CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI

Transcripción

1 CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI Materia de Articulación CEBI_A4 Química Biológica Docente a cargo:marta Blanca Mazzetti CEBI_A4_3 : Enzimas

2 Enzimas

3 Un poco de historia 1700s Se reconocen catalizadores biológicos al estudiar la degradación de carnes por secreciones estomacales 1800s Se observa conversión de almidón a azúcar por saliva y extractos vegetales 1850s La fermentación de azúcar a alcohol por levaduras es catalizada por fermentos que son inseparables de las células vivas de levadura

4 Un poco de historia 1897 Kühne s 1930s Buchner: extractos de levaduras pueden fermentar azúcar a alcohol ENZIMAS (Gk enzymos = levado) Sumner: aísla y cristaliza ureasa todas las enzimas son proteínas Pepsina, tripsina y otras enzimas digestivas se aíslan y cristalizan y son proteínas Haldane: interacciones débiles entre enzima y sustrato podrían usarse para catalizar reacción

5 Los Protagonistas

6 Qué sabemos hoy de las enzimas? Exceptuando las ribozimas, son todas proteínas Actividad catalítica requiere proteína nativa Tamaño muy variable: PM entre Algunas requieren componente químico adicional para su actividad COFACTOR o COENZIMA

7 Algunos cofactores son iones metálicos

8 Otros son moléculas orgánicas complejas COENZIMAS Coenzimas que transfieren electrones Coenzimas que transfieren grupos de átomos

9 Coenzimas que transfieren electrones

10 Coenzimas que transfieren grupos de átomos

11 Muchas coenzimas son metabolitos de las vitaminas

12 Qué son las vitaminas? Compuestos que son esenciales para la salud y que no pueden ser sintetizados por el organismo Deben ser incorporados en la dieta Su deficiencia genera enfermedades por carencia Se dividen en dos grupos de acuerdo con su solubilidad

13 Vitaminas Liposolubles

14 Vitaminas Hidrosolubles

15 Vitaminas Hidrosolubles

16 Volvamos a nuestras enzimas

17 Clasificación de enzimas E.C.w.x.y.z.

18 Un ejemplo la hexoquinasa ATP + D-glucosa ADP + D-glucosa-6-fosfato E.C transferasa fosfotransferasa P-transferasa con HO como aceptor D-glucosa como aceptor del P

19 Las enzimas son catalizadores extraordinarios Condiciones de funcionamiento Especificidad Magnitud de la aceleración de la velocidad de reacción

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21 Cómo funcionan las enzimas?

22 Energía Libre (G) Energía requerid da S S T P T = Estado de transición Dirección de Reacción Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166

23 Qué pasa en presencia de una enzima? E E + E S S + P

24 La enzima estabiliza el Estado de Transición Cambio en Energía Energía requ uerida (no catálisis) S ES S T ES T EP P Energía di isminuye (catálisis) Dirección de Reacción Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166

25 Sitio activo Cómo lo logra?

26 El sitio activo Proporciona una superficie catalítica Estabiliza estado de transición Transforma el estado de transición en producto A B A B Superficie catalítica Juang RH (2004) BCbasics

27 Cómo estabiliza el sitio activo el estado de transición? + Posee grupos reactivos Evita influencia del agua - Optimiza interacción con S Juang RH (2004) BCbasics

28 La enzima no es perfectamente complementaria al sustrato sino al estado de transición (Linus Pauling, 1946) X Ajuste inducido (Koshland, 1958) Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252

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30 D-glucosa Hexoquinasa

31 El sitio activo Proporciona una superficie catalítica Estabiliza estado de transición Transforma el estado de transición en producto A B A B Superficie catalítica Juang RH (2004) BCbasics

32 Cinética Enzimática

33 Vo Orden 0 ES Orden 1 [S]

34 Otra vez un poco de historia Victor Henri: reacción E + S ES etapa necesaria en catálisis enzimática Michaelis y Menten: Teoría General de la Catálisis Enzimática

35 Las condiciones de M-M E + S k 1 ES k 3 E + P k 2 k 4 rápida lenta* ESTADO ESTACIONARIO: producción y consumo del complejo ES proceden a la misma velocidad se mantiene constante la concentración de ES

36 S P Concentr ración E T ES E Juang RH (2004) BCbasics EE Tiempo de reacción

37 Vo Vm Vo = Vm ½ Vm Vo = Vm [S] Km + [S] Vo = Vm [S] Km Km [S]

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39 Y siguiendo con la hexoquinasa Glucosa + ATP Glc-6-P + ADP Glucosa Alosa Manosa CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H 2 -C-OH CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H 2 -C-OH CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H 2 -C-OH K m = mm Juang RH (2004) BCbasics

40 Cinética Michaeliana

41 Vo Vm Vo = Vm ½ Vm Vo = Vm [S] Km + [S] Vo = Vm [S] Km Km [S]

42 Qué pasa con MM cuando la reacción catalizada tiene más de un sustrato? ATP + D-glucosa ADP + D-glucosa-6-fosfato

43 Distintos mecanismos posibles

44 Cómo hacemos en la práctica para obtener Vm y Km?

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49 Recopilando 1) Usar una cantidad definida de Enzima E 2) Agregar sustrato en varias concentraciones S 3) Determinar Producto a Tiempo Fijo (P/t) v o 4) Estimar V max y K m 1 v o V max v o 1/2-1 K 1 m V max Doble recíproca 1/S K m Gráfico Directo S Juang RH (2004) BCbasics

50 Cómo medimos la cantidad de enzima? UNIDAD ENZIMÁTICA

51 UNIDAD ENZIMÁTICA (UE) Cantidad de enzima que cataliza formación de determinada cantidad de producto en la unidad de tiempo, en condiciones de velocidad máxima UE Actividad Específica = Proteína (mg)

52 Cómo puedo comparar la eficiencia de distintas enzimas?

53 k 1 k 3 E + S ES k 2 E + P Vm = k 3 E T En condiciones saturantes 3 T k catalítica Número de recambio

54 Algunos ejemplos

55 Constante de especificidad k cat / k m

56 Inhibición de la actividad enzimática

57 Algunos inhibidores son irreversibles Se unen covalentemente (o no) o destruyen grupo funcional clave para catálisis Inhibidores suicidas Diseño racional de fármacos

58 Un ejemplo real la Enfermedad del Sueño Trypanosoma brucei Difluorometilornitina Inhibidor suicida de la Ornitín decarboxilasa primera enzima en biosíntesis poliaminas

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60 Y otros inhibidores son evidentemente reversibles!!!!!

61 Existen distintos tipos de inhibición reversible I Competitiva No-competitiva I I Incompetitiva Dib bujo Guía Sustrato S I Inhibidor E Compite por Sitio activo S E S I Sitio diferente I S E S I I Ecuación y Descripción E + S ES E + P + I EI [I] se une a [E] libre solo, y compite con [S]; aumento de [S] elimina la Inhibición por [I]. E + S ES E + P + + I I EI+S EIS [I] se une a [E] libre o [ES] complejo; aumento de [S] no elimina [I] inhibición. E + S ES E + P + I EIS [I] se une al [ES] complejo Solo; aumento [S] favorece la inhibición por [I].

62 Inhibición Reversible I Competitiva No-competitiva I I Incompetitiva Gr ráfico Directo v o I V max v o K m I V max V max I V max V max K m K m [S], mm = K m [S], mm K m K m [S], mm V max no cambia K m aumenta V max disminuye K m no cambia V max & K m disminuyen Doble Recíproca 1/K m 1/v o I 1/V max 1/[S] 1/v o I 1/V max 1/v o 1/K m 1/[S] 1/K m 1/[S] I 1/V max

63 Una aplicación clínica y curiosa de la inhibición competitiva Emborrachar a los individuos intoxicados con metanol! metanol Alcohol deshidrogenasa Formaldehído etanol es inhibidor competitivo Infusión lenta y continuada de etanol

64 Otra aplicación clínica importante de la inhibición competitva: las sulfamidas Acido p-aminobenzoico (PABA) H 2 N- -COOH Precursor Acido fólico Bacterias necesitan PABA para biosíntesis de ácido fólico H 2 N- -SONH 2 Sulfanilamida Estructura similar al PABA, inhibe el crecimiento bacteriano. Adapted from Bohinski (1987) Modern Concepts in Biochemistry (5e) p.197

65 Cinética Michaeliana: Resumen k cat /K m v o = V max [S] K m + [S] Directo Significa: Orden cero 1er orden k cat Número de recambio k 3 [E t ] V max & K m UE 1 µmol min Velocidad Máxima Afinidad con substrato Doble recíproca Inhibición Competitiva No-competitiva Incompetitiva Juang RH (2004) BCbasics

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67 Grupos específicos en el sitio activo contribuyen a la catálisis a través de distintos mecanismos Catálisis covalente Catálisis con ión metálico Catálisis ácido-base

68 Catálisis ácido-base

69 Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A1 Tríada Catalítica His57 Asp102 H H Ser195 O [HOOC] N C C N H C C C [NH 2 ] N C O Chequear especificidad de sustrato

70 Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A2 His57 Asp102 H H Ser195 O Primer Estado de Transición

71 Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A3 H H O Intermediario Acil-Enzima

72 Mecanismo Catalítico de Quimotripsina D1 H O Intermediario Acil-Enzima Agua

73 Mecanismo Catalítico de Quimotripsina D2 H O H O Segundo Estado de Transición

74 Mecanismo de Catálisis de Quimotripsina D3 H O H O Des-acilación

75 O C O - Asp 102 H H N C N C C H CH 2 His 57 H O CH 2 Ser 195 = Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158 O C O H Asp 102 H C N N H C C CH 2 H His 57 Ser Activa - O CH2 Ser 195 = Carga en el Sitio Activo

76 Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252 Catálisis Acido-Base Especificidad Catálisis Acido-base Catálisis O C Induce el estado de transición + N Acida H Ambas N CH C H H N CH O H O H H H H + N H Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.167 = H N +δ CH H H -δ O H H H = O C N H H CH C O H O O = - O C O = Catálisis Básica - O C Lenta Rápida Rápida Muy rápida O

77 Mecanismo Concertado de Catálisis Bolsillo del Sitio Activo N Cadena peptidica del Sustrato (270) Glu C COO - + H 2 1 Carboxipeptidasa A 3 4 C H O - O - 2+ His Zn Glu (196) (72) His (69) (248) Tyr N O - H C SITIO ACTIVO COO - C-terminal R Sitio para especificidad 5 + Arg (145) Chequear por C-terminal Juang RH (2004) BCbasics

78 Quimotripsina Tiene Un Sitio de Especificidad O O N C C N C C N C C N C C R H R O - C Ser Sitio de Especificidad Sitio Catalítico Sitio Activo Juang RH (2004) BCbasics

79 Especificidad de la Familia de Ser-Proteasas Tripsina Quimotripsina Elastasa corta en Lys, Arg corta en Trp, Phe, Tyr corta en Ala, Gly O O C N C C N C Bolsillo Profundo y Carga ado Negativamente C C C NH 3 + COO - C Asp O O C N C C N C Bolsillo No-polar Sitio Activo O O C N C C N CH 3 Bolsillo Poco Profundo y no-polar Juang RH (2004) BCbasics

80 Especificidad Espacial A B sp 3 Superficie Enzima C D La estructura tetrahédrica de los orbitales del carbono tiene una tensión estérica que conforma la unidad base de la conformación proteica B D C B Estos dos triángulos no son idénticos C D Juang RH (2004) BCbasics

81 Enzimas Regulatorias

82 Retroalimentación negativa

83 Enzimas Alostéricas Gk: allos = otros steros = forma

84 Enzimas Alostéricas Proteínas multiméricas y complejas Modulador y S se unen a distintas subunidades Unión modulador produce cambio conformacional que altera actividad enzimática Modulador puede ser positivo o negativo Un sitio específico para cada modulador Modulador puede ser el mismo S (homotrópico) o no (heterotrópico)

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86 Un ejemplo real: aspartato transcarbamilasa 12 cadenas polipeptídicas 2 clusters catalíticos con 3 cadenas 3 clusters regulatorios con 2 cadenas

87 Enzima Alostérica Aspártico transcarbamilasa Forma Activa relajada Carbamil fosfato O H 2 N-C-O-PO 3 2- = + Aspartato COO - CH 2 HN-C-COO - H H ATCasa Carbamil aspartato COO - O CH 2 H 2 N-C-N-C-COO - H H = ATP CTP CTP CTP CTP CTP CTP Feedback inhibición CTP Juang RH (2004) BCbasics Forma tensa Inactiva Metabolismo Nucleicos

88 Cinética alostérica Cooperatividad

89 Dos modelos para explicar este comportamiento Concertado (Monod) Ajuste inducido (Koshland) 2 formas R y T en equilibrio que se desplaza a un lado u otro según presencia modulador 1 forma única que va ajustando su actividad de acuerdo con entrada modulador S y modulador + sólo se unen a R Modulador sólo se une a T

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91 El modulador puede afectar K 0.5

92 El modulador puede afectar Vm

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95 Volvamos a la ATC

96 Efecto Curva Sigmoidea v o ATP CTP Efector positivo (ATP) lleva curva sigmoidea a hiperbólica Efector Negativo (CTP) mantiene v o Si exageramos la curva sigmoidea Vemos el punto On/Off claramente Una enzima alostérica puede detectar la concentración en el ambiente y ajustar su actividad Off [Sustrato] On Juang RH (2004) BCbasics

97 Enzimas reguladas por clivaje proteolítico Proteólisis expone sitio activo Regulación irreversible Se necesita otro mecanismo para inactivar Inhibidor que se une fuertemente a sitio activo

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99 Enzimas reguladas por modificación covalente Grupos de átomos unidos o removidos generalmente por otras enzimas

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102 Fosforilaciones catalizadas por proteín quinasas específicas

103 Fosforilación tiene que ser reversible Fosfo proteín fosfatasas

104 Un ejemplo: la glucógeno fosforilasa (glucosa) n + Pi (glucosa) n-1 + glucosa-1-p

105 A veces una misma enzima tiene varios sitios de fosforilación

106 GP (glucosa)n + Pi (glucosa)n-1 + glucosa-1-p GS

107 Rápida Respuesta a Concentración Azúcar en Sangre ad Enzimática Activida Glucógeno fosforilasa Glucosa Glucógeno sintasa Tiempo (min) Adapted from Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.597