HEMATOLOGIA CLASE TEORICO-PRACTICA Parte 1 PRUEBAS PARA EVALUAR EL MECANISMO HEMOSTÁTICO. Mariana Raviola

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1 HEMATOLOGIA 2015 CLASE TEORICO-PRACTICA Parte 1 PRUEBAS PARA EVALUAR EL MECANISMO HEMOSTÁTICO Mariana Raviola Universidad Nacional de Rosario Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas Departamento Hematología

2 HEMOSTASIA Comprende el proceso que previene el sangrado cuando un vaso sanguíneo es dañado y al mismo tiempo mantiene la sangre en estado fluido dentro del árbol vascular

3 FASES: HEMOSTASIA -Respuesta vascular: Vasoconstricción localizada a nivel del área afectada -Hemostasia Primaria: Formación de un agregado o trombo de plaquetas sobre la superficie de vascular lesionada. -Coagulación: Formación de fibrina que refuerza el trombo plaquetario. -Fibrinolisis: Eliminación de los depósitos de fibrina.

4 INDICACIONES PARA EL PACIENTE Concurrir al laboratorio con ayuno de 8 horas tratando de realizar el menor esfuerzo físico posible

5 FICHA DE ANTECEDENTES DEL - Motivo de consulta -Trombosis actual o anterior PACIENTE -Gingivorragia, epistaxis, melena, hematuria, hemartrosis -Sangrado post extraccion dentaria -Hemorragia post parto o post cirugia -Menstruacion abundante -Petequias -Antecedentes familiares de trombosis o sangrado. -Consumo de medicamentos: aspirinas, dicumarinicos, heparina, etc

6 HEMOSTASIA PRIMARIA RECUENTO DE PLAQUETAS -Anticoagulante: EDTA -Material adecuado: tubos de polipropileno, vidrio siliconado -Toma de muestra adecuada: evitar ruptura de tejido

7 HEMOSTASIA PRIMARIA RECUENTO DE PLAQUETAS Métodos manuales -sangre venosa anticoagulada con EDTA Dil. 1/20 con oxalato de amonio 1% (vn: x10 3 /mm 3 ) Contadores hematológicos.

8 HEMOSTASIA PRIMARIA RECUENTO DE PLAQUETAS Es conveniente observar un frotis de sangre periférica donde se controlará el número, forma y tamaño plaquetario.

9 HEMOSTASIA PRIMARIA Tiempo de sangría Prueba global de la hemostasia primaria. Evalúa interacción: Plaquetas-Pared vascular in vivo Depende de: cantidad y calidad funcional de las plaquetas cantidad y calidad funcional de vwf calidad del colágeno. Duke VN < 4 min Ivy VN < 5 min Simplate VN < 9 min Cohibir cuando tpo > 2 VN

10 Tiempo de sangría TS: sensibilidad - especificidad - reproducibilidad Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad, presión del corte, dirección de la incisión, barrido excesivo

11 HEMOSTASIA PRIMARIA Retracción del Coagulo Se produce a través de la interacción de la GPIIb- IIIa con la actina del citoesqueleto, requiere ATP como fuente de energía, depende de varios factores, calidad y cantidad de plaquetas, cc de fibrinógeno, hematocrito, es poco sensible, y muy influenciada por la limpieza del material

12 HEMOSTASIA PRIMARIA Retracción del Coagulo Se coloca 1 ml de sangre en tubo de hemolisis de vidrio bien limpio, se mantiene a 37C,a la hora se observa la magnitud de la retracción. El resultado se expresa en cruces. Cuando elcoagulo se ha despegado por completo de la pared del tubo se considera retracción total(+++), cuando no hay retracción es a retráctil, y cuando queda un sedimento de hematíes es fibrino-cruorico.

13 RETRACCION DEL COAGULO

14 HEMOSTASIA PRIMARIA Prueba del Lazo Evalúa fragilidad capilar aplicando una presión positiva que aumenta la presión sanguínea por obstrucción del recorrido venoso, depende de calidad y cantidad de plaquetas, calidad del vaso y los tejidos adyacentes, el gradiente de presión que tiende a generar la extravasación

15 HEMOSTASIA PRIMARIA Prueba del Lazo Se coloca el esfigmomanómetro en el antebrazo y se deja 5 min. a una presión media entre la máxima y la mínima, se quita la presión y se observa la aparición de petequias VN: Hasta 5 petequias en un circulo de 5 cm de diámetro. Se informa la positividad en cruces

16 ADHESIVIDAD HEMOSTASIA PRIMARIA PLAQUETA vw SUPERFICIE In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157) In Vitro : Hellem II (superficie de vidrio) Scand J Haemat 1970, 7: 37

17 HEMOSTASIA PRIMARIA ADHESIVIDAD In Vivo : Borchgrevink Adhesividad (%)= 100 *( RT 0 RT 2 / RT 0 ) RT 0 : recuento de pq. De muestra de sangre venosa extraída con EDTA RT 2 : recuento de pq. Luego de 2 min de TS. VN: 30-70%

18 ADHESIVIDAD: método de Hellen II Sangre entera Columna: tubuladura de PVP 3mm diámetro, rellena con perlas de vidrio de 0.5mm diámetro, 1.3 g por columna. Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg. columna cp bomba sp EDTA 2% EDTA 2% %Adh = 100 VN = 27-70% SP- CP SP

19 HEMOSTASIA PRIMARIA AGREGACIÓN La agregación plaquetaria es el resultado final de un complejo proceso metabólico. Cuando el endotelio se daña se exponen una serie de agonistas capaces de activar a las plaquetas, estos son el colágeno de la pared vascular, la trombina generada, la adrenalina y el ADP. La agregacion plaquetaria in vitro se define como la interaccion Pq-Pq medida sobre PRP.

20 Agregación plaquetaria in vitro Método óptico (Born, 1980) Método potenciométrico (Challen, 1982) IIHEMA - ANM

21

22 Condiciones del ensayo: -Sangre obtenida por punción sobre citrato de sodio 3.8% (1:9) -Tubos de polipropileno -Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP): 10 min a rpm -Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP): 15 min a altas rpm. -Ajustar concentración del PRP con PPP: / m 3 -Tapar tubos para evitar cambios de ph - Realizar el ensayo luego de 30 minutos y hasta 4 hs posteriores a la extracción.

23 AGREGACION Agonistas panel de rutina: ADR: 10 um ( adrenérgicos) Col: 1 ug /ml ó 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa) AA: 0.5 mm (receptor de Tx) ADP: 2.5 um, 5.0 um (P2Y 1, P2Y 12 ) Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vw tipo II) Agonistas especiales TRAP6 : PAR1, PAR4 U46619: análogo de TX Endoperóxidos cíclicos: actividad Tx sintaza Ionóforos (A23187): movilización de Calcio

24 AGREGACION

25 COAGULACIÓN MI HMWK XII PK XI IX VIII X V II I ME TC VII

26 TOMA DE MUESTRA Anticoagulante: Citrato trisodico 3.2 o 3.8 % No se aconseja utilizar sangre capilar. La sangre venosa debe ser obtenida por punción rápida y precisa, evitando la formación de espuma, el éxtasis venoso y la contaminación con tromboplastina tisular, ( torniquete menos de un minuto)

27 TOMA DE MUESTRA La sangre arterial debe ser obtenida por punción directa no traumática. Evitar la extracción por catéter, de ser indispensable, realizar la extracción con doble jeringa y descartar los primeros 5 a 10ml de sangre.

28 TOMA DE MUESTRA No se aconseja la extracción con tubos de vacío, aunque estos tubos pueden utilizarse para colocar la sangre una vez abiertos. Relación ac / sgre, 1+9

29 TOMA DE MUESTRA La relación Anticoagulante / Sangre varía cuando el Hto. se encuentra fuera del rango de 25 50%. Para calcular el citrato a utilizar se usa la siguiente fórmula: Sangre entera en ml = 9 x citrato de Na en ml x 0,55 1 Hto en (v/v)

30 TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS Cualquiera sea la distancia se remitirán las muestras congeladas, con hielo seco, y en un recipiente adecuado para su conservación, acompañadas de controles normales procesados de igual forma.

31 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Descartar los tubos que no mantengan adecuada relación ac/ sgre, y aquellos que muestren hemólisis visible. Centrifugar las muestras y separar los plasmas con pipetas de plástico lo mas rápido posible.

32 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS a-plasma citratado rico en plaquetas (prp) centrifugar 5-10 min. a bajas rpm, separar el plasma y mantener a temperatura ambiente hasta 2 hs b-plasma citratado pobre en plaquetas (ppp) centrifugar 10 min. a 3000 rpm, utilizar dentro de las 4 hs.

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