MICROSTICK SALMONELLA

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2 ER 0632/1999 ISO 9001 Apartado de Correos / P.O. Box Valdemorillo (Madrid, Spain) (34) Fax: (34) E mail: microkit@microkit.es Web: MICROSTICK SALMONELLA Test rápido de Immunocromatografía para la detección Uso exclusivo en laboratorio Ref. KMTC85 cualitativa de Salmonella spp. en muestras de alimentos. LAS 10 VENTAJAS DE UN KIT SOBRESALIENTE: 1 Rapidez de resultados: 5 10 minutos tras el enriquecimiento ISO 6578! (no horas como los kits ELISA, ni 4 6 días como en el método tradicional de cultivo en placa). Ahorro en la obtención de resultados, conseguidos en sólo 36 horas (incluidos los enriquecimientos). Ahorro mínimo de 2 días de trabajo. No hace falta ir a leer resultados en días festivos. COLICULT-MCC CRIOTECA PLAQUIS M-IDENT COSMETIKIT CHROMOSALM KITPRO-5S SEILAGUA COMPACT-DRY-PLATES DESINFECTEST NUTRILINIA MUGPLUS CROMOKIT 2 Robustez: se ahorran los puntos críticos de otros métodos como los látex o los ELISAs; el inmunocromatograma es el método inmunológico más duro en toda circunstancia, que puede incluso almacenarse fuera del refrigerador y transportarse a temperatura ambiente sin verse alterado. 3 Sensibilidad extraordinaria: 99,9%, lo que limita la proporción de resultados falsamente negativos a algo testimonial, convirtiendo el método en un correcto screening de barrido de muestras negativas 4 Especificidad excelente: >90%, lo que limita adecuadamente la proporción de resultados falsamente positivos y permite ahorrar las posteriores confirmaciones de los presuntos positivos a menos del 10% de casos en los que no había Salmonella y el test dió presunto positivo 5 Seguridad para el operario: las muestras pueden hervirse una vez concentradas y justo antes de realizar el test, ya que éste detecta los antígenos de Salmonella, no las células, por lo que no es necesario que éstas sigan vivas tras el enriquecimiento selectivo 6 Comodidad de uso: es como un test de embarazo, no necesita aparato alguno para su interpretación, que es simplemente visual. Reducir manipulaciones es reducir puntos críticos. El kit es compacto, al incluir los dos caldos de enriquecimiento ISO 6579 optimizados y los Sticks confirmativos. 7 Flexibilidad: test unitarios, no hay necesidad de agrupar muestras, se pueden analizar de 1 a 20 ó más 8 Estabilidad: se mantiene, incluso sin necesidad de refrigeración (4 30ºC), durante muchos meses 9 Ahorro económico: Dada la rapidez de resultados, el alimento puede ser liberado al mercado varios días antes que como lo haría con el método clásico, lo que supone inmensos ahorros económicos para la empresa, que deben redundar en un aumento del presupuesto para el laboratorio artífice de esta heroicidad. Por ello, aunque el kit parece más costoso que el método clásico, NO LO ES en absoluto. 10 Validado: estudio realizado en todo tipo de muestras alimentarias por los mayores especialistas en España en validación de métodos microbiológicos: carne de ternera, leche pasteurizada, pescado, vegetales, ovoproductos, especias y aperitivos, harina de cereales, pollo, alimentos infantiles, alimentos dietéticos, salsas, paella, postres, pastelería, helados, embutidos loncheados, queso, mariscos, comida animal, espaguettis. Límite de detección demostrado desde ufc Salmonella /25 g de alimento con un nivel de acompañantes e interferentes muy diversos veces superior que las dianas! 1

3 I. INTRODUCION Y USO Los síntomas clínicos causados por infección de Salmonella typhimurium, en seres humanos, se dividen en la fiebre tifoidea, causada por S. typhimurium serotipos typhi y paratyphi y una variedad de síntomas clínicos, incluyendo las enfermedades diarreicas, causadas por las Salmonellas no tifoideas (NTS), de las cuales hay unos serotipos, como la S. enteritidis. La fiebre tifoidea es restringida a humanos y está altamente adaptada como enfermedad invasiva sistémica de adultos y niños, mostrando una leve asociación con la inmunosupresión. En contraste, las cepas NTS tienen una amplia gama de huéspedes vertebrados y una epidemiología que a menudo incluye alimentos animales, al menos en los países industrializados donde normalmente se manifiesta en forma de gastroenteritis. Las cepas NTS pueden producir una grave enfermedad invasiva si va asociada a estados inmunodeprimidos. También es común en niños africanos que presentan afecciones, desnutrición y anemia. MICROSTICK SALMONELLA es un kit de tres componentes diseñado para proporcionar una rápida detección de Salmonella spp. en muestras de alimentos. MICROSTICK SALMONELLA combina un doble enriquecimiento optimizado de la muestra, con un inmunoensayo cromatográfico para la detección cualitativa de Salmonella spp. en muestras de alimentos contaminados, para así evitar el consumo y por tanto, la salmonelosis. II. FUNDAMENTO DEL TEST Los caldos de pre enriquecimiento revitalizador y post enriquecimiento selectivo, basados en los de la Norma ISO 6579 pero optimizados para el Stick, mejoran extraordinariamente el rendimiento de dicha norma. El MICROSTICK Salmonella es un inmunoensayo cualitativo para la detección de Salmonella en muestras de alimentos. La membrana está pre revestida con anticuerpos, en la región de banda del test, para reconocer el antígeno de Salmonella spp. Durante la prueba, la muestra puede reaccionar con las partículas rojas de látex que están recubiertas con anticuerpos anti salmonella pre desecados. La mezcla resultante, empuja hacia arriba la membrana por acción capilar. Como la muestra fluye a través de la membrana, el aglutinado de partículas rojas migra. En el caso de un resultado positivo, los anticuerpos específicos presentes en la membrana capturarán el aglutinado de partículas rojas, formando una banda roja. La mezcla sigue avanzando a través de la membrana con el anticuerpo inmovilizado que está en la región de banda de control. En la línea de control siempre aparece una banda de color verde, lo cual verifica que se ha añadido el volumen suficiente y que se obtuvo un flujo adecuado del caldo de postenriquecimiento inoculado, además de servir como control interno de los reactivos. III. REACTIVOS Y MATERIALES Cada kit contiene: tubotes (ref: DPA001) con polvo estéril del caldo de revitalización APT MICROKIT para 25 g de alimento (pre enriquecimiento) tubos (ref: TPL401) con 10 ml del caldo de enriquecimiento selectivo SS MICROKIT, de color rojo (post enriquecimiento) tarjetas inmunocromatográficas para Salmonella Ag (Sticks) 4. Instrucciones de uso Materiales necesarios (no suministrados): Contenedor de recogida de muestras, guantes desechables, contenedor de desechos, pipetas de plástico, temporizador, Stomacher y bolsas Stomacher, incubadoras + 37 º y ºC (se puede mantener con sólo la estufa de C y agua purificada estéril. IV. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Los tubotes de polvo deben mantenerse lejos de la humedad atmosférica, entre 15 y 25ºC, y emplear antes de la fecha de caducidad impresa en sus etiquetas. Los tubos de líquido deben mantenerse entre 8 y 25 C al abrigo de la luz y se deben usar antes de la fecha de caducidad impresa en sus etiquetas. Las tarjetas inmunocromatográficas se deben almacenar tal y como están empaquetados en sus bolsas selladas, a una temperatura comprendida entre 4 y 30 ºC (36 86ºF), al abrigo de la luz y de la humedad. No congelar! Las tarjetas inmunocromatográficas son estables hasta la fecha de caducidad impresa en su bolsa sellada y deben permanecer en ésta hasta su uso. 2

4 V. TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS Las muestras de alimentos deben ser recogidas en recipientes limpios y el ensayo debe realizarse inmediatamente después de la recogida, aunque las muestras pueden almacenarse en el frigorífico (2 4 º C) durante 1 2 días previos a la prueba. Para un almacenamiento mas prolongado, la muestra debe mantenerse en el congelador a 20ºC. En ese caso, la muestra será totalmente descongelada y puesta a temperatura ambiente antes del ensayo. Descongelar sólo la cantidad necesaria ya que los ciclos de congelación descongelación no son recomendables. Homogeneizar la muestra lo mejor posible antes de la preparación. Para conseguir el nivel necesario de 1 célula de Salmonella en 25g de alimento, es fundamental realizar un enriquecimiento adecuado en dos fases: a) Pre enriquecimiento, enriquecimiento primario o fase revitalizante de las células de Salmonella dañadas sub letalmente durante la fabricación el alimento y neutralización de los conservantes del alimento, sean naturales, sean añadidos b) Post enriquecimiento, enriquecimiento secundario o fase de enriquecimiento selectivo que multiplicará más que las acompañantes, las células de Salmonella hasta , un nivel más que adecuado para ser detectadas por las tarjetas inmunocromatográficas del MICROSTICK SALMONELLA, que detectan desde 10 4 uf/ml Aún así, diversos kits en el mercado aseguran que la fase de post enriquecimiento no es necesaria, sobre todo si el nivel de flora interferente (aerobios totales) es baja, menor a 10 4 ufc/ml final; esa es una afirmación muy aventurada, ya que si se comete el frecuente error de validar el kit con una muestra que tenga ya de entrada células viables de Salmonella/25 g y escasa flora interferente, lógicamente la fase de enriquecimiento multiplicador es redundante; pero nadie puede asegurar la detección de Salmonella por debajo del límite de detección de la técnica, que en inmunocromatografía ronda las 10 6 células de Salmonella por test (y las 10 4 células de Salmonella por test en el mejor de los casos, como es el MICROSTICK Salmonella para S.enteritidis y S.typhimurium). Por ello el laboratorio debe elegir un kit de su total confianza, validado por entidades que muestren claramente todos los datos de la validación y no un simple certificado por mucho renombre internacional que tenga la entidad certificadora. VI. ENRIQUECIMIENTO DEL ALIMENTO ANTE LA POSIBLE PRESENCIA DE SALMONELLA 1 Mezclar 25 g de muestra sólida o 25 ml de muestra líquida con 225 ml de agua estéril a la que añadiremos el polvo contenido en un tubote de caldo de revitalización APT MICROKIT (una mejora del agua de peptona tamponada BPW, especialmente obligada para este kit). Si es preciso, golpear el tubote con polvo de preenriquecimiento, en posición horizontal, antes de abrirlo, para descompactar el polvo del fondo; después cerciórese de que se ha vaciado completamente sobre el agua y la muestra. Homogeneizar durante aproximadamente 2 minutos, a ser posible en el Stomacher. Incubar durante h a C. 2 Añadir 1 ml de cultivo de pre enriquecimiento a un tubo de 10 ml de caldo de enriquecimiento selectivo SS MICROKIT, e incubar este tubo durante otras h a C (no resulta necesario hacerlo a 41,5 C). Si el tubo ha virado a negro es altamente presuntivo de presencia de Salmonella, pero no hay que descartar los tubos que hayan quedado rosas rojos y a ellos también hay que hacerles el Stick. Ya en el segundo día se obtendrán los resultados de Salmonella, ya que de aquí el paso siguiente y definitivo se tardan escasamente 5 15 minutos. VII. PROCEDIMIENTO PARA EL TEST INMUNOCROMATOGRÁFICO EN MUESTRAS DE ALIMENTOS Mantener previo al ensayo, todo el material: test, muestras y envases, a temperatura ambiente (15 30ºC/59 86ºF ). No abrir las bolsas hasta el momento de realizar el ensayo. 0. Si se desea por cuestiones de seguridad para el analista, colocar el tubo en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Retirar y dejar atemperar. 1. Abra la bolsa del Stick por la muesca, retire la tarjeta, descarte la bolsita desecante y use la tarjeta lo antes posible. 2. Con una pipeta diferente para cada muestra, dispensar 3 5 gotas ó 100 µl de la muestra de postenriquecimiento en el pocillo (S), hasta que éste se llene completamente, evitando añadir partículas sólidas de la muestra (no pipetear del fondo del tubo). Llenar el pocillo generosamente de caldo de post enriquecimiento, con un volumen suficiente como para crear un menisco que casi desborde el pocillo. Iniciar el temporizador. 3. Leer el resultado en 5 15 minutos (aparecen las bandas de colores, normalmente la de control mucho antes que la del test). Generalmente no hace falta esperar 15 minutos a la lectura del Stick y en los primeros 2 5 minutos ya se ven los positivos, pero en caso negativo hay que esperar 15 minutos por si acaso se trata de un positivo lento. 3

5 VIII. INTERPRETACION DE RESULTADOS NEGATIVO: Sólo aparece una banda verde en la ventana central del punto marcado con la letra C (línea de control). POSITIVO: Además de la banda verde de control a través de la ventana central del sitio marcado con la letra C (línea de control), aparece una banda roja (línea de test) en el sitio marcado con la letra T (zona de resultados). Toda banda roja, por tenue que sea o truncada que esté, debe considerarse muestra positiva. POSITIVO: BANDA ROJA DEL TEST Y VERDE DEL CONTROL NEGATIVO: SÓLO BANDA VERDE DEL CONTROL NO VALIDO: Una ausencia total de bandas coloreadas. Insuficiente volumen de muestras, procedimientos incorrectos de utilización o reactivos deteriorados son probablemente las razones del fracaso del test. Revisar el procedimiento y repetir el test usando un nuevo Stick con otra muestra similar del caldo SS, sin partículas de alimento. IX. CONTROL DE CALIDAD INTERNO Los controles internos están incluidos en el test. La línea de color verde que aparece en la región de control (C) es un control interno. Confirma suficiente volumen de muestra y correcta técnica de uso del test. Si desea un control positivo de Salmonella emplee preferentemente cepas de referencia como S. enteritidis (por ejemplo NCTC 6676) o S. typhimurium (por ejemplo NCTC 74). X. PRECAUCIONES ESPECIALES Y LIMITACIONES DEL KIT Solo para profesionales de laboratorio. No utilizar ningún reactivo después de su fecha de caducidad. Seguir las buenas prácticas de laboratorio: ropa protectora, guantes desechables y no comer, beber o fumar en la zona... Todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas y ser manejadas igual que un agente infeccioso. Los tubotes y tubos de caldos deben permanecer cerrados hasta el momento de su uso, guardados en lugar fresco, seco y oscuro. Siga al pie de la letra las instrucciones de enriquecimiento, ya que otras combinaciones y otros medios han demostrado no ser válidos, al disminuir drásticamente la efectividad del kit. Por ejemplo el caldo Rappaport no es bien absorbido por la membrana del kit, mientras el SS sí lo es y a pesar de estar algunos de sus tubos negros, no suelen dejar residuo suficiente como para ocultar el resultado. De modo que el SS detecta un 80% más que el Rappaport con este kit. La turbidez o el viraje de color en los tubos no es indicadora de presunta presencia de Salmonella y debe realizarse el Stick. El medio de post enriquecimiento contiene Sales biliares, por lo que debe trabajarse con precaución (guantes, máscaras) y evitar tocar el líquido. No se puede prescindir del post enriquecimiento; aunque en algunas muestras una incubación del preenriquecimiento prolongada otras 18 h permite obtener positivos reales con el Stick, la mayoría de muestras tomadas directamente de la solución madre son demasiado espesas o grasas y no migran adecuadamente en la membrana del inmunocromatograma. La adición de 0,1 ml de pre enriquecimiento (en lugar de 1 ml) a 10 ml del tubo de post enriquecimiento que defienden algunos autores, no da tan buenos resultados cuando hay presentes pocas ufc de Salmonella y muchas ufc de interferentes y acompañantes, por lo que resulta mejor añadir 1 ml; sin embargo, se pueden añadir 0,1 ml si la muestra enriquecida es demasiado espesa o coloreada y esto impide su correcta difusión en el stick, ya que el límite de detección sigue siendo el adecuado. No es necesario hervir la muestra enriquecida inmediatamente antes de realizar el test, sólo si los protocolos internos de seguridad del laboratorio así se lo exigen; ya que la banda test se ve mejor sin hervir. El test debe realizarse dentro de las 2 horas siguientes a la apertura de la bolsa de la tarjeta inmunocromatográfica. Las tarjetas inmunocromatográficas deben permanecer en sus bolsas selladas hasta el momento de su uso. No utilizar las tarjetas inmunocromatográficas cuyas bolsas estén dañadas. Una vez utilizado el kit, aunque se deje secar, no funcionará correctamente con una segunda muestra aunque incluyamos altas concentraciones de Salmonella: Los Sticks NO son reutilizables en ningún caso. 4

6 Un exceso de muestra de alimento en el pocillo del Stick podría provocar resultados erróneos (aparecen bandas marrones). Las bandas negras que se dan circunstancialmente (menos del 2% de tubos SS negros) en el test no se consideran positivas, pero tampoco negativas, ya que son acúmulo del precipitado negro del medio SS que no deja ver si hay o no banda roja. En tal caso, dejar reposar el tubo y extraer muestra limpia de la zona superior y media del tubo, para repetir el test en otro Stick. Algunas muestras de ciertos alimentos pueden disminuir la intensidad de la línea de control verde. Otras muestras (alimentos muy grasos ) pueden migrar con más dificultad por la membrana e incluso no llegar a formar la línea verde (test invalidado). Puede solicitar para estos ultimos casos, una caja de 5 sticks sin tubotes ni tubos, pida la ref: KMTC85 TT Ciclos de congelación y descongelación en la muestra no son recomendables ya que pueden causar resultados erróneos. Las tarjetas inmunocromatográficas y los tubos empleados deben eliminarse en un recipiente adecuado biohazard después de los ensayos. Esta prueba proporciona un diagnóstico presuntivo de ausencia/presencia de Salmonella spp. en muestras de alimentos, pero un resultado negativo podría eventualmente indicar que la concentración de Salmonella spp. en la muestra es demasiado pequeña o que las células están demasiado sub letales y no han conseguido replicarse lo suficiente como para ser detectadas. La determinación de Salmonella spp. debe llevarse a cabo sobre la muestra adecuadamente enriquecida con el protocolo que se explica en este folleto. Todo positivo debe confirmarse con Agar Cromosalm (Ref: DMT500) y si en él crecen colonias verdes, identificarlas bioquímica (ref: KBH260), inmunológica (refs: AC01, ZC02, PL6100) y/o molecularmente (ref: SFI004+), a fin de evitar reportar falsos positivos. XI. RENDIMIENTO A. Límite de detección El límite de detección del Stick inmunocromatograma para los diferentes serotipos es: S. enteritidis 1x10 4 bacteria/ml, S. typhimurium 1x10 4 bacteria/ml y S. typhi: 1x10 7 bacteria/ml. de caldo post enriquecido, que equivale, según la validación con el protocolo aquí explicado, a menos de 10 ufc de Salmonella/25 g de alimento (por cuestiones de incertidumbre microbiológica, nadie puede apostar en un método que el límite de detección sea 1 ufc). B. Sensibilidad y Especificidad Se realizó una evaluación con diversas cepas mediante MICROSTICK SALMONELLA aplicando el método de referencia ISO 6578:2002 de Salmonella. MICROSTICK SALMONELLA mostró > 99% de sensibilidad y > 97% de especificidad. Los anticuerpos utilizados para elaborar este test reconocen epitopos de Salmonella encontrados en cultivos de bacterias in vitro. Estos valores preliminares deben tomarse con precaución hasta que más datos de evaluación estén disponibles en matrices alimentarias (ver más abajo) y con cepas salvajes. C. Reactividad cruzada e Interferencias Se realizó una evaluación para determinar la reactividad cruzada de MICROSTICK SALMONELLA. No hay reactividad cruzada con patógenos intestinales comunes, otros organismos ni otras sustancias presentes ocasionalmente en los alimentos como Listeria monocytogenes, Campylobacter, H. pylori, Escherichia coli O157: H7. D.Validación con muestras naturales de alimentos Se analizaron 20 muestras positivas y 20 muestras negativas para Salmonella spp. de diferentes alimentos, con toda clase de microorganismos acompañantes Gram + (Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes, Listeria grayii, Listeria ivanovii, Listeria welshimeri, Listeria inocua) e interferentes Gram (Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, E.coli) en mezclas muy diversas y a muy superior concentración (> ufc/25 g) que los microorganismos diana (Salmonella nottingham), que estaban a un nivel ínfimo de presencia (10 16 ufc/25 g). Los alimentos implicados en la validación fueron hamburguesa cruda de ternera, leche pasteurizada, pescado crudo, ensaladas vegetales, huevo crudo, patatas con ajo, cebolla y pimienta, harina de trigo, pollo crudo, papilla infantil de frutas, barritas dietéticas con chocolate, salsa rosa, paella arroz a banda, pasteles variados, crema catalana, helado de vainilla, chorizo loncheado, queso curado, mariscos, galletas de perro, espaguettis. Los resultados fueron, para 5

7 tan ajustado inóculo de Salmonella y tan elevada carga interferente, de una sensibilidad del 100% (ningún falso negativo) y de una especificidad del 90% (los únicos falsos positivos detectados fueron en pollo crudo y en pescado crudo). De este modo queda validado MICROSTICK SALMONELLA en alimentos por su inmejorable sensibilidad (100%, no hay falsos negativos para Salmonella), por su correcta especificidad (90%, solo un 10% de falsos positivos) y por su inmejorable límite de detección (demostrado para 10 ufc/25 g, lo cual no significa que no pueda llegar a 1 ufc/25g, el problema es que es estadísticamente imposible de evaluar a causa de la incertidumbre microbiológica). XIII. REFERENCIAS GORDON, M, et al, Invasive salmonellosis in Malawi. J Infect Developing Countries 2008; 2(6): SANCHEZ JIMENEZ, M. et al. Validation of a PCR for diagnosis of typhoid fever and salmonellosis by amplification of the hila gene in clinical simples from Colombian patients, Journal of Medical Microbiology (2004), 53, ISO 6579:2003 ALIMENTOS, método horizontal para aislamiento de Salmonella. El usuario final es el único responsable de la eliminación de los microorganismos crecidos, de acuerdo con la legislación medioambiental vigente. Autoclavar antes de desechar en la basura. Protocolo y componentes del kit MICROSTICK Salmonella diseñados y fabricados por/para MICROKIT desde el 22 de Diciembre de

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9 ER 0632/1999 ISO 9001 Apartado de Correos / P.O. Box Valdemorillo (Madrid, Spain) (34) Fax: (34) E mail: microkit@microkit.es Web: Uso exclusivo en laboratorio Ref.KMTC86 COLICULT-MCC CRIOTECA PLAQUIS M-IDENT COSMETIKIT CHROMOSALM KITPRO-5S SEILAGUA COMPACT-DRY-PLATES DESINFECTEST NUTRILINIA MUGPLUS CROMOKIT MICROSTICK-LISTERIA Test rápido de Immunocromatografía para la detección cualitativa de Listeria spp. en muestras de alimentos. LAS 10 VENTAJAS DE UN KIT SOBRESALIENTE: 1 Rapidez de resultados: 5 10 minutos tras el enriquecimiento! (no horas como los kits ELISA, ni 3 4 días como en el método tradicional de cultivo en placa). Ahorro en la obtención de resultados, conseguidos en sólo 36 horas (incluidos los enriquecimientos). Ahorro mínimo de 2 días de trabajo. Elimina la necesidad de ir a leer resultados en días festivos. 2 Robustez: se ahorran los puntos críticos de otros métodos, como los látex o ELISAs; el inmunocromatograma es el método inmunológico más duro en toda circunstancia, que puede almacenarse durante meses fuera del refrigerador y transportarse a temperatura ambiente sin verse alterado. 3 Sensibilidad extraordinaria: 99,9% para L.monocytogenes, lo que limita la proporción de resultados falsamente negativos a algo testimonial, convirtiendo el método en un correcto screening de barrido de muestras negativas de Listeria monocytogenes, ya que si no hay Listeria, no hay Listeria monocytogenes. 4 Especificidad excelente: 95%, lo que limita adecuadamente la proporción de resultados falsamente positivos y permite ahorrar las posteriores confirmaciones de los presuntos positivos a menos del 5% de casos en los que no había Listeria monocytogenes y el test dió presunto positivo 5 Kit compacto: incluye los dos caldos de enriquecimiento ISO optimizados y los Sticks confirmativos 6 Comodidad de uso: es como un test de embarazo, no necesita aparato alguno para su interpretación, simple y visual por aparición de dos bandas de colores. Reducir manipulaciones es reducir puntos críticos. 7 Flexibilidad: test unitarios, no hay necesidad de agrupar muestras, se pueden analizar de 1 a 20 ó más 8 Estabilidad: se mantiene, incluso sin necesidad de refrigeración (4 30ºC), durante muchos meses 9 Ahorro económico: Dada la rapidez de resultados, el alimento puede ser liberado al mercado varios días antes que como lo haría con el método clásico, lo que supone inmensos ahorros económicos para la empresa, que deben redundar en un aumento del presupuesto para el laboratorio artífice de esta heroicidad. Por ello, aunque el kit parece más costoso que el método clásico, en realidad NO LO ES en absoluto. 10 Validado: Eficiencia del 95 97,5% en todo tipo de muestras alimentarias según los mayores especialistas en España en validación de métodos microbiológicos: carne de ternera, leche pasteurizada, pescado, vegetales, ovoproductos, especias y aperitivos, harina de cereales, pollo, alimentos infantiles, alimentos dietéticos, salsas, paella, postres, pastelería, helados, embutidos loncheados, queso, mariscos, comida animal, espaguettis. Límite de detección demostrado desde 6 10 ufc Listeria /25 g de alimento con un nivel de acompañantes e interferentes muy diversos veces superior que las dianas! 1

10 I. INTRODUCION Y USO Listeria monocytogenes es un pequeño bacilo, Gram positivo que puede crecer en condiciones anaerobias o aeróbicas. Se encuentra ampliamente en el medio ambiente, en el suelo, agua y vegetación en descomposición y pueden formar parte de la flora fecal de muchos mamíferos, incluyendo adultos humanos sanos. Los síntomas iniciales de infección incluyen síntomas inespecíficos de gripe, náuseas, vómitos, fiebre, diarrea, calambres, septicemia, meningitis... Hay muy pocas características clínicas que son exclusivas de la listeriosis. Los síntomas se pueden desarrollar en cualquier momento desde 2 a 70 días después de comer alimentos contaminados. A excepción de la transmisión vertical madre feto, la mayoría de los casos de listeriosis comienza con la ingestión de una fuente de alimentación contaminada. La mayoría de los adultos y los niños que consumen alimentos contaminados, experimentan sólo síntomas leves o moderados. Las personas inmunocomprometidas (bebés, ancianos, embarazadas, convalecientes ) corren un riesgo mucho mayor de sufrir manifestaciones graves e incluso mortales de listeriosis. El MICROSTICK LISTERIA es un kit de 3 componentes diseñado para proporcionar una rápida detección de Listeria spp. (incluida L.monocytogenes) en muestras de alimentos. El MICROSTICK LISTERIA combina un doble enriquecimiento optimizado de la muestra, con un inmunoensayo cromatográfico para la detección cualitativa de Listeria spp. (incluida L.monocytogenes) en muestras de alimentos contaminados. II. FUNDAMENTO DEL TEST Los caldos de pre enriquecimiento revitalizador y post enriquecimiento selectivo, basados en los de la Norma ISO pero optimizados para el Stick, mejoran extraordinariamente el rendimiento de ésta. La membrana del Stick está revestida con anticuerpos monoclonales de ratón, en la región de banda del test, para reconocer este antígeno. Durante la prueba, la muestra puede reaccionar con las partículas rojas de látex que están recubiertas con anticuerpos anti Listeria pre desecados. La mezcla resultante, migra hacia arriba en la membrana por acción capilar. Como la muestra fluye a través de la membrana, el aglutinado de partículas rojas migra. En el caso de un resultado positivo, los anticuerpos específicos presentes en la membrana capturarán el aglutinado de partículas rojas, formando una banda roja. La mezcla sigue avanzando a través de la membrana con el anticuerpo inmovilizado que está en la región de la banda de control. En la línea de control aparece una banda de color verde, lo cual verifica que se ha añadido el volumen suficiente y que se obtuvo un flujo adecuado del caldo de postenriquecimiento inoculado, además de servir como control interno de los reactivos. III. REACTIVOS Y MATERIALES Cada Kit contiene: tubotes (ref: DPA015) con polvo estéril del caldo de revitalización MICROKIT Listeria para 25 g de alimento (pre enriquecimiento) tubos (ref: TPL033) con 10 ml del caldo de enriquecimiento selectivo MICROKIT Listeria, de color amarillo (post enriquecimiento) tarjetas inmunocromatográficas para Listeria Ag (Sticks) 4. Instruciones de uso Materiales necesarios (no suministrados): Contenedor de recogida de muestras, guantes desechables, contenedor de desechos, pipetas de plástico, temporizador, Stomacher y bolsas Stomacher, incubadoras + 30 ºC y + 37 ºC (se puede mantener con sólo la estufa de 35 37ºC), y agua purificada estéril. IV. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Los tubotes de polvo deben mantenerse lejos de la humedad atmosférica, entre 15 y 25 C, y emplear antes de la fecha de caducidad impresa en sus etiquetas. Los tubos de líquido deben mantenerse entre 8 y 25 C al abrigo de la luz y usar antes de la fecha de caducidad impresa en sus etiquetas. Las tarjetas inmunocromatográficas deben almacenarse tal como están empaquetadas en sus bolsas selladas, así como los tubos herméticos, a una temperatura comprendida entre 4 y 30 ºC (36 86ºF), al abrigo de la luz y de la humedad. No congelar! Las tarjetas son estables hasta la fecha de caducidad impresa en su bolsa sellada y deben permanecer en éstas hasta su uso. V. TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS Las muestras de alimentos deben ser recogidas en recipientes limpios y el ensayo debería realizarse inmediatamente después de la recogida. Aún así, las muestras pueden almacenarse en el frigorífico (2 4 º C) durante 1 2 días previos a la prueba. Para un almacenamiento más prolongado, la muestra debe mantenerse en el congelador a 20ºC. En ese caso, la muestra será totalmente descongelada y puesta a temperatura ambiente antes del ensayo. Descongelar sólo la cantidad necesaria ya que los ciclos de congelación descongelación no son recomendables. Homogeneizar la muestra lo mejor posible antes de la preparación. 2

11 Para conseguir el nivel necesario de 1 célula de Listeria monocytogenes en 25g de alimento, es fundamental realizar un enriquecimiento adecuado en dos fases: a) Pre enriquecimiento, enriquecimiento primario o fase revitalizante de las células de Listeria monocytogenes dañadas sub letalmente durante la fabricación el alimento y neutralización de los conservantes del alimento, sean naturales, sean añadidos b) Post enriquecimiento, enriquecimiento secundario o fase de enriquecimiento selectivo que multiplicará más que las acompañantes, las células de Listeria monocytogenes hasta ufc/ml, un nivel más que adecuado para ser detectadas por las tarjetas inmunocromatográficas del MICROSTICK LISTERIA, que detectan desde 10 4 ufc/ml Aún así, diversos kits en el mercado aseguran que la fase de post enriquecimiento no es necesaria, sobre todo si el nivel de flora interferente (aerobios totales) es baja, menor a 10 4 ufc/ml final; esa es una afirmación muy aventurada, ya que si se comete el frecuente error de validar el kit con una muestra que tenga ya de entrada células viables de Listeria/25 g y escasa flora interferente, lógicamente la fase de enriquecimiento multiplicador es redundante; pero nadie puede asegurar la detección de Listeria por debajo del límite de detección de la técnica, que en inmunocromatografía ronda las 10 6 células de Listeria por test (y las 10 4 células de Listeria por test en el mejor de los casos, como es el MICROSTICK LISTERIA para L.monocytogenes). Por ello el laboratorio debe elegir un kit de su total confianza, validado por entidades que muestren claramente todos los datos de la validación y no un simple certificado, por mucho renombre internacional que tenga la entidad certificadora. VI. ENRIQUECIMIENTO NECESARIO DEL ALIMENTO ANTE LA POSIBLE PRESENCIA DE Listeria monocytogenes 1 Mezclar 25 g de muestra sólida o 25 ml de muestra líquida con 225 ml de agua estéril a la que añadiremos el polvo contenido en un tubote de caldo revitalizador Listeria MICROKIT (una mejora del caldo semifraser, especialmente obligada para este kit). Si es preciso, golpear el tubote con polvo de pre enriquecimiento, en posición horizontal, antes de abrirlo, para descompactar el polvo del fondo; después cerciórese de que se ha vaciado completamente sobre el agua y la muestra. Homogeneizar durante aproximadamente 2 minutos, a ser posible en el Stomacher. Incubar durante h a 28 30ºC, o bien a 35 37ºC. 2 Añadir 1 ml de caldo de enriquecimiento a un tubo de 10 ml de caldo de enriquecimiento selectivo Listeria MICROKIT. Incubar durante otras h a C. Si no hay turbidez en el tubo después de 24 horas de incubación, reincubar otras 24 ± 2 h. Ya en el segundo día se obtendrán los resultados para Listeria monocytogenes, ya que de aquí al paso siguiente se tardan escasamente 5 15 minutos. VII. PROCEDIMIENTO PARA EL TEST INMUNOCROMATOGRÁFICO EN MUESTRAS DE ALIMENTOS Mantener previo al ensayo, todo el material: test, muestras y envases, a temperatura ambiente (15 30ºC/59 86ºF ). No abrir las bolsas hasta el momento de realizar el ensayo. 1. Abra la bolsa del Stick por la muesca, retire la tarjeta, descarte la bolsita desecante y use la tarjeta lo antes posible. 2. Con una pipeta diferente para cada muestra, dispensar 3 5 gotas ó 100 µl de la muestra de post enriquecimiento en el pocillo (S), hasta que éste se llene completamente, evitando añadir partículas sólidas de la muestra (no pipetear del fondo del tubo). Llenar el pocillo generosamente de caldo de post enriquecimiento, con un volumen suficiente como para crear un menisco que casi desborde el pocillo. Iniciar el temporizador. 3. Leer el resultado en 5 15 minutos (aparecen las bandas de colores, normalmente la de control mucho antes que la del test). Generalmente no hace falta esperar 15 minutos a la lectura del Stick y en los primeros 2 5 minutos ya se ven los positivos, pero en caso negativo hay que esperar 15 minutos por si acaso se trata de un positivo lento. VIII. INTERPRETACION DE RESULTADOS NEGATIVO: Solo aparece una banda verde en la ventana central del sitio marcado con la letra C (línea de control). POSITIVO: BANDA ROJA DEL TEST Y VERDE DEL CONTROL NEGATIVO: SÓLO BANDA VERDE DEL CONTROL POSITIVO: Además de la banda verde de control a través de la ventana central del sitio marcado con la letra C (línea de control), aparece una banda roja (línea de test) en el sitio marcado con la letra T (región de resultados). Toda banda roja, por tenue que sea o truncada que esté, debe considerarse muestra positiva. NO VALIDO: Ausencia total de banda coloreada en C. Revisar el procedimiento y repetir usando un nuevo Stick con otra muestra similar del caldo LEB, sin partículas de alimento. 3

12 IX. CONTROL DE CALIDAD INTERNO Los controles internos están incluidos en el test. La línea de color verde que aparece en la región de control (C) es un control interno. Confirma un suficiente volumen de muestra y una correcta técnica de uso del test. Si desea un control positivo de Listeria monocytogenes emplee preferentemente cepas de referencia como L.monocytogenes (por ejemplo la NCTC 11994) X. PRECAUCIONES ESPECIALES Y LIMITACIONES DEL KIT Solo para profesionales de laboratorio. No utilizar ningún reactivo después de su fecha de caducidad. Seguir las buenas prácticas de laboratorio: ropa protectora, guantes desechables y no comer, beber o fumar en la zona... Todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas y ser manejadas igual que un agente infeccioso. Los tubotes y tubos de caldos deben permanecer cerrados hasta el momento de su uso, guardados en lugar fresco, seco y oscuro. Siga al pie de la letra las instrucciones de enriquecimiento, ya que otras combinaciones y otros medios como el agua peptonada tamponada en pre enriquecimiento, han demostrado no ser válidos, al disminuir drásticamente la efectividad del kit. La turbidez o el viraje de color en los tubos no es indicadora de presunta presencia de Listeria y debe realizarse el Stick. Los medios de enriquecimiento contienen Ac.Nalidíxico, Acriflavina y Cicloheximida, por lo que deben trabajarse con precaución (guantes, máscaras) y evitar tocar y respirar el polvo y el líquido. No se puede prescindir del post enriquecimiento; aunque en algunas muestras una incubación del pre enriquecimiento prolongada otras 18 h permite obtener positivos reales con el Stick, la mayoría de muestras tomadas directamente de la solución madre son demasiado espesas o grasas y no migran adecuadamente en la membrana del inmunocromatograma. La adición de 0,1 ml de pre enriquecimiento (en lugar de 1 ml) a 10 ml del tubo de post enriquecimiento que defienden algunos autores, no da tan buenos resultados cuando hay presentes pocas ufc de Listeria y muchas ufc de interferentes y acompañantes, por lo que en todos los casos resulta mejor añadir 1 ml; sin embargo, se pueden añadir 0,1 ml si la muestra enriquecida es demasiado espesa o coloreada y esto impide su correcta difusión en el stick, ya que el límite de detección sigue siendo el adecuado. Las tarjetas inmunocromatográficas deben permanecer en sus bolsas selladas hasta el momento de su uso. No utilizar las tarjetas inmunocromatográficas cuyas bolsas están dañadas. El test debe realizarse dentro de las 2 horas siguientes a la apertura de la bolsa de la tarjeta inmunocromatográfica. Una vez utilizado el kit, aunque se deje secar, no funcionará correctamente con una segunda muestra aunque incluyamos altas concentraciones de Listeria: Los Sticks NO son reutilizables en ningún caso. Un exceso de muestra de alimento en el pocillo del Stick podría provocar resultados erróneos (aparecen bandas marrones). En tal caso, dejar reposar el tubo y extraer muestra limpia de la zona superior y media del tubo, para repetir el test en otro Stick. Algunas muestras de ciertos alimentos pueden disminuir la intensidad de la línea de control verde. Otras muestras (alimentos muy grasos ) pueden migrar con más dificultad por la membrana e incluso no llegar a formar la línea verde (test invalidado). Puede solicitar para estos ultimos casos, una caja de 5 sticks sin tubotes ni tubos, pida la ref: KMTC86 TT Ciclos de congelación y descongelación en la muestra no son recomendables ya que pueden causar resultados erróneos. Las tarjetas inmunocromatográficas y los tubos empleados deben eliminarse en un recipiente adecuado biohazard después de los ensayos. Esta prueba proporciona un diagnóstico presuntivo de listeriosis o ausencia/ presencia de Listeria monocytogenes en muestras de alimentos, pero un resultado negativo podría eventualmente indicar que la concentración de Listeria monocytogenes en la muestra es demasiado pequeña o que las células están demasiado sub letales y no han conseguido replicarse lo suficiente como para ser detectadas. La determinación de Listeria monocytogenes debe llevarse a cabo sobre la muestra adecuadamente enriquecida con el protocolo que se explica en este folleto. Todo positivo debe confirmarse con Agar Cromocytogenes (ref: PPL970) y si aparecen colonias verdes con halo, con Xylosa/Rhamnosa (ref: KMT012), para evitar reportar falsos positivos; aunque el medio de aislamiento de la ISO obtiene hasta un 45% de falsos positivos si están presentes ciertos acompañantes Gram positivos (frente a sólo el 5% de falsos positivos del MICROSTICK LISTERIA), las colonias verdes y con halo en dicho medio que además resulten Xilosa y Rhamnosa + se consideran L.monocytogenes. Sin embargo, este Agar Cromocytogenes no obtiene ni un solo falso negativo (sensibilidad >99,9%) incluso estando presente la Listeria monocytogenes en cantidades ínfimas (confirmado desde 6 10 ufc/25 g) y la mencionada flora acompañante e interferente en cantidades muy superiores (confirmado desde ufc/25 g). XI. RENDIMIENTO A.Límite de detección El límite de detección del MICROSTICK LISTERIA es 6.25x10 4 L. monocytogenes /ml de caldo post enriquecido, que equivale, según la validación con el protocolo aquí explicado, a menos de 6 ufc de L. monocytogenes/25 g de alimento (por cuestiones de incertidumbre microbiológica, nadie puede apostar en un método que el límite de detección sea 1 ufc). B. Sensibilidad y Especificidad Se estudiaron diversas cepas de colección con MICROSTICK LISTERIA con el método tradicional (ISO 11290). Los resultados fueron > el 99% de sensibilidad y > 96% de especificidad. La utilización de un anticuerpo monoclonal de ratón en el kit asegura un alto grado de especificidad para la detección de estas bacterias. Los anticuerpos utilizados para preparar este test reconocen epítopos de Listeria que se encuentra en los cultivos de bacterias. Estos valores preliminares deben tomarse con precaución hasta que haya más de datos de evaluación disponibles en matrices alimentarias (ver más abajo) y con cepas salvajes. C. Reactividad cruzada Se realizó una evaluación para determinar la reactividad cruzada de Listeria monocytogenes con MICROSTICK LISTERIA. No se ha 4

13 encontrado reactividad cruzada con patógenos comunes de alimentos, otros organismos ni otras sustancias presentes ocasionalmente en los alimentos, como Escherichia coli O157, Campylobacter y Salmonella. D. Validación con muestras naturales de alimentos Se analizaron 20 muestras positivas y 20 muestras negativas para Listeria de diferentes alimentos, con toda clase de microorganismos acompañantes Gram (Salmonella nottingham, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, E.coli) e interferentes Gram + (Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis,) en mezclas muy diversas y a muy superior concentración (> ufc/25 g) que los microorganismos diana (Listeria monocytogenes, Listeria grayii, Listeria ivanovii, Listeria welshimeri, Listeria inocua), que estaban (sólo una de ellas en cada una de las diferentes matrices) a un nivel ínfimo de presencia (6 10 ufc/25 g). Los alimentos implicados en la validación fueron hamburguesa cruda de ternera, leche pasteurizada, pescado crudo, ensaladas vegetales, huevo crudo, patatas con ajo, cebolla y pimienta, harina de trigo, pollo crudo, papilla infantil de frutas, barritas dietéticas con chocolate, salsa rosa, paella arroz a banda, pasteles variados, crema catalana, helado de vainilla, chorizo loncheado, queso curado, mariscos, galletas de perro, espaguettis. Los resultados fueron, para tan ajustado inóculo de Listeria y tan elevada carga interferente, de una sensibilidad del 95% 100% (el único falso negativo de 20 fué en leche pasteurizada con L.ivanovii, por lo que no afecta a la búsqueda de Listeria monocytogenes) y de una especificidad del 95% (falso positivo débil, en harina de trigo). De este modo queda validado MICROSTICK LISTERIA en alimentos por su inmejorable sensibilidad (100%, no hay falsos negativos para L.monocytogenes), por su excelente especificidad (95%, solo un 5% de falsos positivos) y por su inmejorable límite de detección (demostrado para 6 ufc/25 g, lo cual no significa que no pueda llegar a 1 ufc/25g, el problema es que es estadísticamente imposible de evaluar a causa de la incertidumbre microbiológica). XIII. REFERENCIAS 1. BOTTELDOORN N, et al. Microbiological and molecular investigation of an increase of human listeriosis in Belgium, Euro Surveill. 2010;15(6):pii= BORTOLUSSI, R. Listeriosis: a primer. CMAJ, October, 2008 Vol 179(8), p ISO 11290: ALIMENTOS, método horizontal para aislamiento de Listeria monocytogenes. El usuario final es el único responsable de la eliminación de los microorganismos crecidos, de acuerdo con la legislación medioambiental vigente. Autoclavar antes de desechar en la basura. Protocolo y componentes del MICROSTICK LISTERIA diseñados y fabricados por/para MICROKIT desde el 19 de Diciembre de