BIOCATÁLISIS APLICADA

Transcripción

1 CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI Materia de Articulación CEBI-E5 BIOCATÁLISIS APLICADA Docente a cargo: Dra. Cristina dos Santos Ferreira crisf02@hotmail.com CEBI- E5-2 : Cinética de los biocatalizadores/estabilidad Enzimas/ Inactivación enzimas/métodos de estabilización

2 ENZIMAS macromoléculas multifuncionales. proteínas formadas por los 21 aa (raramente AA como la selenocisteína formada por reacción enzimática de deshidrogenasas o la glutation peroxidasa) forman cadenas lineales de AA unidas por puentes S-S de las cisteínas se estabilizan con los sustratos por interacciones no covalentes o covalentes transitorias que actuan sinérgicamente (solo se desestabiliza el complejo E-S por fuerzas coulómbicas de igual signo) Otras proteínas que no son enzimas pueden catalizar reacciones: anticuerpos catalíticos o las ribozimas Existen muchas proteínas sin funciones catalíticas: Ej.Transporte de oxígeno (hemoglobin y mioglobina) - La energía libre de Gibbs formación de los complejos es levemente negativa (ΔG).

3 CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES Clase 1.Estabilidad de enzimas Un biocatalizador puede ser caracterizado por: 1. Actividad: productividad 2. Estabilidad: condiciones de operación, vida útil 3. Selectividad: frente a reacciones no deseadas La estabilidad de la enzima afecta la velocidad de la reacción.

4 CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES Acompetitivos FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN COFACTORES TEMPERATURA ALMACENAMIENTO ph Velocidad dela reacción catalizada depende de SUSTRATO AGENTES DESNATURALIZANTES Competitivos INHIBIDORES No competitivos

5 ENZIMAS: ESTRUCTURA QUÍMICA TIPOS ENZIMAS PROTEÍNAS SIMPLES Solo aminoácidos PROTEÍNAS CONJUGADAS Heterogéneas INACTIVA SIN COFACTOR APOENZIMA` (parte proteíca) COFACTOR (COMPONENTE NO PROTEÍCO) ORGÁNICOS INORGÁNICOS Cationes Metálicos Zn 2+ Cu 2+ Ca 2+ Fe 2+ Mg 2+ COENZIMAS Unión no covalente GRUPO PROSTÉTICO Unión covalente

6 ENZIMAS: ESTRUCTURA QUÍMICA GRUPO PROSTÉTICO Es un grupo unido covalentemente unido a la proteína y coordinado a algún ión metálico. Metal-enzimas. carboxipeptidasa Nitratoreductasa

7 TIPOS DE ENZIMAS Ejemplos de enzimas que requieren Iones metálicos como cofactores Coenzimas Cofactor Enzima Coenzimas Enzima Fe(II) o Fe(III) Zn(II) Ni(II) Mn(II) Citocromo oxidasa Catalasa Peroxidasa Anhidrasa carbónica Carboxipeptidasas Ureasa Superoxidodismutasa Pirofosfato de tiamina Flavin adenin nucléotido Nicotiadenin nucleótido NAD Coenzima A Biotina Piruvato deshidrogenasa Monoaminooxidasa Lactato deshidrogenasa AcetilCodescarboxilasa Piruvatodescarboxilasa Mg(II) Hexoquinasas Glucosa-6-fosfatasa

8 CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: TEMPERATURA Estabilidad térmica caracterizada por T m Temperatura del equilibrio entre 50%proteína nativa y 50% desnaturalizada Depende de -AA de la proteína -puentes S-S -Solvente -presencia de sales (T m = T o +K.[S])

9 CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: TEMPERATURA

10 CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS : ph Grupos químicos ionizables presentes en las proteínas (-COOH;-NH2; -SH ) Estabilidad al ph depende de la composición de AA de la proteína. No polares Polares Ácidos Básicos

11 CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS : ph ph óptimo= ph en el cual la actividad catalítica es máxima depende depende de las interacciones entre sustrato y enzima necesarias para dar el producto. Depende de cada enzima y reacción catalizada

12 CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: Agentes desnaturalizantes AGENTES DESNATURALIZANTES Ácidos y bases fuertes (ΔpH) Solventes orgánicos Agente reductores urea y betamercaptoetanol. Sales Iones metálicos (Hg(II); Pb(II) Agresión mecánica

13 CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: Tiempo almacenamiento ph OP Temperatura T OP Concentración cofactores Estabilidad en el tiempo durante el almacenamiento puede expresarse como un decaimiento de 1ªorden K d determinada a partir de factores estadístico Boltzmann [E] t = [E] 0 exp( kd t) [E] t y [E] 0 son la concentración de enzima en el tiempo t e inicial y k d es la constante de velocidad de desactivación

14 FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: SUSTRATO CINÉTICA DE REACCIÓN MM supone que existen 3 pasos elementales 1ª formación del complejo E-S y esto se plantea como un equilibrio 2ª disociación del complejo 3ª formación irreversible del P (paso limitante)

15 FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: SUSTRATO CINÉTICA DE REACCIÓN MM supone que existen 3 pasos elementales 1ª formación del complejo E-S y esto se plantea como un equilibrio 2ª disociación del complejo 3ª formación irreversible del P (paso limitante)

16 Ejemplo cálculos Una solución contiene una solution contiene inicialmente una cantidad de enzima (K M = 1.5 mm). La concentración de sustrato incial es 0.25 M y no hay product. Después de 45 s, la solución tiene una concentración de product de 25 µm.hallar V max y la concentración de producto después de 2,0 minutos. Considerar condición de sustrato saturante. Cuál es el grado de conversión del sustrato después de 2 minutos?

17 Suponer que como S es mayor que Km sigue condición sustrato saturante

18 No cumplen MyM ENZIMAS ALOSTÉRICAS O COOPERATIVAS Tienen más de un sitio de unión para el substrato y la unión de una molécula facilita la de las posteriores. n: coeficiente de cooperación; n > 1 indica cooperación positiva

19 FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES REVERSIBLES: la enzima recupera su actividad al eliminarlos. IRREVERSIBLES: la enzima continúa inhibida REVERSIBLES Competitivos No-competitivos Acompetitivos

20 FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES COMPETITIVOS Interactúa con algún grupo esencial de la enzima, formando un complejo E-I. INHIBIDOR COMPETITIVO reacciona en el sitio activo del sustrato. Afecta Km no la Vmax

21 FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES COMPETITIVOS En este tipo de inhibidores, se incluyen sustancias estructuralmente muy parecidas al substrato

22 FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES NO COMPETITIVOS El inhibidor se une en otro sitio. El substrato aún puede unirse a la enzima y formarse un complejo E-S-I, catalíticamente inactivo y el complejo E-I. Se definen dos constantes: Si K I1 = K I2 inhibición nocompetitiva pura. Si K I1 K I2 inhibición parcialmente competitiva o mixta

23 FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES NO COMPETITIVOS PUROS INHIBIDOR NO COMPETITIVO reacciona en No el afecta sitio Km activo si afecta del sustrato. la Vmax Afecta Km no la Vmax

24 FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES ACOMPETITIVOS El inhibidor se une al complejo E-S para dar un complejo E-S-I incapaz de transformarse en productos.

25 FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES ACOMPETITIVOS Varía tanto V max ( ) como K m ( ) aumenta la afinidad por estabilización del complejo al formarse [E-S-I] según:

26 FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBICIÓN POR SUSTRATO Altas [S] pueden causar inhibición de algunas reacciones enzimáticas. Cte de inhibición que depende del sustrato. La [S] que hace máxima la velocidad de reacción se determina evaluando dr/d[s] = 0, con lo cual:

27 RESUMEN Las reacciones catalizadas por enzimas tienen una cinética de acuerdo al modelo de M-M. Algunas sustancias presentes en el medio de reacción, pueden tener un efecto inhibitorio del tipo: Competitivo No Competitivo Acompetitiva. A veces es el propio sustrato de la reacción el que inhibe. Algunas enzimas no siguen M-M y deben ajustarse a otros modelos empíricos. Uno de los más habituales es el comportamiento alostérico.

28 MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS El proceso de catálisis tiene lugar al exponerse residuos de aa específicos de la enzima al sustrato. La alta especificidad depende de la forma, tamaño de la región de la enzima llamada sitio activo y de las propiedades de los aa en la misma.

29 MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS -interacciones no covalentes -reacciones ácido base -uniones covalentes transitorias -reacciones nucleofílicas -reacciones electrofílicas -reacciones de oxidoreduccion de cofactores MECANISMOS DE CATÁLISIS 1. Catálisis ácido base 2. Catálisis covalente 3. Catálisis íón metálica 4. Catálisis por efectos de proximidad 5. Catálisis por efectos deorientación 6. Catálisis por unión preferencial en el estado de transición

30 MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS 1.CATÁLISIS ÁCIDO BASE Las enzimas trasfieren un protón desde o hacia el sustrato, provocando ruptura de un enlace covalente

31 COVALENTE MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS 2. CATÁLISIS COVALENTE Ataque Nucleofílico (dador de electrones) o electrofílico (aceptor electrones) del centro activo de la enzima sobre el sustrato Estado transitorio por enlace covalente inestable Ruptura enlace covalente liberación del producto

32 MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS Ejemplo: Hidrólisis de proteínas Quimotripsina (proteasa)

33 COVALENTE MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS 2. CATÁLISIS COVALENTE Enzimas denominadas SERINA proteasas Utilizan el grupo CH 2 OH de la serina como nucleófilo para hidrolizar enlaces peptídicotris. Ej. enzimas tripsina y quimiotripsina Grupo HO de la Serina Grupo imidazol de la Histidina Grupo SH de la Cisteína

34 MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS 2. CATÁLISIS COVALENTE Ejemplo Quimotripsina Paso 1: Sustrato (PP ) se introduce en sitio activo (SA) de la quimotripsina (QT). Se traslada H + de Ser-195 a His-57 y se forma C=O Paso 2: q+ de His-57 se neutraliza con la q- del áci aspártico (Asp-102). Cuando C=O se forma en el PP, se rompe la C-N. El grupo con N se estabiliza unido a H de His-57. Paso 3:la porción de PP con el N se mueve fuera del SA.

35 MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS 2. CATÁLISIS COVALENTE Ejemplo Quimotripsina Paso 4: H 2 O ingresa SA.O del agua cede H+ al N de His-57 y se une al C del PP. Se rompe. C=O Paso 5: se rompe C-O con Ser-195y se restablece el O-H de la serina. Ser-195 y His-57 vuelven a su conformación original. Paso 6: la porción de PP con El O-H sale del SA. La QT está lista para recibir otra molécula de sustrato

36 MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS 2. CATÁLISIS COVALENTE SERINA Tripsina- Quimiotripsina Elastana CISTEÍNA Papaína HISTIDINA Glucosa -6-fosfatasa

37 Evaluación del rendimiento en procesos BIO CONVERSIÓN DE REACTIVOS