III. HEMOSTASIA PRIMARIA. Alteraciones plaquetarias Bioq. Esp. Claudia Patricia Serrano

Transcripción

1 III. HEMOSTASIA PRIMARIA Alteraciones plaquetarias Bioq. Esp. Claudia Patricia Serrano

2 Alteraciones plaquetarias Evaluación Recuento de plaquetas Recuento de plaquetas -anticoagulante: EDTA -material adecuado: tubos de polipropileno, vidrio siliconado -toma de muestra adecuada: evitar ruptura de tejido Métodos manuales -sangre entera: oxalato de amonio 1% (vn: x10 3 /mm 3 ) -plasma rico en plaquetas: EDTA 2% (vn: x10 3 /mm 3 ) Contadores hematológicos Es conveniente observar un frotis de sangre periférica donde se evaluará número, forma y tamaño plaquetario.

3 Recuento de plaquetas IMPEDANCIA Enfoque hidrodinámico

4 Recuento de plaquetas

5 Alteraciones plaquetarias Evaluación Recuento de plaquetas Trombocitopenia Recuento normal Trombocitosis Búsqueda de causas de trombocitopenia Búsqueda de causas de trombocitosis, y alteraciones cualitativas asociadas

6 METODOLOGIA DE ESTUDIO DE LA FUNCION PLAQUETARIA Tiempo de sangría Prueba global de la hemostasia primaria. Es la única prueba que evalúa las interacciones plaquetas pared-vascular in vivo Es función de la cantidad y calidad funcional de las plaquetas, de la cantidad y calidad funcional de vwf y de la calidad del colágeno. Duke Ivy vn < 2 min vn < 4.5 min Simplate vn < 9.5 min Cohibir cuando t > 2 vn

7 Tiempo de sangría TS: sensibilidad - especificidad - reproducibilidad Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad, presión del corte, dirección de la incisión, barrido excesivo

8 METODOLOGIA DE ESTUDIO DE LA FUNCION PLAQUETARIA ADHESIVIDAD PLAQUETA vw SUPERFICIE In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157) In Vitro : Mann (colágeno) Hellem II (superficie de vidrio) Scand J Haemat 1970, 7: 37

9 ADHESIVIDAD: método de Hellen II Sangre entera Columna: tubuladura de PVP 3mm diámetro, rellena con perlas de vidrio de 0.5mm diámetro, 1.3 g por columna. Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg. columna cp bomba EDTA 2% sp EDTA 2% %Adh = 100- SP- CP SP VN > 27%

10 Alteraciones plaquetarias Evaluación Adhesividad plaquetaria disminuida Enfermedad de von Willebrand Alteraciones de GP Ib-IX-V, IIb-IIIa Déficit de pool de depósito severo

11 Alteraciones plaquetarias Evaluación Recuento plaquetario normal Tiempo de sangría prolongado ó normal Adhesividad plaquetaria disminuida Estudio de trastornos plaquetarios cualitativos Congénitos ó adquiridos Enfermedad de von Willebrand

12 Métodos point of care PFA Sangre entera (800 µl) Insertar cassette Comenzar el test

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14 Agregación plaquetaria in vitro Método óptico (Born, 1980) Método potenciométrico (Challen, 1982) IIHEMA-ANM

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16 Condiciones del ensayo: -Sangre obtenida por punción con agujas G -Tubos de polipropileno -Anticoagulante: citrato de sodio 3.8% (1:9) sin azida sódica -Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP): min a g -Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP): 15 min 1500 g -Ajustar concentración del PRP con PPP: / mm 3 -Tapar tubos para evitar cambios de ph - Realizar el ensayo luego de 30 minutos y hasta 4 hs posteriores a la extracción.

17 AGREGACION Agonistas panel de rutina: ADR: 10 um ( adrenérgicos) Col: 1 ug /ml ó 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa) AA: 0.5 mm (receptor de Tx) ADP: 2.5 um, 5.0 um (P2Y 1, P2Y 12 ) Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vw tipo II) Agonistas especiales TRAP6 : PAR1, PAR4 U46619: análogo de TX Endoperóxidos cíclicos: actividad Tx sintaza Ionóforos (A23187): movilización de Calcio

18 AGREGACION

19 AGREGACION

20 Interpretación de la agregación - Cualitativa (semicuantitativa) - Cuantitativa

21 Reacción de liberación de ATP Permite cuantificar la liberación plaquetaria a través de la medición del ATP liberado por el PRP del paciente en presencia de los diferentes agonistas.

22 Recuento de plaquetas: /mm3 Morfología normal

23 Glanzmann

24 RETRACCION DEL COAGULO (TG)

25 Recuento de plaquetas: / mm3 (en cámara) Macroplaquetas (frotis)

26 Bernard-Soulier

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30 PGG 2 PGH2 TXasa? TROMBOXANO A2/B2 TP? PLC Alteración síntesis de tromboxanos IP3 Ca 2+ DAG PKC

31 RESPUESTA A TROMBOXANOS 100 l - + T : 0 seg T : 30 seg T : 1min PRPn + AA T : 4 min PRPp + ASA CO AA Agregación + Receptores de Tx presentes. Sin agregación Alteración en los receptores de Tx

32 GENERACION DE TROMBOXANOS 100 l - + PRPp + AA Agregación + Sin alteración en la formación de Tx T : 0 seg T : 30 seg T : 1min T : 4 min Agregación - Alteración en la formación de Tx. Ciclooxigenasa o Tx Sintetasa? PRPn + ASA CO AA

33 Estudio de la función plaquetaria Estudio de la vía de formación de Tromboxano A2 Evaluación funcional de Ciclooxigenasa y de Tromboxano A Sintasa Acido Araquidónico Agregación Alteración en la Tromboxano A Sintetasa PRP del paciente PRP de normal + Aspirina Sin agregación Alteración en la Ciclooxigenasa

34 Alteración en la Ciclooxigenasa

35 Estudio de la función plaquetaria Estudio de Agregación y Secreción plaquetaria Bernard-Soulier Glanzmann Citometría de Flujo Alteraciones de la activación/secreción Estudio de gránulos Gránulos densos: Marcación con Mepacrina por Citometría de flujo Gránulos : Fibrinógeno, FvW, Fn intraplaquetarios Tromboxanos Síntesis Receptores Disminuido Déficit de pool de depósito Disminuido Síndrome de las plaquetas grises

36 CITOMETRIA DE FLUJO FUNCIÓN PLAQUETARIA

37 CITOMETRIA DE FLUJO Plaquetas sin estimular Plaquetas estimuladas Gráfico de puntos de la dispersión frontal y lateral de una suspensión de plasma rico en plaquetas Histograma De fluorescencia

38 Citometría de flujo Ventajas Mínima manipulación. Detecta cambiossuperficiales. Estudio de trobocitopenias. Estudio de subpoblaciones. Estudio de proteínas intraplaq. Requiere 5 L de SE,PRP,PL. No usa material radioactivo. Rapidez Desventajas Costo del equipo. Costo de reactivos. Semicuantitativo. Análisis y expresión de resultados

39 MARCACION EN SUPERFICIE TOMA DE MUESTRA: 5 ml de sangre. ANTICOAGULANTE (1:10): citrato de sodio3.8%, EDTA 2%, PFA 1%? PANEL DE MONOCLONALES: ISOTIPO-FITC / PE CD42b ( Ib ), CD41 ( IIb ), CD61 ( IIIa ), CD29 ( Ia ), CD36 ( GPIV ) eventos CELL-QUEST IIHEMA-ANM

40 TROMBOASTENIA DE GLANZMANN GLICOPROTEINA IIb-IIIa Heterodimero calcio dependiente Integrina mas abundante en superficie Receptor de Fibrinogeno, vw, Fibronectina ALTERACIONES DE LA GP IIb-IIIa Ausencia del receptor en superficie Disminución del número de receptores Incapacidad de fijar Fibrinógeno Retracción del Coagulo anómala IIHEMA-ANM

41 Agregación ADP 5 μm (TG)

42 Agregación y liberación con colágeno 8 ug/ml (TG)

43 TROMBOASTENIA DE GLAZMMAN MARCACION EN SUPERFICIE KG KG MM MM

44 BERNARD SOULIER Ausencia del complejo GP Ib-IX-V Autosómico recesivo, infrecuente Con-sanguinidad, Cromosoma 17, 23 y 3 Sangrado moderado a importante Trombocitopenia Plaquetas de mayor tamaño y deformables Sobrevida plaquetaria acortada

45 Sindrome de BERNARD SOULLIER Paciente P Dispersión frontal- Tamaño (FSH) P: 202 Madre: 65 Control: 47 Madre P CD 42-b (GP Ib) (IMF) P:25 Madre: 171 Control: 257 P CD61 (GP IIIa) (IMF) P: 389 Madre: 176 Control: 167 IIHEMA-ANM

46 YH9? P Dispersión frontal- Tamaño (FSH) P: 152 Control: 66 P CD 42-b (GP Ib) (IMF) P: 145 Control: 63 P CD61 (GP IIIa) (IMF) P: 463 Control: 168 IIHEMA-ANM

47 MYH9: cuerpos de Döhle AGREGACION CON COLAGENO 1 g/ml Normal Paciente IIHEMA-ANM

48 CUANTIFICACION DE GP DE MEMBRANA PLAQUETARIA. CytoQuant TM Gp ( Stago) Microesferas: gráfico de puntos FSCH vs SSCH Histogramas de fluorescencia B D A C Marker Media Nº GP/ esferas M1 (D) M2 (C) M3 (B) M4 (A) Moléculas de Gp/plaq. IMF

49 MARCACION INTRAPLAQUETARIA GRANULOS DENSOS CON MEPACRINA TOMA DE MUESTRA - PRP, SE (EXTRACCION CON EDTA 2% o CITRATO) - MEPACRINA, (QUINACRINA MUSTARD, 0.2 mm CF) PREPARACION DE LA MUESTRA 40 L BUFFER, 5 L MEPA, 5 L PlQ. 40 L BUFFER, 5 L BUFFER, 5 L PlQ. INCUBACION-40min LAVADO CITOMETRO IIHEMA-ANM

50 MARCACION INTRAPLAQUETARIA GRANULOS DENSOS CON MEPACRINA NEGATIVO ( 3 IFM ) NORMAL ( 85 IFM ) PACIENTE ( 8 IFM) Rango normal 37 IFM IIHEMA-ANM

51 MARCACION DE PROTEÍNAS INTRAPLAQUETARIAS FIJACION PFA 1%10 min PERMEABILIZACION SAPONINA 1% Fg Vw ADP ATP GP ADP ATP GP Fg Vw Marcación: - Controles negativos adecuados - Controles de permeabilización Total IIb Superficie IIb Total IIIa Superficie IIIa Control de permeabilización CD63 IIHEMA-ANM

52 MOVILIZACION DE CALCIO METODOLOGÍA PL en Buffer con Ca 2+ ( 1mM) Incubación con FURA-2 Lavado, Resuspensión Sin Estimulo Col 8 g / ml Col 1 g/ml

53 Marcadores de activación plaquetaria (hiperreactividad) Interacción con matriz sub-endotelial fisiológico Interacción con endotelio activado patológico

54 MARCADORES DE ACTIVACION estado de reposo GP IIbIIIa inactiva L ADP/ATP Ca 2+ / Ser vwf / Fg/ Fn estado activado L GP IIbIIIa activa fibrinógeno PAC-1 unión de fg P-SELECTINA /CD62p GP 53 / CD63 IIHEMA-ANM

55 Marcadores de activación plaquetaria: - expresión de marcadores de activación en la superficie de la plaqueta (ex vivo) CD62P P-selectina golll % positivos Condiciones analíticas de difícil estandarización: - anticoagulantes - tiempo de ensayo - controles negativos adecuados - expresión de resultados (% de eventos positivos, intensidad media de fluorescencia) - escasas referencias de CV intra e Inter ensayo IMF

56 RIBS 9F9,F2 a-fg ACTIVO REPOSO LIBS PAC-1 AP6 GP IIb-III a IIHEMA-ANM

57 CINETICA DE UNION A RECEPTORES TOMA DE MUESTRA PRP, SE (EXTRACCION CON CITRATO) MARCADO DE PLAQUETAS 40 L buffer + 5 L Isotipo + estímulo 40 L buffer + 5 L Monoclonal + estímulo INCUBACION Tiempos: 1min, 5min.20min a 37ºC Cortar con PFA 1% (CF) a cada tiempo Completar la incubación hasta 40min CITOMETRO IIHEMA-ANM

58 CINETICA DE UNION AGONISTAS: ADP 20 M, Thr 1 a 5 U/ml, TRAP MARCADORES: DE RECEPTORES: PAC-1, a-fg, a-vwf, GPs DE ACTIVACION: CD62P, CD63 IIHEMA-ANM

59 CINETICA DE UNION A RECEPTORES IMF ó % IMF Bf 11 %Bf 11 IMFPAC-1 11 %PAC TIEMPO (min) IIHEMA-ANM

60 Aplicaciónes de la citometría de flujo Activación plaquetaria mediada por anticuerpos: Trombocitopenia inducida por heparina, anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 Heparina - Factor plaquetario 4 - Anexina V Tomer A, 1999

61 Tomer A, 1999

62 Activación plaquetaria mediada por anticuerpos: Trombocitopenia inducida por heparina, anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 Heparina Tomer A, 1999

63 TROMBOCITOPENIA INMUNE CAUSA: Destrucción plaquetaria por anticuerpos que reconocen glicoproteínas específicas de la menbrana plaquetaria:iib-iiia, Ib-IX, Ia-IIa

64 IgG PLAQUETAS NORMALES 1 Pool intraplaquetario (IgG totales plaq.) moléculas gránulos plaquetarios, adquiridas por pinocitosis 2 Pool de superficie (IgG asociada a sup. Plaq.), 100 moléculas, unión de anticuerpos naturales que reconocen estructuras modificadas sobre plaquetas viejas.

65 INMUNOGLOBULINAS METODOLOGIAS EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS TOTALES EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS ASOCIADOS A SUPERFICIE :inmuno-radiometría inmuno-fluorescencia directa MAIPA y PAICA (especifidad del anticuerpo)

66 IGG ASOCIADA A SUPERFICIE PLAQUETARIA Expresión de resultados 1-IFM 2-INDICE: IFM / FSCH

67 Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria: detección por citometría de flujo Media: 36 Control normal M1 Paciente CD41+ Media: 92 M1

68 Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria: detección por citometría de flujo Negativo 3 IFM IgG 10 IFM IgM 3 IFM Control normal M1 Negativo 3 IFM M1 IgG 34 IFM IgM 31 IFM Paciente