede conducir a resultados incorrectos. Procesamiento automático Esta prueba permite su uso de modo automático o semiautomático en diferentes instrumentos. Es muy importante validar cualquier sistema automático para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras son equivalentes a los obtenidos empleándose el ensayo manual. Se recomienda que el usuario valide periódicamente el instrumento. Si encuentra cualquier dificultad en la programación y ajuste de los procesadores automáticos de Biokit, por favor contacte con su distribuidor. PROCEDIMIENTO (Ver esquema del procedimiento) Operaciones previas Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de empezar el ensayo. Los reactivos líquidos deben homogeneizarse suavemente antes de usarlos. Diluir la solución de lavado concentrada 1/1 con agua destilada o desionizada. Para una placa completa mezclar 5 ml de solución de lavado concentrada con 45 ml de agua. En caso de utilizar menos de una placa, preparar la parte proporcional de solución. Diluir el conjugado concentrado 1/51 con el diluyente del conjugado. Para una placa, añadir 24 µl del conjugado concentrado (color rojo) en 12 ml de diluyente del conjugado (color amarillo). Mezclar suavemente. Para menos de una placa seguir las indicaciones de la tabla 1. LA SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE TRABAJO TIENE UN COLOR NARANJA. TABLA 1 Tiras requeridas 1 2 4 6 8 1 12 Diluyente del conjugado ml 1, 2, 4, 6, 8, 1, 12, Conjugado concentrado µl 2 4 8 12 16 2 24 Monitorización de la adición de muestra y de reactivos El hecho de que la muestra no requiere predilución y que todos los reactivos y los controles son coloreados permite la monitorización de su adición en la microplaca por medio de lectura espectrofotométrica. Para ello, después de dispensar una placa esta debe leerse a 45 nm (sin filtro de referencia). Los valores de absorbancia deben ser: SUERO / PLASMA / CONTROLES:,1 CONJUGADO DE TRABAJO (color naranja):,5 SUSTRATO DE TRABAJO (color rosa):,5 459 3-1158 R3 6.212 spa.doc

Si en algún pocillo no se cumplen las especificaciones mencionadas, es indicativo de que ha habido algún problema durante la dispensación y debe ser investigado posteriormente. Realización de la prueba 1. Transferir 1 µl de cada uno de los controles positivo y negativo a los pocillos correspondientes. Utilizar como mínimo 3 pocillos para el control negativo, un pocillo para el control positivo y uno para el blanco de sustrato en todas las placas o fracción de las mismas cada vez que se realice el ensayo, independiente del número de muestras a probar. Dejar el pocillo del blanco vacío (se recomienda reservar el pocillo A1 para el blanco). 2. Transferir 1 µl de cada una de las muestras a analizar a los pocillos correspondientes. 3. Cubrir la placa con una lámina adhesiva e incubar durante 6 5 minutos a 37 C. 4. Desechar la lámina adhesiva. Aspirar el contenido de los pocillos y llenarlos completamente (aproximadamente 35 µl) con solución de lavado diluida. Repetir el proceso de aspiración lavado 3 veces más. Asegurarse de que cada columna de pocillos esté en remojo al menos 15 segundos antes del nuevo ciclo de aspiración. Después del último lavado golpear la placa invertida sobre un papel absorbente para eliminar cualquier exceso de líquido en los pocillos. 5. Transferir 1 µl de conjugado diluido a todos los pocillos de la placa, a excepción del pocillo para el blanco de sustrato. 6. Cubrir la placa con una lámina adhesiva e incubar 3 2 minutos a 37 C. 7. Durante los últimos 5-1 minutos de esta incubación, preparar la solución de sustrato-cromógeno. Para una placa entera añadir 28 µl de la solución de cromógeno (TMB) a un vial de tampón sustrato (14 ml) y mezclar bien. LA SOLUCIÓN SUSTRATO DE TRABAJO TIENE UN COLOR ROSA, descartar en caso de que se vuelva azul. Si no se utiliza toda la placa, preparar la cantidad necesaria según indica la tabla 2. TABLA 2 Tiras requeridas 1 2 4 6 8 1 12 Tampón sustrato ml 1, 2, 4, 6, 8, 1, 12, Cromógeno (TMB) µl 2 4 8 12 16 2 24 NOTA: El TMB está disuelto en DMSO. Dado que la temperatura de fusión del DMSO es de 18 C, el cromógeno debe alcanzar una temperatura de 2-25 C y agitarse bien antes de usarlo. 8. Desechar la lámina adhesiva. Aspirar y lavar la placa como en el punto 4. 9. Añadir 1 µl de sustrato-tmb a todos los pocillos, incluso el blanco. 1. Incubar durante 3 2 minutos a temperatura ambiente (2-25 C). 11. Añadir 1 µl de solución de parada a cada pocillo, guardando la misma secuencia y con los mismos intervalos observados en la adición del sustrato-tmb. 12. Ajustar el cero del lector con el pocillo del blanco a 45 nm y leer la absorbancia de cada uno de los pocillos en el plazo máximo de 3 minutos. Se recomienda hacer lectura bicromática utilizando filtro de referencia de 62-63 nm. Control de calidad Los resultados de un ensayo son válidos si se cumplen los siguientes criterios: 1. Blanco del sustrato. El valor de absorbancia debe ser inferior o igual a,1. 459 3-1158 R3 6.212 spa.doc

2. Valor medio del control negativo (CNx). Calcular el promedio de los valores de absorbancia obtenidos para el control negativo. Cada uno de los valores individuales obtenidos debe ser igual o mayor a,5 veces CNx e igual o inferior a 1,5 veces CNx. Si alguno de los valores no entra dentro de los límites debe descartarse y recalcularse la media. Si son dos los valores fuera de límites, la prueba deberá repetirse. Ejemplo:,144 CNx = =,48 3,5 x,48 =,24 1,5 x,48 =,72 Control negativo Absorbancia 1,45 2,5 3,49 Total,144 En este ejemplo no existe ningún valor a descartar. La media de los valores de absorbancia de los controles negativos debe estar por debajo de,12 después de restar el blanco. CNx,12 3. Control positivo (CP). El valor de absorbancia obtenido para el control positivo debe ser igual o mayor que,7 después de restar el blanco. CP,7 Si alguno de los criterios arriba no se cumple, el ensayo no es válido y se deberá repetir. Resultados La presencia o ausencia de HBsAg en las muestras a analizar se determina relacionando el valor de la absorbancia de cada muestra con el valor umbral. 1. Calcular el valor umbral añadiendo,4 a la media del control negativo. Valor umbral = CNx +,4 2. Dividir la absorbancia de la muestra por el valor umbral. Positivo: relación absorbancia/valor umbral 1, Negativo: relación absorbancia/valor umbral,9 Dudoso: relación absorbancia/valor umbral,9 1, Interpretación de los resultados Un resultado repetidamente positivo para HBsAg es indicativo de la existencia de infección por el virus de la hepatitis B. Para determinar si se trata de una infección aguda o crónica deben analizarse otros marcadores serológicos de la hepatitis B estudiando paralelamente el cuadro clínico del paciente. Limitaciones del procedimiento Toda muestra que haya dado un resultado positivo o dudoso debe analizarse de nuevo por duplicado. Si el resultado es repetidamente positivo o dudoso, debería analizarse con otra prueba de características similares. Aunque la presente prueba esté calificada como un método de tercera generación para la detección de HBsAg, está reconocido que los métodos actuales existentes para la detección de HBsAg no son lo suficientemente sensibles para detectar todos los casos posibles de hepatitis B. 459 3-1158 R3 6.212 spa.doc

Resultados esperados La prevalencia de portadores crónicos de HBsAg varía ampliamente en el mundo, de alta (> 8%, ej., África, Asia y Pacifico Oeste) a intermediaria (2-7%, ej., el sur y este Europeo) y baja (< 2%, ej., Europa occidental, América del Norte y partes de América del Sur). En Europa occidental el índice de portadores de HBsAg se sitúa entre el,1 y el,5% y en el sur de Europa la prevalencia de portadores varía entre el 1 y el 5%. 13 Características funcionales Sensibilidad analítica La sensibilidad es, como mínimo, de,1 unidades/ml de HBsAg para los subtipos ad y ay, utilizando patrones de HBsAg referenciados a los del Instituto Paul Ehrlich (PEI-Alemania, ref. 87). Utilizando el Segundo Estándar Internacional de la Organización Mundial de Salud para HBsAg, subtipo adw2, genotipo A (código NIBSC: /588) la sensibilidad obtenida es como mínimo de,125 UI/ml. Evaluaciones - En un estudio para evaluar el funcionamiento del kit, se probaron 416 muestras presuntamente positivas para HBsAg y se compararon con un método de referencia. En este estudio se obtuvo una sensibilidad del 1%. - 2 muestras de pacientes hospitalizados se probaron en comparación con un método de referencia. 196 muestras resultaron negativas con ambos métodos, 3 se confirmaron positivas y 1 fue un resultado falso positivo. La especificidad obtenida en este estudio fue del 99,5%. - Se probaron 44 muestras de suero de un banco de sangre con tres lotes de reactivo y se compararon los resultados con el método utilizado en rutina para el cribado de HBsAg. Se obtuvo una especificidad del 1% con dos lotes y del 99,5% con el tercer lote. - En un banco de sangre (EFS Centro Atlántico, Francia), 4871 muestras de donantes no seleccionados se analizaron en paralelo con el método utilizado en rutina para el cribado de HBsAg. De este total, 11 muestras fueron inicialmente reactivas (,23%), de las cuáles 3 fueron repetidamente reactivas (,6%). La especificidad obtenida fue del 99,94%. Precisión Reproducibilidad intra-ensayo: Los coeficientes de variación obtenidos para los valores de absorbancia de 72 replicados de una muestra positiva fueron del 2,2%, 2,5% y 2,6% en tres lotes estudiados. Reproducibilidad inter-ensayo: El control positivo se probó en 5 días diferentes con 3 lotes diferentes de bioelisa HBsAg 3.. Los coeficientes de variación obtenidos para os ratios absorbancia/valor umbral del control con los tres lotes fueron del 1,2%, 1,% y 2,4% respectivamente. Interferencias Interferencia por adición No se observó interferencia por hemoglobina (2 mg/ml), bilirrubina (,2 mg/ml) y triglicéridos (13 mg/ml). Reacciones cruzadas En un estudio de posibles interferencias, se probaron 144 muestras con un riesgo potencial de producir resultados falsos positivos. De dichas muestras, 2 eran provenientes de sueros positivos para RPR, 15 eran provenientes de sueros positivos para mononucleosis, 18 eran positivas para anticuerpos anti-nucleares (ANA), 9 eran positivas para factor reumatoide (RF), 32 eran de mujeres embarazadas, 2 eran positivas para anticuerpos frente a la hepatitis C, 2 eran positivas para anticuerpos frente al HIV y 15 eran positivas para anticuerpos frente a la hepatitis A. Se encontraron 2 muestras positivas que se confirmaron con un test de referencia. Todas las otras muestras fueron negativas con el bioelisa HBsAg 3.. 459 3-1158 R3 6.212 spa.doc

bioelisa: Guía de problemas Problema Posibles causas Solución 1. Controles fuera de validación. 2. Sin color o poco color al final del ensayo. 1a. Temperatura, incubación o pipeteo incorrecto. 1b. Preparación incorrecta de reactivos, error en las diluciones. Reactivos no mezclados correctamente. 1c. Contaminación cruzada entre controles. 1d. Filtro de lectura incorrecto. 1e. Interferencia en el camino óptico. 1f. Se han utilizado componentes de lotes diferentes. Comprobar el procedimiento. Comprobar el procedimiento. Pipetear cuidadosamente. No intercambiar los tapones de los viales. Comprobar que el filtro de lectura sea de 45 nm. Si no se usa filtro de referencia de 62-63 nm, las absorbancias aumentan aproximadamente 5 miliunidades. Comprobar el lector. Limpiar o secar el fondo de los pocillos. Comprobar que no haya burbujas de aire. Repetir la lectura. No utilizar componentes de lotes diferentes puesto que están ajustados para cada lote en particular. 1g. Reactivos caducados. Comprobar la caducidad del kit y de sus componentes. No utilizar un kit o reactivos caducados. 2a. Uno o más reactivos no añadidos o añadidos en secuencia equivocada. 2b. Conjugado inactivo: dilución incorrecta, conservación incorrecta. 2c. Microplaca inactiva: conservación incorrecta. 2d. Sustrato inactivo: conservación o dilución incorrecta, el contenedor utilizado afecta la estabilidad del sustrato, contaminación cruzada con la solución de parada. Comprobar el procedimiento. Comprobar si ha habido contaminación, comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo. Mantener siempre las tiras no utilizadas en la bolsa bien cerrada, con el desecante dentro. Utilizar siempre una dilución fresca de TMB en tampón sustrato. Usar contenedores desechables o lavados con ácido o etanol y enjuagados con agua desionizada. Comprobar el procedimiento. 459 3-1158 R3 6.212 spa.doc

bioelisa: Guía de problemas Problema Posibles causas Solución 3. Demasiado color en todos los pocillos de la microplaca. 4. Reproducibilidad pobre o elevado número de muestras reactivas que no se repiten. 3a. Sustrato contaminado, oxidado o preparado incorrectamente. 3b. Reactivos contaminados o preparados incorrectamente. 3c. Solución de lavado (1x) contaminada. 3d. Lavado insuficiente o no consistente: llenado o aspiración insuficiente o no uniforme, número de ciclos de lavado insuficiente. Lavador contaminado. 3e. Se ha utilizado solución de lavado de otro fabricante. Comprobar que el sustrato preparado sea de color rosa, descártelo si está azul. Asegúrese que el TMB está completamente líquido antes de utilizarlo. Asegurar la correcta mezcla del TMB en el tampón sustrato. Utilizar contenedores desechables o lavados con ácido o etanol. Comprobar contaminación (aspecto turbio). Comprobar diluciones. Comprobar la calidad del agua destilada/desionizada utilizada para preparar la dilución. Comprobar el lavador. Llenar los pocillos hasta el tope y aspirar completamente. Incrementar el número de ciclos de lavado y el tiempo de remojo. Golpear la placa invertida contra papel absorbente. Repetir el ensayo. Utilizar sólo la solución de lavado de biokit. 4a. Problemas de lavado. Ver apartados 3c, 3d, 3e. 4b. Pipetas mal calibradas o Utilizar pipetas calibradas con puntas mal encajadas. puntas bien ajustadas. Técnica de pipeteo Pipetear cuidadosamente sin incorrecta. burbujas ni salpicaduras. 4c. Reactivos y muestra no a temperatura ambiente o no correctamente mezclados antes de usar. 4d. Corrientes de aire sobre la microplaca durante las incubaciones. 4e. Demasiado tiempo en la adición de muestras y/o reactivos. Inconsistencia en los intervalos de tiempo. Burbujas de aire. 4f. Interferencia en el camino óptico. Atemperar muestras y reactivos y mezclarlos bien antes de utilizarlos. Mantener la microplaca protegida de las corrientes de aire. Desarrollar una técnica uniforme y consistente. Ver 1e. 459 3-1158 R3 6.212 spa.doc