IV Curso Avanzado WHO GSS 2006 Buenos Aires de mayo de 2006

Transcripción

1 IV Curso Avanzado WHO GSS 2006 Buenos Aires de mayo de 2006 Técnicas aplicadas a la detección n de STEC O157 en alimentos Lunes 15 de mayo Bioq. Isabel Chinen Servicio Fisiopatogenia, Departamento Bacteriología INEI ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán

2 Servicio Fisiopatogenia (LNR) INEI-ANLIS Dr. C.G. Malbrán

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5 STEC O157:H7

6 CARACTERISTICAS DE E. coli O157:H7 Posee la mayoría de las características bioquímicas de la especie, con las siguientes diferencias: No fermenta el Sorbitol o lo hace lentamente No posee actividad de b-glucuronidasa Temperatura óptima de crecimiento: 30-42ºC Desarrolla pobremente a 44-45ºC No desarrolla a temperaturas superiores a 45ºC No desarrolla a temperaturas de 10ºC pero sobrevive en productos congelados (-20ºC) sin cambio en el número total de microorganismos por períodos prolongados Es resistente a los cambios de ph (por Ej. Durante la fermentación de embutidos Servicio Fisiopatogenia (LNR) INEI-ANLIS Dr. C.G. Malbrán

7 CRITERIOS PARA LA DETECCIÓN DE STEC O157 MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS EN MEDIO SELECTIVO DETECCION DEL SEROGRUPO O157 CARACTERISTICAS BIOQUIMICAS DISTINTIVAS DETECCION DE LA ENTEROHEMOLISINA DETECCION DE GENES (stx( stx) PRODUCCION DE TOXINA SHIGA (Stx( Stx)

8 DETECCION DE STEC O157 EN ALIMENTOS CONSIDERACIONES GENERALES TEMPERATURAS DE CRECIMIENTO BAJO NUMERO DE UFC EN ALIMENTOS BAJA DOSIS INFECTIVA (< 100 UFC/G)

9 Detección n de STEC O157 en alimentos ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO TAMIZAJE AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION ( - ) ( + ) Positivo potencial -AISLAMIENTO MEDIOS SELECTIVOS SEPARACION INMUNOMAGNETICA - SEROAGRUPAMIENTO/SEROTIPIFICACION Positivo presuntivo CONFIRMACIÓN PRODUCCION DE Stx / DETECCIÓN DE GENES stx IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA Positivo confirmado

10 ETAPA DE ENRIQUECIMIENTO CONDICIONES DE INCUBACION - TEMPERATURA Y TIEMPO 37ºC / hs 42ºC / 6-8 hs - CON ó SIN AGITACION MEDIOS DE CULTIVO (suplemento antibiótico)

11 Medios de Enriquecimiento Caldo EC modificado Triptona Saler Biliares #3 Lactosa K2HPO4 (dibásico) KH2PO4 (monobásico) NaCl 20 g 1.12 g 5.1 g 4.0 g 1.5 g 5.0 g 1000 ml Caldo Tripticasa de Soja modificado Triptona 17 g Peptona de harina de soja 3.0 g D (+) glucosa 2.5 g NaCl 5.0 g K2HPO4 (dibásico) 4.0 g Sales biliares # g 1000 ml Agua Peptonada (Peptona de carne 1%) Servicio Fisiopatogenia (LNR) INEI-ANLIS Dr. C.G. Malbrán

12 Metodología para la detección y aislamiento de E. coli O157 Enriquecimiento Muestra de alimento en 585 ml de caldo EC modificado + novobiocina. Toma de alícuota del caldo de enriquecimiento luego del período de incubación. 1 ml de la muestra proveniente del caldo de enriquecimiento.

13 TECNICA DE TAMIZAJE O157 De acuerdo a USDA/FSIS deben cumplimentar: Sensibilidad: 98% Falsos negativos: 2% Especificidad: 90% Falsos positivos: 10% Eficiencia: 94% Servicio Fisiopatogenia (LNR) INEI-ANLIS Dr. C.G. Malbrán

14 Detección n de STEC O157 Tamizaje.. Métodos M RápidosR ELISA Test de inmunocromatografía Métodos automatizados Premier - Meridian TECRA Inmunostat Card - Meridian REVEAL - Neogen RapidCheck O157- ISD Singlepath GLISA - Merck VIP- Biocontrol Vidas ICE/ACE - Bio Mérieux PCR Real Time NucliSens - Bio Mérieux

15 Procedimiento Tamizaje. ELISA Anticuerpos de captura a-o157 específicos Muestra ( 30 minutos, ºC) Lavados (3 veces) Anticuerpo conjugado con una enzima (30 minutos, ºC) Lavados (4 veces) Sustrato (15 minutos, ºC) Características Sencilla Rápida Sensible y específica Distintos tipos de muestra

16 Tamizaje. Test de Inmunocromatografía Fundamento Test de inmunocromatografía que se basa en un inmunoensayo sandwich, que utiliza anticuerpos a-o157 marcados con partículas de oro. Zona de siembra Zona de reacción Zona de control Características Sencilla Rápida Sensible y específica Distintos tipos de muestra

17 izaje MK Primer MK 1 Secuencia del primer (5-3 ) TTTACGATAGACTTCTCGAC Nº de nucleót idos 20 Tamaño del fragmento de amplificació n (pb) 224 o 227 MK 2 CACATATAAATTATTTCGCTC 21 Reactivo Concentración de trabajo del reactivo Concentración del reactivo en la mezcla Volumen del reactivo en la mezcla para una determinación (µl) Buffer 10X 1X 5 Mezcla dntp 2,5 mm 0,1 mm 2 Cl 2 Mg 50 mm 1,5 mm 1.5 Primer MK 1 0,1 nmol/µl 2 pmol/µl 0,5 Primer MK 2 0,1 nmol/µl 2 pmol/µl 0,5 Taq polimerasa 5 U/µl 0,02 U/µl 0,2 Templado 2 IAC 0,2UFC/ µl 2 Agua Trid. estéril 38,3

18 AISLAMIENTO DE STEC Procedimiento de diagnóstico definitivo todos de cultivo Cultivo directo en medios selectivos Cultivo con enriquecimiento previo todos de inmunoconcentración Separación inmunomagnética (Dynal, Neogen) Inmunocaptura (TECRA)

19 Carnes (OKREND) Medio EC modificado + Novobiocina Leches (PADHYE-DOYLE) TSB + Acriflavina SMAC: Agar MacConkey sorbita BCIG: 5 bromo-4 cloro-3 indoxil β-d-glucurónido 225 ml medio de enriquecimiento (1)

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21 Metodología para la detección y aislamiento de E. coli O157 Separación inmunomagnética a) Partículas inmunomagnéticas b) Agregar 20 µl de partículas inmunomagnéticas a 1 ml de caldo de enriquecimiento. c) Colocar el tubo en el agitador rotatorio a 18 rpm durante 30 minutos. d). Colocar el tubo en la gradilla imantada y agitar suavemente por inversión 5 minutos.

22 Metodología para la aislamiento de E. coli O157 Separación inmunomagnética e) Extraer el sobrenadante con precaución de no f) Extraer el imán de la gradilla. desprender las partículas de g) Tres lavados con 1 ml de la pared. PBS-Tween Resuspender las partículas en 100 µl de PBS 1X. h) Dispensar 50 µl de partículas en una placa de CT-SMAC y 50 µl en una placa de medio cromogénico o fluorogénico. Sembrar en forma confluente y luego en forma aislada. Incubar las placas a 37 ºC durante 18 a 24 hs e interpretar los resultados.

23 METODOS DE INMUNOCONCENTRACION - Separación inmunomagnética (Dynal, Neogen) Partículas inmunomagnéticas sensibilizadas con anticuerpos anti-o157 - Inmunocaptura (TECRA) Anticuerpos anti-o157 adheridos a un hisopo plástico

24 AISLAMIENTO DE STEC Medios recomendados SMAC C-SMAC CT-SMAC CHROMagar IDmedium MUG BCIG Agar Sangre Triptosa

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26 Agar O157:H7 ID a) Control positivo, colonias color verde o verde azulado. b) Control negativo, colonias color violeta. c) Placa conteniendo colonias positivas (verde azuladas) y negativas (violáceas).

27 CHROMAGAR Aislamiento y diferenciación directa de E.coli O157 por colonias coloreadas Interpretación E.coli O157 malva otras bacterias Azul, transparenets o inhibidas

28 EHEC-Enterohemolisina Enterohemolisina Se visualiza la hemólisis de EHEC-Hly a las 18 hs de incubación a 37ºC Agar base triptosa con glóbulos rojos de cabra u oveja sin lavar Agar base triptosa con Cl 2 Ca y glóbulos rojos lavados de sangre desfibrinada de cabra u oveja

29 SEROAGRUPAMIENTO Aglutinación directa en lámina - Antisueros anti-o157 (Difco, INPB) - Reactivos de látex (OXOID)

30 CONFIRMACION DE STEC Detección de STX - Citotoxicidad en células Vero - Métodos inmunológicos (ELISA Meridian, Test de inmunocromatografía Merck, RPLA Denka Seiken) Detección de genes stx - Hibridación - PCR

31 DETECCION DE STX Citotoxicidad en cultivo celular Línea celular: Células Vero (Gb3 Gb4) Células HeLa (Gb3) Alta Sensibilidad Técnica Gold Standard Especificidad Neutralización con anticuerpos monoclonales Se puede partir de materia fecal o del aislamiento. Poco práctico y antieconómico para tamizaje. No accesible a todos los laboratorios

32 DETECCION DE STX ELISA Especificidad -Correlaciona con resultados del cultivo celular y el aislamiento del patógeno - Falsos positivos Sensibilidad - Menor que citotoxicidad en cultivo celular No se recomienda utilizar para detección de Stx en materia fecal Se utiliza para confirmar la producción de Stx del aislamiento cuando no se dispone de cultivo celular

33 DETECCION DE STX VTEC- RPLA Fundamento Técnica de aglutinación en microplaca empleando partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos altamente específicos para Stx1 y Stx2. Metodología Muestra: Tratamiento del cultivo con polymixina B Precipitación y centrifugación Ensayo de RPLA por diluciones sucesivas. Incluye control positivo, negativo y control de reactivo. Características Cultivo puro Simple Económico Sensible y específico (PCR y citotoxicidad en células Vero)

34 Fundamento DETECCION DE STX Test de inmunocromatografía Duopath Verotoxina Test inmunocromatográfico con anticuerpos a-stx1 y a-stx2 marcados con oro. Zona de siembra Características Rápido Sencillo Sensible y específico Stx1 Stx2 Zona de reacción Zona de control

35 DETECCION DE GENES stx PCR: Requiere procesamiento de todo tipo de muestra por la presencia de inhibidores Rapidez Alta Sensibilidad: Técnica de tamizaje Especificidad: Hibridación Selección de primers Longitud del fragmento TºC de annealing Sensibilidad y especificidad: Secuencia y longitud de la sonda Condiciones de hibridación Método de detección

36 PCR Múltiple PRIMER stx1a stx1b stx2a stx2b SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5-3 ) GAAGAGTCCGTGGGATTACG AGCGATGCAGCTATTAATAA TTAACCACACCCCACCGGGCAGT GCTCTGGATGCATCTCTGGT UBICACIÓN EN EL GEN TAMAÑO O157F CGGACATCCATGTGATATGG O157R TTGCCTATGTACAGCTAATCC Reactivo cc. Rvo. Original cc. Rvos en la mezcla Vol (ul) en la mezcla x 1 Buffer 10x 1x 5 dntp 2,5 mm 0,1 mm 2 Cl 2 Mg 25 Mm 1,5 mm 3 Primer Stx2 0,1 nmol/ul 0,4 pmol/ul 0,2 Primer Stx2c 0,1 nmol/ul 0,4 pmol/ul 0,2 Primer Stx1r 0,1 nmol/ul 2 pmol/ul 1 Primer Stx1f 0,1 nmol/ul 2 pmol/ul 1 Primer rfbo157r 0,1 nmol/ul 0,4 pmol/u 0,2 Primer rfbo 157f 0,1 nmol/ul 0,4 pmol/u 0,2 Taq 5 U/ul 0,02 U/ul 0,2 Templado 2 H 2 O 35 Vol. Final 50

37 STEC no-o157

38 CRITERIOS PARA LA DETECCION DE STEC no-o157 DETECCION DE GENES (stx( stx) PRODUCCION DE TOXINA SHIGA (Stx( Stx) DETECCION DE ENTEROHEMOLISINA

39 DETECCION DE STEC no-o157 EN ALIMENTOS CONSIDERACIONES GENERALES PREVALENCIA DE STEC no-o157 NO PRESENTA CARACTERÍSTICAS DISTINTIVAS EXISTEN > 200 SEROTIPOS DESCRIPTOS

40 iento e identificación de STEC no-o157 a partir de tras de alimento - (Método FP) Enriquecimiento de la muestra - 65g de alimento ml Caldo CTS Tratamiento en Stomacher durante 3 minutos Incubación a 37ºC - 18 hs zaje por PCR rar templado: l de caldo enriquecido ul de tritón/1% TE) Aislamiento - Siembra en placas MacConkey Incubación a 37ºC 18 hs. MK (+) ( -) Confirmación - Identificación de la colonia STEC+ por PCR multiplex - Identificación bioquímica y serológica

41 - PCR multiplex (-) (+) Identificación de la colonia STEC+ iento e identificación de STEC no-o157 a partir de tras de alimento - (Blanco et al.) quecimiento de la muestra - 65g de alimento ml Caldo CTS Tratamiento en Stomacher durante 3 minutos Incubación a 37ºC - 6 hs - 1 ml del cultivo enriquecido + 9 ml de caldo MacConkey Incubación a 37ºC - 18 hs. amiento - Siembra en placas EMB-Levine Incubación a 37ºC 18 hs. izaje por PCR - Se resuspenden en 50 ml de caldo de LB (3hs a 37ºC c/agitación): Cultivo de zona de confluencia Pool 20 colonias

42 Muchas gracias!!!!!!!