Escherichia coli diarreagénico

Transcripción

1 Escherichia coli diarreagénico ETEC E. coli enterotoxigénico EPEC E. coli enteropatogénico EAEC E. coli enteroagregativo EIEC E. coli enteroinvasivo STEC E. coli productor de toxina Shiga DAEC E. coli de adherencia difusa

2 STEC E. coli productor de toxina Shiga Serotipos O : H E. coli E.coli O157:H7 no-o157 Enfermedad severa en humanos E. coli enterohemorrágico EHEC

3 SEROPATOTIPOS DE STEC: CLASIFICACION Karmali et al., 2003 Seropatotipos Incidencia Relativa Frecuencia de asociación con brotes Asociación con enfermedad severa Serotipos A Alta Común Si O157[H7; NM] B Moderada No común Si C Baja Rara Si O26[H11;NM],O45 [H2; NM], O103[H2; H11; H25; NM], O111[H8; NM], O121[H19; H7], O145:NM O8:H19, O91:H21, O113:H21, O174:H28, otros D Baja Rara No Múltiples E No humano No aplicable No aplicable Múltiples

4 Reservorio y vías de transmisión de STEC Reservorio animales rumiantes ganado Transmisión: carne otros alimentos agua contacto con el ganado persona a persona Dosis infectiva < 100 UFC/g

5 Genes involucrados en la patogénesis Bacteriófago Stx espp katp ori etpc-o po kb hlya-d LEE (35.5 kb) escrstu esccjz escvn sepq tir cest eae espadb escf espf Aparato de secreción Tipo III intimina Proteínas secretadas Locus of enterocyte effacement (LEE)

6 Toxina Shiga 1 (stx1): identidad con toxina Shiga de Shigella dysenteriae serotipo 1 a) stx1c: asociada a diarrea b) stx1d: asociada a reservorio bovino y acuático Toxina Shiga 2 (stx2): TIPOS DE TOXINA SHIGA grupo heterogéneo, serológicamente distinto de Stx1 a) stx2: asociada con SUH b) stx2b: asociada a diarrea c) stx2c: asociada con SUH d) stx2d: activable por mucus e) stx2e: asociada con la enfermedad del edema en cerdos f) stx2f: aislada de palomas, baja citotoxicidad en células Vero g) stx2g: aislada de reservorio bovino

7 Patogénesis Sangre DS Fallo renal SUH

8 Historia natural de la infección por STEC Ingestión de STEC 3-4 días Portador asintomático Diarrea sin sangre dolor abdominal 80% 1-2 días Diarrea con sangre 90% 6-8 días 10% Resolución SUH

9 Síndrome Urémico Hemolítico Anemia hemolítica microangiopática Insuficiencia renal aguda Trombocitopenia

10 FORMAS DE SUH Origen Etiopatogénesis Característica Infeccioso Genético (Atípico) Familiar Toxina Shiga (STEC/Shigella) Neuraminidasa (S. pneumoniae) Alteración vías C (factores H, I; MCP) multímeros vw (ADAMTS 13) Desconocido Típico (D+) Epidémico Cuadro VAS Recurrente Inmunológico Factor vw: Ac ADAMTS 13 y H TTP en adultos Tóxico Mitomicina, ciclosporina A, anticonceptivos orales Otros Repetto HA, Kidney Int 1997, 53: 1708 Cáncer, embarazo, TX, rechazo TX, hipertensión maligna

11 Factores de riesgo de evolución a SUH Edad: personas menores de 5 años y mayores de 60 años Pródromos con diarrea sanguinolenta Tipo de toxina Shiga producida Uso de terapia antimicrobiana para el tratamiento de la diarrea Uso de agentes que disminuyen la motilidad intestinal Recuento elevado de leucocitos

12 SUH post-entérico en Argentina Incidencia más alta a nivel mundial en pediatría 12 casos/ niños < 5 años En niños Primera causa de insuficiencia renal aguda Segunda causa de insuficiencia renal crónica Causa el 20% de transplantes renales Evidencias de infección por STEC en 40% de los casos O157:H7 serotipo predominante Shigella dysenteriae tipo 1 NO aislada

13 ARGENTINA ESTRATEGIAS DE VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA Notificación de los casos de SUH al Sistema Nacional de Vigilancia de la Salud (SNVS). Es obligatoria, inmediata e individualizada (Resolución Nº 346/00) Vigilancia Centinela: 25 UC-SUH en 16 provincias Vigilancia basada en Laboratorio (SIVILA): Red Nacional de Diarreas y Patógenos Bacterianos Transmitidos por Alimentos Vigilancia Molecular: PulseNet de América Latina y El Caribe

14 SUH : TENDENCIAS Nº de casos Letalidad (%) Año Incidencia 10,4 12,2 11,5 12,5 13,9 13,9 15,0 17,0 12,0 10,4

15 SUH - ARGENTINA ,8 5,8 2,3 2,9 1,2 0,9 1,95 6,7 7,2 21,4 5,3 11,2 26,4 14,7 25,8 10,4 25,7 Nº de casos DISTRIBUCION DE CASOS POR GRUPO ETAREO 0-12 meses meses meses meses DISTRIBUCION POR SEXO meses Varones Mujeres 61 o mayor 18,9 19,2 45,3 23,8 Incidencia 10,4/ niños <5 años 0-5,0 5-10, ,0 >20 No. de casos Enero DISTRIBUCION MENSUAL DE CASOS Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre

16 SUH Y DIARREAS POR STEC CRITERIOS DIAGNOSTICOS 1. Aislamiento y caracterización del microorganismo -Tipificación: factores de virulencia, biotipo, serotipo, antibiotipo -Subtipificación: PFGE, fagotipificación y genotipificación de variantes de Stx1 y Stx2 2. Detección de toxina Shiga libre en materia fecal -Citotoxicidad específica en células Vero 3. Detección de anticuerpos anti-stx -Ensayos de neutralización de la citotoxicidad en células Vero

17 Instrucciones para el envío de muestras de origen clínico para aislamiento de Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) en casos de diarrea o Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) COPROCULTIVO: Remitir el hisopo en medio de transporte (Stuart, Cary Blair o similar) MATERIA FECAL: Enviar aproximadamente 5 g en frasco estéril AISLAMIENTOS: Enviar repiques en agar blando o en tripticasa de soya SUERO: Enviar 500 µl de suero en tubo seco DATOS DEL PACIENTE: Enviar el Anexo I o II (notificación) según corresponda OBSERVACIONES: Las muestras deben ser enviadas según las Normas de Bioseguridad que corresponden al transporte de muestras clínicas.

18 Algoritmo de notificación y diagnóstico de las enfermedades asociadas a la infección por Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) Caso de SUH Centro de Salud Servicio Nefrología/ UTI UC-SUH Componente Clínico NOTIFICACIÓN OBLIGATORIA, INDIVIDUALIZADA, INMEDIATA AL SNVS-C2 & DE ALERTA NOTIFICACIÓN OBLIGATORIA, INDIVIDUALIZADA, INMEDIATA AL SNVS-C2 & DE ALERTA POR SNVS-UC-SUH Caso clínico de SUH por probable infección por STEC Derivación de muestras al laboratorio (materia fecal) Notificación al SIVILA Algoritmo para el aislamiento e identificación de STEC

19 Algoritmo de notificación y diagnóstico de las enfermedades asociadas a la infección por Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) Caso de diarrea con o sin sangre Centro de Salud Guardia, Consultorios externos, Atención médica Caso clínico de diarrea por probable infección por STEC Derivación de muestras al laboratorio (materia fecal) Algoritmo para el aislamiento, identificación y notificación de STEC al SIVILA

20 Si el caso ingresó al laboratorio como SUH, deberá notificarse de forma inmediata al SIVILA, aún antes de obtenerse resultados de laboratorio. Materia fecal Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de Escherichia coli O157 y no-o157 productor de toxina Shiga Laboratorio local (Nivel I /II) Agar MacConkey sorbitol (SMAC) 37ºC x 18 h Caldo tripticasa de soja (CTS) 37ºC x 6 h 37ºC x 6 h SMAC 37ºC x 18 h Seroagrupamiento presuntivo O157 CTS-CT (Cefixima Telurito de potasio) SMAC 37ºC x 18 h Aglutinación O157 (+) Notificar caso presuntivo E. coli O157 al médico y al SNVS-SIVILA PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para stx1/stx2/rfbo157 zona de confluencia, colonias sorbitol (-) y sorbitol (+) Medio de cultivo para tamizaje por método rápido resultado (+) Notificar caso presuntivo de STEC al médico y al SNVS- SIVILA Si el caso ingresó como Diarrea, deberá notificarse al SIVILA al evento DIARREAS por STEC de forma inmediata ante la detección del primer Presuntivo. Se disparará un mail de alerta a los referentes. Laboratorio local (Nivel II /III) o Laboratorio de Referencia Nacional PCR (-) Separación inmunomagnética E. coli O157 PCR stx1/stx2/rfbo157 PCR (-) Informar al médico caso STEC negativo PCR (+) Tamizaje Aislamiento PCR (+) Confirmación Caracterización fenotípica Identificación bioquímica, Detección de enterohemolisina, Fermentación de sorbitol actividad β-glucuronidasa, serotipificación, sensibilidad a los antimicrobianos. Caracterización genotípica de factores de virulencia eae, ehxa. Subtipificación variantes de stx, Fagotipificación STECO157, PFGE Notificar caso presuntivo por STEC O157 y/o no- O157 al médico y al SNVS- SIVILA Notificar caso probable por STEC O157 y/o no- O157 al médico y al SNVS- SIVILA Notificar caso confirmado por STEC al médico y al SNVS- SIVILA

21 Hisopado rectal Siembra directa Caldo Caldo CTS con CTS cefixima 0,05 mg/l y telurito de potasio 2,5mg/l Agar SMAC Incubación a 37º por 6 hs..... Agar SMAC...

22 Color Turquesa

23 CHROMAGAR Aislamiento y diferenciación directa de E.coli O157 por colonias coloreadas Interpretación E.coli O157 malva Otras bacterias Azul, transparentes o inhibidas

24 Si el caso ingresó al laboratorio como SUH, deberá notificarse de forma inmediata al SIVILA, aún antes de obtenerse resultados de laboratorio. Materia fecal Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de Escherichia coli O157 y no-o157 productor de toxina Shiga Laboratorio local (Nivel I /II) Agar MacConkey sorbitol (SMAC) 37ºC x 18 h Caldo tripticasa de soja (CTS) 37ºC x 6 h 37ºC x 6 h SMAC 37ºC x 18 h Seroagrupamiento presuntivo O157 CTS-CT (Cefixima Telurito de potasio) SMAC 37ºC x 18 h Aglutinación O157 (+) Notificar caso presuntivo E. coli O157 al médico y al SNVS-SIVILA PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para stx1/stx2/rfbo157 zona de confluencia, colonias sorbitol (-) y sorbitol (+) Medio de cultivo para tamizaje por método rápido resultado (+) Notificar caso presuntivo de STEC al médico y al SNVS- SIVILA Si el caso ingresó como Diarrea, deberá notificarse al SIVILA al evento DIARREAS por STEC de forma inmediata ante la detección del primer Presuntivo. Se disparará un mail de alerta a los referentes. Laboratorio local (Nivel II /III) o Laboratorio de Referencia Nacional PCR (-) Separación inmunomagnética E. coli O157 PCR stx1/stx2/rfbo157 PCR (-) Informar al médico caso STEC negativo PCR (+) Tamizaje Aislamiento PCR (+) Confirmación Caracterización fenotípica Identificación bioquímica, Detección de enterohemolisina, Fermentación de sorbitol actividad β-glucuronidasa, serotipificación, sensibilidad a los antimicrobianos. Caracterización genotípica de factores de virulencia eae, ehxa. Subtipificación variantes de stx, Fagotipificación STECO157, PFGE Notificar caso presuntivo por STEC O157 y/o no- O157 al médico y al SNVS- SIVILA Notificar caso probable por STEC O157 y/o no- O157 al médico y al SNVS- SIVILA Notificar caso confirmado por STEC al médico y al SNVS- SIVILA

25 DETECCIÓN LPSO157 Test de Inmunocromatografía Fundamento Test de inmunocromatografía que se basa en un inmunoensayo sandwich, que utiliza anticuerpos a-o157 marcados con partículas de oro. Zona de siembra Zona de reacción Zona de control Características Sencilla Rápida Sensible y específica Distintos tipos de muestra

26 Fundamento DETECCION DE Stx Test de inmunocromatografía Duopath Verotoxin (Merck) Test inmunocromatográfico con anticuerpos a-stx1 y a-stx2 marcados con oro. Zona de siembra Características Rápido Sencillo Sensible y específico Stx1 Stx2 Zona de reacción Zona de control

27 DETECCION DE Stx Test de inmunocromatografía RIDA QUICK Verotoxin O157/Stx Combi (Bioart)

28 Si el caso ingresó al laboratorio como SUH, deberá notificarse de forma inmediata al SIVILA, aún antes de obtenerse resultados de laboratorio. Materia fecal Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de Escherichia coli O157 y no-o157 productor de toxina Shiga Laboratorio local (Nivel I /II) Agar MacConkey sorbitol (SMAC) 37ºC x 18 h Caldo tripticasa de soja (CTS) 37ºC x 6 h 37ºC x 6 h SMAC 37ºC x 18 h Seroagrupamiento presuntivo O157 CTS-CT (Cefixima Telurito de potasio) SMAC 37ºC x 18 h Aglutinación O157 (+) Notificar caso presuntivo E. coli O157 al médico y al SNVS-SIVILA PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para stx1/stx2/rfbo157 zona de confluencia, colonias sorbitol (-) y sorbitol (+) Medio de cultivo para tamizaje por método rápido resultado (+) Notificar caso presuntivo de STEC al médico y al SNVS- SIVILA Si el caso ingresó como Diarrea, deberá notificarse al SIVILA al evento DIARREAS por STEC de forma inmediata ante la detección del primer Presuntivo. Se disparará un mail de alerta a los referentes. Laboratorio local (Nivel II /III) o Laboratorio de Referencia Nacional PCR (-) Separación inmunomagnética E. coli O157 PCR stx1/stx2/rfbo157 PCR (-) Informar al médico caso STEC negativo PCR (+) Tamizaje Aislamiento PCR (+) Confirmación Caracterización fenotípica Identificación bioquímica, Detección de enterohemolisina, Fermentación de sorbitol actividad β-glucuronidasa, serotipificación, sensibilidad a los antimicrobianos. Caracterización genotípica de factores de virulencia eae, ehxa. Subtipificación variantes de stx, Fagotipificación STECO157, PFGE Notificar caso presuntivo por STEC O157 y/o no- O157 al médico y al SNVS- SIVILA Notificar caso probable por STEC O157 y/o no- O157 al médico y al SNVS- SIVILA Notificar caso confirmado por STEC al médico y al SNVS- SIVILA

29 Seroagrupamiento O157 Fundamento: los anticuerpos anti-o157 aglutinan en presencia del antígeno O157 del LPS bacteriano. Realizar test de aglutinación en SF para descartar autoaglutinación Reacciones cruzadas con: Salmonella Urbana O:30; Yersinia enterocolitica O:9; Yersinia pseudotuberculosis O:IB; Citrobacter freundii; Escherichia hermanii; Haffnia spp. y Brucella abortus

30 Si el caso ingresó al laboratorio como SUH, deberá notificarse de forma inmediata al SIVILA, aún antes de obtenerse resultados de laboratorio. Materia fecal Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de Escherichia coli O157 y no-o157 productor de toxina Shiga Laboratorio local (Nivel I /II) Agar MacConkey sorbitol (SMAC) 37ºC x 18 h Caldo tripticasa de soja (CTS) 37ºC x 6 h 37ºC x 6 h SMAC 37ºC x 18 h Seroagrupamiento presuntivo O157 CTS-CT (Cefixima Telurito de potasio) SMAC 37ºC x 18 h Aglutinación O157 (+) Notificar caso presuntivo E. coli O157 al médico y al SNVS-SIVILA PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para stx1/stx2/rfbo157 zona de confluencia, colonias sorbitol (-) y sorbitol (+) Medio de cultivo para tamizaje por método rápido resultado (+) Notificar caso presuntivo de STEC al médico y al SNVS- SIVILA Si el caso ingresó como Diarrea, deberá notificarse al SIVILA al evento DIARREAS por STEC de forma inmediata ante la detección del primer Presuntivo. Se disparará un mail de alerta a los referentes. Laboratorio local (Nivel II /III) o Laboratorio de Referencia Nacional PCR (-) Separación inmunomagnética E. coli O157 PCR stx1/stx2/rfbo157 PCR (-) Informar al médico caso STEC negativo PCR (+) Tamizaje Aislamiento PCR (+) Confirmación Caracterización fenotípica Identificación bioquímica, Detección de enterohemolisina, Fermentación de sorbitol actividad β-glucuronidasa, serotipificación, sensibilidad a los antimicrobianos. Caracterización genotípica de factores de virulencia eae, ehxa. Subtipificación variantes de stx, Fagotipificación STECO157, PFGE Notificar caso presuntivo por STEC O157 y/o no- O157 al médico y al SNVS- SIVILA Notificar caso probable por STEC O157 y/o no- O157 al médico y al SNVS- SIVILA Notificar caso confirmado por STEC al médico y al SNVS- SIVILA

31 Toma de muestra para realizar PCR multiplex stx1 / stx2 / rfbo157 Muestra de zona de confluencia SMAC Grillado Placa de SMAC Pool de colonias no fermentadoras de sorbitol Pool de colonias fermentadoras de sorbitol Resultados Posibles: PCR Confluencia y pool de colonias positivas PCR de colonias individuales Confluencia positiva y pool de colonias negativas PCR seleccionando nuevas colonias Confluencia y pool de colonias negativas Muestra negativa

32 PCR Multiplex stx1 1 / stx2 2 / rfbo bp 259 bp 130 bp Leotta GA, Chinen I, Epszteyn S, Miliwebsky E, Melamed IC, Motter M, et al. Validación de una técnica de PCR multiple para la detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga. Rev Argent Microbiol 2005; 37: 1-10.

33 Si el caso ingresó al laboratorio como SUH, deberá notificarse de forma inmediata al SIVILA, aún antes de obtenerse resultados de laboratorio. Materia fecal Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de Escherichia coli O157 y no-o157 productor de toxina Shiga Laboratorio local (Nivel I /II) Agar MacConkey sorbitol (SMAC) 37ºC x 18 h Caldo tripticasa de soja (CTS) 37ºC x 6 h 37ºC x 6 h SMAC 37ºC x 18 h Seroagrupamiento presuntivo O157 CTS-CT (Cefixima Telurito de potasio) SMAC 37ºC x 18 h Aglutinación O157 (+) Notificar caso presuntivo E. coli O157 al médico y al SNVS-SIVILA PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para stx1/stx2/rfbo157 zona de confluencia, colonias sorbitol (-) y sorbitol (+) Medio de cultivo para tamizaje por método rápido resultado (+) Notificar caso presuntivo de STEC al médico y al SNVS- SIVILA Si el caso ingresó como Diarrea, deberá notificarse al SIVILA al evento DIARREAS por STEC de forma inmediata ante la detección del primer Presuntivo. Se disparará un mail de alerta a los referentes. Laboratorio local (Nivel II /III) o Laboratorio de Referencia Nacional PCR (-) Separación inmunomagnética E. coli O157 PCR stx1/stx2/rfbo157 PCR (-) Informar al médico caso STEC negativo PCR (+) Tamizaje Aislamiento PCR (+) Confirmación Caracterización fenotípica Identificación bioquímica, Detección de enterohemolisina, Fermentación de sorbitol actividad β-glucuronidasa, serotipificación, sensibilidad a los antimicrobianos. Caracterización genotípica de factores de virulencia eae, ehxa. Subtipificación variantes de stx, Fagotipificación STECO157, PFGE Notificar caso presuntivo por STEC O157 y/o no- O157 al médico y al SNVS- SIVILA Notificar caso probable por STEC O157 y/o no- O157 al médico y al SNVS- SIVILA Notificar caso confirmado por STEC al médico y al SNVS- SIVILA

34 Metodología para la detección y aislamiento de E. coli O157 Separación inmunomagnética

35 Metodología para la aislamiento de E. coli O157 Separación inmunomagnética

36 Si el caso ingresó al laboratorio como SUH, deberá notificarse de forma inmediata al SIVILA, aún antes de obtenerse resultados de laboratorio. Materia fecal Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de Escherichia coli O157 y no-o157 productor de toxina Shiga Laboratorio local (Nivel I /II) Agar MacConkey sorbitol (SMAC) 37ºC x 18 h Caldo tripticasa de soja (CTS) 37ºC x 6 h 37ºC x 6 h SMAC 37ºC x 18 h Seroagrupamiento presuntivo O157 CTS-CT (Cefixima Telurito de potasio) SMAC 37ºC x 18 h Aglutinación O157 (+) Notificar caso presuntivo E. coli O157 al médico y al SNVS-SIVILA PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para stx1/stx2/rfbo157 zona de confluencia, colonias sorbitol (-) y sorbitol (+) Medio de cultivo para tamizaje por método rápido resultado (+) Notificar caso presuntivo de STEC al médico y al SNVS- SIVILA Si el caso ingresó como Diarrea, deberá notificarse al SIVILA al evento DIARREAS por STEC de forma inmediata ante la detección del primer Presuntivo. Se disparará un mail de alerta a los referentes. Laboratorio local (Nivel II /III) o Laboratorio de Referencia Nacional PCR (-) Separación inmunomagnética E. coli O157 PCR stx1/stx2/rfbo157 PCR (-) Informar al médico caso STEC negativo PCR (+) Tamizaje Aislamiento PCR (+) Confirmación Caracterización fenotípica Identificación bioquímica, Detección de enterohemolisina, Fermentación de sorbitol actividad β-glucuronidasa, serotipificación, sensibilidad a los antimicrobianos. Caracterización genotípica de factores de virulencia eae, ehxa. Subtipificación variantes de stx, Fagotipificación STECO157, PFGE Notificar caso presuntivo por STEC O157 y/o no- O157 al médico y al SNVS- SIVILA Notificar caso probable por STEC O157 y/o no- O157 al médico y al SNVS- SIVILA Notificar caso confirmado por STEC al médico y al SNVS- SIVILA

37 Escherichia coli productor de toxina Shiga Pruebas Bioquímicas TSI: Pico ácido/fondo ácido con producción de gas, SH2 negativo 2.Utilización del Citrato: negativo 3.SIM: SH2 negativo, Indol: positivo, movilidad: positiva 4.LIA: decarboxilación de la lisina positiva, SH2: negativa 5.Fermentación de sorbitol: negativa

38 Esquema de diferenciación entre Escherichia coli y Escherichia hermanii Prueba Fermentación de celobiosa Crecimiento en KCN Pigmento amarillo Lisina decarboxilasa E. coli - (2%)* - (3%) - (0%) + (90%) E. hermanii + (97%) + (94%) + (98%) - (6%)

39 Detección del antígeno flagelar Fundamento: los anticuerpos del antisuero aglutinan con el antígeno flagelar. Procedimiento: Estimulación de la movilidad por 7 días en el medio de movilidad de Craigie. Siembra de agar tripticasa de soja a partir del medio de movilidad Craigie. Aglutinación en placa o en tubo.

40 Siembra del 1º pasaje Siembra del segundo pasaje Cepa Móvil Cepa no Móvil

41 Biotipificación de Escherichia coli O157:H7 Prueba Biotipo A B C D % (+) de otros Escherichia coli ß-glucuronidasa Sorbitol Rafinosa Dulcitol Ramnosa

42 Actividad de β-glucuronidasa y Biotipificación de E. coli O157 STEC O157:H7 Biotipo C Actividad β-glucuronidasa: negativa 2.Fermentación del sorbitol: negativa 3.Fermentación de rafinosa: positiva 4.Fermentación de dulcitol: positiva 5.Fermentación de ramnosa: positiva

43 LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA CLINICA RESULTADO POSITIVO NEGATIVO Informar al médico Realizar control de excreción y control de contactos familiares e Institucionales indicados por epidemiología Enviar muestras del aislamiento, materia fecal y suero al LNR Informar al médico Realizar control de contactos familiares indicados por epidemiología Enviar muestras de materia fecal y suero al LNR

44 LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA CARACTERIZACION DE STEC Tipificación: Factores de virulencia: toxinas Stx, proteína intimina y enterohemolisina Biotipo Serotipo Antibiotipo Subtipificación: PFGE Genotipificación de variantes de Stx Genotipificación de la proteína intimina Fagotipificación cepas O157

45 PCR Factor eae PRIMER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5-3 ) TAMAÑO FRAGMENTO pb SK1 CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC 864 SK2 CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG Referencia Karch H., Bohm H., Schmidt H, Gunzer F., Aleksic S., Heesemann J. Clonal structure and pathogenicity of Shiga-like toxin-producing, sorbitol-fermenting Escherichia coli O157:H-. J. Clin. Microbiol. 1993; 31:

46 PCR flic H7 PRIMER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5-3 ) TAMAÑO FRAGMENTO Pb FLICH7-F GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC FLICH7-R CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC 625 Referencia Gannon VP, D Souza S., Graham T., King RK., Rahn K., Read S. Use of the flagellar H7 gene as a target in multiplex PCR assays and improved specificity in identification of enterohemorrhagic Escherichia coli strains. J. Clin. Microbiol. 1997; 35:

47 PCR Enterohemolisina PRIMER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5-3 ) UBICACIÓN DENTRO DEL GEN hlya1 GGTGCAGCAGAAAAAGTTGTAG TAMAÑO hlya4 TCTCGCCTGATAGTGTTTGGTA Referencia Schmidt, H., L. Beutin, and H. Karch. Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of Escherichia coli O157:H7 stain EDL 933. Infect. Immun. 1995, 63:

48 Técnicas diagnósticas utilizando cultivo celular Detección de toxina Shiga libre en Materia Fecal (StxMF) Detección de Anticuerpos anti-toxina Shiga (Acs anti-stx) Estas técnicas son utilizadas en Laboratorios de Referencia

49 Genotipos de stx Pronóstico de evolución clínica Aislamientos de STEC Subtipificación de stx Diagnóstico de STEC - Hospitalización - Monitoreo de evolución a SUH - Terapia expansiva temprana stx 2, stx 2c, stx 2d-activable SUH stx 1, stx 1c, stx 2b, stx 2e, stx 2f Infección Diarrea - Observación (ambulatoria) - Hospitalización no necesaria Recuperación espontánea Una subtipificación de stx temprana de los aislamientos de STEC permite establecer el riesgo de evolución a SUH

50 LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA PARA SUH Y DIARREAS POR STEC Patógenos estudiados STEC O157 y no-o157 Tipificación y Subtipificación de cepas humanas, de animales y alimentos incorporada a la Vigilancia Epidemiológica Investigación de Brotes

51 Infecciones asociadas a STEC STEC O157 STEC No-O157

52 Cepas STEC O157 y no-o157 aisladas de infecciones cepas SUH 597 DS 335 D 167 O157 no-o157 PA 74 (n=929) (n=316) Otros 72 Pruebas bioquímicas Serotipificación Genotipificación PFGE (Protocolo estandarizado 24-h PulseNet)

53 Frecuencia de serotipos STEC/VTEC en enfermedad humana. Argentina Nº de cepas = 1245 O157[H7] 74,6% O145[H25, H-,NT] 13,6% O121[H19] 2,2% O26[H2,11,NT] 1,4% O174[H8,21,28, H-] 1,0% O111[H-,NT] 0,8% O103[H2,H-,NT] 0,6% O8[H16,19] 0,4% O91[H21,H-,NT] 0,4% O113[H4,19,21] 0,3% ONT[H6,7,11,12,19, 49,NT] 3,1% OR[H11,H-,NT] 0,6% Serotipos múltiples 0,8% (O22:H8; O130:H11; O178:H19)

54 PERFIL GENETICO DE CEPAS STEC O157 1,5% stx1/stx2/stx2c(vh-a) 1,5% stx2c(vh-a) 12,7% stx2 0,6% stx2nt 0,2% stx1 0,2% stx1/stx2c(vh-a) 0,1% stx1/stx2 83,1% stx2/stx2c(vh-a) Sensibilidad antimicrobiana: 97,8%

55 PERFIL GENETICO DE CEPAS STEC NO-O157O157 Others stx1 stx1/stx2/ehxa stx2c(vh-b)/ehxa stx2c(vh-b) Gen netic Profile stx2d/ehxa stx1/stx2/eae/ehxa stx1/ehxa stx2/eae stx2/ehxa stx2d2(vh-b) stx2 stx1/eae/ehxa stx2/eae/ehxa No. of Strains Sensibilidad antimicrobiana: 81,8%

56 VIGILANCIA MOLECULAR Diversidad Genética y relación clonal Protocolo de PulseNet 24-h CDC Enzymas : XbaI y AvrII/BlnI Cepa de Referencia: S. Braenderup CDC#H9812 Software: BioNumerics Ver (Applied Maths) STEC O157 Nº de cepas: 2114 Nº de patrones XbaI-PFGE: 915 Patrones XbaI-PFGE prevalentes (13%) AREXHX (8,1%) AREXHX ( 4,8%) Base de Datos Humanas: 1675, Alimentos: 208, Animales: 196, Medio Ambiente: 35 En tiempo real Estudio de brotes Detección de clusters Brotes difusos STEC no-o157 Nº de cepas: 1263 Nº de patrones XbaI-PFGE: 994 Patrones XbaI-PFGE prevalentes (2,3%) ARENMX (O145) AREXWX (O113)

57 Patrones XbaI-PFGE cepas STEC O157 humanas PFGE-XbaI AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX PFGE-XbaI AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AREXHX AR_XbaI Pattern

58 CLON PREVALENTE DE E. coli O157 XbaI-PFGE AREXHX stx2/stx2c(vh-a) / eae / ehxa / PT4 PFG E-X b ai AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) B D B uen os A ire s AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) B D B uen os A ire s AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) H U S B uen os A ire s AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) H U S B uen os A ire s C ity AR E XH X ea e / e hxa / st x2 B D R ío N e gro AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) B D B uen os A ire s C ity AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) B ovine B uen os A ire s AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) B ovine m ea t B uen os A ire s C ity AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) g rou nd b eef B uen os A ire s C ity AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) H U S B uen os A ire s C ity AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) H U S B uen os A ire s C ity AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) H U S B uen os A ire s C ity AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) H U S B uen os A ire s C ity AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) f re sh sa us ag e B uen os A ire s C ity AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) H U S C h ub ut AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) B D C ó rd ob a AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) H U S C ó rd ob a AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) B D L a P am p a AR E XH X ea e / e hxa / st x2 B D M en do za AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh-a) D N eu qu é n AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) H U S R io N e gro AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) D S an Lu is AR E XH X ea e / e hxa / st x2 / st x2c (vh -a ) B D S ant a F e

59 CIRCULACION DE CEPAS STEC O157:H7 HIPERVIRULENTAS DEL CLADO 8 > PORCENTAJE DE HOSPITALIZACIÓN > PORCENTAJE DE CASOS DE SUH > FRECUENCIA EN NIÑOS MAS PEQUEÑOS > FRECUENCIA EN SEXO FEMENINO

60 Escherichia coli O157:H7 hipervirulento Provincia de Neuquén: casos de SUH /10000 niños menores de 5 años. Estudio análisis clados por RT-PCR y estudios de 7 factores putativos de virulencia Cepas aisladas entre ,5% cepas humanas: clado 8 o 92,2% stx 2 /stx 2c o 100% ECSP 3620 aumenta la colonización intestinal y la expresión de Stx2. o 92,2% ECSP 2870/2872 estimula la adaptación de la bacteria a los vegetales o 81,4% Ecsp 2687 disminución de respuesta inflamatoria

61 35 Brotes asociados a STEC Sitio Kindergarten Family Community J. de Infantes Familiar Comunidad Brotes SUH 16 2 DS 35 D 5 PA 24 7 O157 5 no-o157 RUTAS DE TRANSMISIÓN Persona a persona 5 Aguas recreacionales 2 Alimentos 1 Desconocido 4

62 Brote Jardín Maternal. Ciudad de Córdoba Septiembre 2009 Septiembre /08/ M (21 m) D DS SUH F (33 m) D DS SUH CA (12 m) 5 niños D SUH, D (5), CA = E. coli O157:H7, stx2/stx2c(vh-a)/eae/ehxa XbaI-PFGE: AREX MLVA: ARMLVA.0010 Excreción prolongada: días

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64 COMPARACION DE LOS PERFILES GENETICOS DE LAS CEPAS STEC O157 AISLADAS DE INFECCIONES ESPORADICAS Y DE GANADO NOVIEMBRE ABRIL cepas humanas 54 cepas bovinas stx2/stx2(vh-a): 76,1 vs. 55,5% Relación clonal entre aislamientos humanos y bovinos por XbaI-PFGE. XbaI-PFGE: 148 patrones/75% similitud 136 cepas en 37 clusters 5 clusters con cepas de ambos orígenes # A: PT stx2/stx2(vh-a) (12 H / 1 B) # B: PT stx2/stx2(vh-a) (1 H / 4 B) # C: PT stx2/stx2(vh-a) (1 H / 4 B) # D: PT stx2/stx2(vh-a) (7 H / 1 B) # E: PT stx2/stx2(vh-a) (7 H / 1 B) D Astek et al. Foodborne Pathog. Dis., 9: , 2012

65 Brote por STEC O104:H4 Del 02/05/11 al 28/06/11: 881 casos de SUH, 32 defunciones, casos de diarrea Casos notificados por Alemania (95%), Austria, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Luxemburgo, Noruega, Países Bajos, Polonia, Suecia, Suiza, Reino Unido, República Checa, Canadá, EE.UU. Hechos relevantes: Alto Nº de casos de SUH Fundamentalmente adultos (88% > 20 años) Mayoría sexo femenino (70% ) Complicaciones neurológicas severas (50%) Probable vehículo: Semillas germinadas Fenogreco

66 Esquema propuesto de la emergencia del nuevo patotipo EAEC/STEC

67 PROPIEDADES DE LA CEPA STEC O104:H4 ASOCIADA AL BROTE EN ALEMANIA Gen Patotipo Presencia aggr EAggEC + stx2 STEC/EHEC + wzx Serotipo O104 + flich4 A. flagelar H4 + ehxa EHEC-Hly - eae Intimina - Características microbiológicas Agar sangre hemólisis - SMAC fermentación SOR + CT-SMAC [R] telurito + Flurocult β-glu + Chrom ID ESBL (β-lactamasa de espectro extendido) + Perfil de resistencia multiresistente

68 PERFIL DE RESISTENCIA AMPICILINA, AMOXICILINA/AC. CLAVULANICO, PIPERACILINA/TAZOBACTAM, CEFUROXINA, CEFOXITINA, CEFOTAXIMA, CEFTACIDINA, CEFPODOXIMA, ESTREPTOMICINA, AC. NALIDIXICO, TETRACICLINA, TRIMETOPRIMA/SULFAMETOXAZOL Presencia de una β-lactamasa de espectro extendido (BLEE) CTX-M15 y una β-lactamasa de amplio espectro (BLEA) TEM-1

69 Vigilancia de Escherichia coli O104:H4 Pruebas mínimas Tamizaje de Stx2 positivo Seroagrupamiento O104 positivo Resistencia a cefixima telurito Pruebas confirmatorias PCR múltiple rfbo104 / flich4 / TerD PCR factor eae PCR para identificar genes asociados a EAggEC

70 CONCLUSIONES El Rol fundamental del Laboratorio Bacteriológico, como componente del Sistema de Vigilancia, es el diagnóstico rápido del agente etiológico. La derivación de especímenes al LNR es importante para completar los criterios diagnósticos y para aplicar la vigilancia molecular a los estudios epidemiológicos. Para todo caso de SUH, es necesario el estudio de convivientes o contactos institucionales. La eliminación de STEC es prolongada e intermitente. Es importante determinar la finalización de la excreción para disminuir el riesgo de transmisión del patógeno.