Kit para determinação quantitativa de Anticorpos Anti-Antígeno de Superfície da Hepatite B no soro ou plasma humano, por enzimaimunoensaio (ELISA).

Transcripción

1 MS Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Quantitativo) Kit para determinação quantitativa de Anticorpos Anti-Antígeno de Superfície da Hepatite B no soro ou plasma humano, por enzimaimunoensaio (ELISA). Kit for the quantitative determination of Anti Hepatitis B Surface Antigen Antibodies in human serum or plasma, by Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Kit para la determinación cuantitativa de Anticuerpos Anti-Antígeno de superficie de la Hepatitis B en suero o plasma humano, por enzima inmunoensayo (ELISA). R E F R E F Q-E - 96 determinações / determinations / determinaciones Q-E determinações / determinations / determinaciones WAMA Diagnóstica Rua Aldo Germano Klein, CEAT CEP São Carlos - SP - Brasi Fone / Fax SAC

2 01 PORTUGUÊS IMPORTÂNCIA CLÍNICA O vírus da hepatite B (HBV) pertence à família Hepadnaviridae, que compreende uma série de vírus hepatotrópicos. Ele apresenta uma estrutura externa ou superficial (antígeno de superfície - HBsAg) e outra interna denominada centro ou core (HBcAg). Há também uma fração antigênica, oriunda da parte central, denominada antígeno e (HBeAg). No soro de pacientes infectados podem-se observar duas formas: uma partícula completa (partícula de Dane) com 42 nm de diâmetro e nucleocapsídeo de 27 nm, que é indicativa de replicação viral, cujo marcador é a presença do HBeAg, e partículas esféricas ou tubulares de 22 nm de diâmetro, constituídas apenas pelo envelope viral. O principal antígeno do envelope é o HBsAg, enquanto no core são encontrados o HBcAg e o HBeAg. Há quatro principais subtipos sorológicos de HBsAg: adw, ayw, adr e ayr. A resolução de qualquer infecção pelo HBV, ocasionada por qualquer sorotipo, culmina com a produção de anti-hbsag contra o epítopo a presente em todos os sorotipos. O HBsAg é o primeiro marcador sorológico a positivar em infecção por HBV. A presença de HBsAg freqüentemente antecede o início dos sintomas e das anormalidades bioquímicas hepáticas por 6-8 semanas. Em pacientes que se curam, o HBsAg desaparece do soro em semanas após o início dos sintomas ou do aumento das concentrações das aminotransferases. A persistência de HBsAg positivo por mais de 6 meses é geralmente indicativo de infecção crônica, podendo evoluir para cirrose ou carcinoma hepatocelular. O surgimento do anti-hbsag e conseqüente desaparecimento do HBsAg confere imunidade ao indivíduo, fato esse em que se baseia a vacinação para a hepatite B através da utilização de HBsAg purificado para o desenvolvimento do anti-hbsag. Desde 1982 o Center of Disease Control (CDC) dos EUA tem recomendado o uso de vacinação contra a hepatite B em indivíduos de risco, como os profissionais da área da saúde com frequente exposição a sangue e agulhas contaminadas. A partir daí, vários são os programas de vacinação para hepatite B, cujo objetivo é o de tornar esses indivíduos imunes a doença. A detecção quantitativa de anticorpos anti-hbsag é importante método para monitorar indivíduos que receberam a vacina da hepatite B quanto ao seu estado imune. A ausência de anticorpos anti-hbsag e anti-hbcag indica suscetibilidade à infecção pelo HBV. O Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Quantitativo) da WAMA é um teste imunoenzimático, tipo sanduiche, que utiliza proteínas recombinantes do envelope viral do HBV, para detectar quantitativamente a presença de anticorpos anti-hbsag no soro ou plasma humano, com a finalidade de determinar a concentração de anticorpos anti-hbsag para avaliação de resposta imune ao uso de vacina para hepatite B. PRINCÍPIO DO MÉTODO As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com antígeno recombinantes do HBsAg (fase sólida). Amostras de soro ou plasma contendo anticorpos anti-hbsag são adicionadas às cavidades juntamente com um conjugado HBsAg marcado com peroxidase. Após a incubação, haverá a formação de um complexo antígeno-anticorpo-antígeno representado pelo conjugado HBsAg marcado com peroxidase, pelo anticorpo anti-hbsag da amostra e pelo antígeno HBsAg ligado à cavidade da microplaca. O material não ligado é removido por lavagem. Um substrato cromógeno (TMB e peróxido de hidrogênio uréia) é adicionado, o qual desenvolverá cor azul nas cavidades onde a enzima peroxidase estiver presente, indicando a presença do anticorpo anti-hbsag. A adição de uma solução stop ácida para bloqueio da reação enzimática mudará a cor da solução para amarela. A absorbância é então medida a 450 nm. A concentração do anticorpo anti-hbsag é diretamente proporcional a intensidade da cor da reação. APRESENTAÇÃO DO KITAPRESENTAÇÃO DO KIT R E F Q-E - 96 determinações 1.Microplaca com cavidades cobertas com antígeno recombinante HBsAg (12 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem - 20 x concentrada (1 x 30 ml) 3. Conjugado HBsAg marcado com peroxidase (1 x 6,5 ml) 4. Substrato Cromógeno Solução A (Peróxido de Hidrogênio) (1 x 7,0 ml) 5. Substrato Cromógeno Solução B (TMB) (1 x 7,0 ml) 6. Solução Stop (1 x 7,0 ml) 7. Calibradores: 0,0 mui/ml de anti-hbsag (1 x 0,5 ml), 8. Calibradores: 10,0 mui/ml de anti-hbsag (1 x 0,5 ml), 9. Calibradores: 20,0 mui/ml de anti-hbsag (1 x 0,5 ml), 10. Calibradores: 40,0 mui/ml de anti-hbsag (1 x 0,5 ml), 11. Calibradores: 80,0 mui/ml de anti-hbsag (1 x 0,5 ml),

3 Calibradores: 160,0 mui/ml de anti-hbsag (1 x 0,5 ml). 13. Instruções para uso R E F Q-E determinações 1.Microplacas com cavidades cobertas com antígeno recombinante HBsAg (24 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem - 20 x concentrada (2 x 30 ml) 3. Conjugado HBsAg marcado com peroxidase (2 x 6,5 ml) 4. Substrato Cromógeno Solução A (Peróxido de Hidrogênio) (2 x 7,0 ml) 5. Substrato Cromógeno Solução B (TMB) (2 x 7,0 ml) 6. Solução stop (2 x 7,0 ml) 7. Calibradores: 0,0 mui/ml de anti-hbsag (2 x 0,5 ml), 8. Calibradores: 10,0 mui/ml de anti-hbsag (2 x 0,5 ml), 9. Calibradores: 20,0 mui/ml de anti-hbsag (2 x 0,5 ml), 10. Calibradores: 40,0 mui/ml de anti-hbsag (2 x 0,5 ml), 11. Calibradores: 80,0 mui/ml de anti-hbsag (2 x 0,5 ml), 12. Calibradores: 160,0 mui/ml de anti-hbsag (2 x 0,5 ml). 13. Instruções para uso PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES MICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-8 ºC. TAMPÃO DE LAVAGEM 20 x concentrado (2): tampão salino-fosfato (PBS). Diluir o volume do concentrado completando para 1000 ml com água destilada ou deionizada. Se houver presença de cristais no tampão concentrado, eles devem ser dissolvidos a 37 ºC antes da diluição. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350µl do tampão diluído. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. CONJUGADO HBsAg MARCADO COM PEROXIDASE (3): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO SOLUÇÃO A (PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO URÉIA) (4): estabilizado e pronto para uso. Estável entre 2-8 C até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO SOLUÇÃO B (TMB) (5): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não carcinogênico. SOLUÇÃO STOP (6): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4) 1,0 M. Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa no etiqueta do frasco. CALIBRADORES ( ): anticorpo anti-hbsag diluído em tampão estabilizador de proteínas. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 0,1% como conservante. Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2-8ºC). AMOSTRAS Usar amostra de soro ou plasma livre de hemólise, lipemia e contaminação. A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser mantidas no freezer a -20 ºC. Amostras congeladas devem ser homogeneizadas antes do teste. Evitar formação de espuma. Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos, pois isto pode causar falsos resultados. Não usar amostras inativadas. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO Micropipeta (50µl) e ponteiras. Água destilada ou deionizada para diluição do tampão de lavagem.

4 03 Agitador de microplaca. Incubador com temperatura de 37 ºC. Leitora de microplaca com filtro de 450 nm. Papel absorvente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMENTO IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do blank deve ser desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm. 1. De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, dispensar 50µl de cada calibrador ( ), sem diluir, para determinar a Curva de Calibração (um calibrador por cavidade). Recomenda-se usar os calibradores em duplicata. Dispensar 50µl das amostras nas outras cavidades a serem testadas. Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, evitando com isso contaminação. Usar 1 cavidade para o blank, o qual conterá somente 50µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50µl do substrato cromógeno Solução B (5). 2. Dispensar 50µl do conjugado (3) em todas as cavidades, exceto no blank. 3. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 4. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37 ºC por 60 minutos. 5. Descartar o conteúdo da placa dentro de um recipiente contendo solução desinfetante. 6. Lavar a placa 5 vezes com a solução de lavagem diluída (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos). Aspirar o conteúdo da microplaca, dispensar 350µl de solução de lavagem diluída (2) em cada cavidade, aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 4 vezes este procedimento (total de 5 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática. ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do ensaio. 7. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido residual. 8. Dispensar 50µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50µl do substrato cromógeno Solução B (5) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. Haverá o desenvolvimento de cor azul onde a enzima peroxidase estiver presente. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 9. Incubar a 37 C por 15 minutos, protegendo da luz. 10. Bloquear a reação dispensando 50µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. A cor da solução mudará para amarela. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 11. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o blank do substrato, dentro de 10 minutos. NOTA: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. IMPORTANTE: O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas. A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada. O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30 minutos. RESUMO DO PROCEDIMENTO 1. Pipetar 50µl dos calibradores (7 a 12), em duplicata, e das amostras na microplaca. 2. Pipetar 50µl do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto blank. 3. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar a 37 ºC por 60 minutos. 4. Descartar o conteúdo da placa e lavar 5 vezes com solução de lavagem (2) 5. Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual. 6. Pipetar 50µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50µl do substrato cromógeno Solução B (5) em cada cavidade da placa, inclusive no blank. A cor da solução fica azul onde houver peroxidase. 7. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar no escuro a 37 C por 15 minutos. 8. Pipetar 50µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca. A cor da solução ficará amarela. 9. Homogeneizar por 30 segundos. 10. Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank dentro de 10 minutos.

5 04 EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA A Blank C4 A4 B C1 C5 A5 C C1 C5 A6 D C2 C6 A7 E C2 C6 A8 F C3 A1 A9 G C3 A2 A10 H C4 A3 CÁLCULOS DOS RESULTADOS Determinar para cada teste e calibradores a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo da leitura da D.O. do blank, se um leitor com filtro de 450 nm é usado. Se a leitura das D.O. é realizada em um leitor com duplo comprimento de onda (450/630 nm), não subtrair o valor da D.O. pela D.O. do blank. Em papel duplo logarítmico (log/log), plotar as D.O. média (log da D.O.) de cada calibrador no eixo Y (ordenada) e a correspondente concentração no eixo X (abcissa) (log da concentração em mui/ml). Traçar a Curva de Calibração através dos pontos plotados. Estabelecer o melhor ajuste. Para se determinar a concentração de anticorpo anti-hbsag das amostras desconhecidas, plotar a D.O. obtida da amostra desconhecida no eixo Y, traçar o ponto de intersecção na Curva de Calibração e ler a correspondente concentração no eixo X, em mui/ml EXEMPLO DE CURVA DE CALIBRAÇÃO: Concentração Calibradores Log da Conc. mui/ml Média da D.O. Log da Média da D.O. 10 mui/ml 20 mui/ml 40 mui/ml 80 mui/ml 160 mui/ml 1 1,30 1,60 1,90 2,20 0,186 0,380 0,770 1,427 2,249-0,728-0,420 0,113 0,154 0,352 Exemplo de Curva de Calibração de Anti-HBsAg VALIDAÇÃO DO TESTE: O teste é válido se: A D.O. do blank, que contém somente Substrato Cromógeno A e B e Solução Stop, é menor do que 0,080 a 450 nm. O valor da D.O. do calibrador de 0 mui/ml é menor do que 0,100 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank. O valor da D.O. do calibrador de 160 mui/ml é maior do que 1,500 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank.

6 05 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS: REAGENTE : Amostras com concentrações de anticorpos iguais e superiores a 5 mui/ml. NÃO REAGENTE : Amostras com concentrações de anticorpos inferiores a 5 mui/ml. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE SENSIBILIDADE ANALÍTICA Em indivíduos vacinados, o valor mínimo estabelecido pela WHO como protetor para hepatite B é de 20 mui/ml. O Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Quantitativo) tem sensibilidade de 5 mui/ml. SENSIBILIDADE CLÍNICA Em um estudo para se determinar o desempenho do Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Quantitativo) frente a 120 indivíduos que receberão vacina para hepatite B, em comparação com um teste comercial por quimioluminescência, o teste mostrou concentrações de anticorpos superiores a 5 mui/ml, apresentando 100% de concordância com o teste comercial de referência. Em um outro estudo realizado por um laboratório de referência que utiliza da técnica de quimioluminescência, 64 amostras de pacientes que encontravam-se em estado de convalescência e que apresentavam HBsAg negativo, anti-hbcag Total Positivo e anti-hbsag positivo, o Imuno-ELISA Anti- HBsAg (Quantitativo) mostrou 100% de sensibilidade quando comparado com o teste de referência. ESPECIFICIDADE O Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Quantitativo) foi utilizado para se determinar a concentração de anticorpos anti-hbsag de 180 amostras de soro de indivíduos sadios com níveis de anticorpos anti-hbsag conhecidamente abaixo de 5 mui/ml. O teste mostrou 99,44% de especificidade. Somente 1 amostra apresentou resultado maior que 5 mui/ml. Não foi observada reação cruzada em soros de pacientes infectados por vírus da hepatite A, vírus hepatite C, citomegalovírus, HIV e Treponema pallidum. Nenhuma interferência foi verificada com fator reumatóide até a concentração de U/ml. Durante os testes realizados,nenhum efeito "Hook" para altas concentrações de anticorpos foi observado. A performance característica do teste não é afetada por concentrações elevadas de bilirrubina e hemoglobina. PRECISÃO DO TESTE a. Precisão Intra-Ensaio A precisão intra-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de, uma positiva e outra negativa, em 20 replicatas. Amostras Número de Vezes Resultado (média) Desvio Padrão CV (%) Positiva 20 10,50 0,2 2,4% Negativa 20 2,50 0,1 3,6% b. Precisão Inter-Ensaio A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 1 amostra de soros positivos e 1 amostra de soro negativo em 20 diferentes corridas. Amostras Número de Vezes Resultado (média) Desvio Padrão CV (%) Positivo 20 10,7 0,1 1,0% Negativo 20 2,4 0,1 2,9% LIMITAÇÕES DE USO O teste Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Quantitativo) da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade e especificidade. Resultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as informações clínicas do paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais. Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não reagentes. Devido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados positivos podem ocorrer devido a várias razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem.

7 06 A prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste. Alguns indivíduos apresentam forte resposta imunológica após vacinação. Concentrações de anticorpos que extrapolam o último ponto da Curva de Calibração podem ser diluídas e retestadas. Entretanto, deve-se ter em mente que tais amostras podem não apresentar propriedades lineares após diluição. O mesmo pode acontecer se algum calibrador do kit for diluído. A comparação de resultados entre kits de diferentes fabricantes geralmente dão resultados quantitativos similares; entretanto, algumas amostras podem apresentar discrepância nos resultados devido a diversidade dos anticorpos e às propriedades antigênicas do HBsAg usado no ensaio. PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS 1. Os reagentes devem ser conservados entre 2-8 ºC. 2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit. 3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol. 4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível. 5. O Imuno-ELISA Anti-HBsAg (quantitativo) da WAMA contém materiais de origem humana, os quais foram testados, com resultados negativos para anticorpos anti-hiv I e II, antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) (exceto o Soro Controle Positivo) e anti-hcv. Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa segurança, na ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar todos os reagentes como materiais potencialmente infecciosos, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais. 6. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes. 7. Deixar os reagentes adquirir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de iniciar os testes. 8. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso. 9. Não deixar os cavidades da microplaca secar durante o ensaio. 10. Evitar repetidas pipetagem dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação. 11. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as mesmas condições do teste. 12. Não usar reagentes após a data de validade. 13. Descartar o material conforme regulamentações locais. 14. Utilizar a Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais. Marcador HBsAg Anti-HBsAg Anti-HBcAg Total Anti-HBcAg IgM HBeAg Anti-HBeAg HEPATITE B - Interpretação dos Marcadores Significado É o primeiro marcador que aparece na hepatite B. Declina em até 6 meses. Sua presença por mais de 6 meses indica hepatite crônica. Sua presença indica imunidade ao HBV. Presente após o desaparecimento do HBsAg. Está presente isoladamente em indivíduos vacinados. Sua presença significa infecção recente ou pregressa pelo HBV. Necessita de outros marcadores para caracterizar a fase da doença. Indica infecção recente. Pode ser encontrado em até 32 semanas após a infecção. É marcador de replicação viral. Sua presença indica alta infecciosidade. Em cepas com mutação pré-core (não produtoras da proteína e ) pode estar ausente, embora a replicação viral continue e, consequentemente, sua alta infecciosidade. Indica o fim da fase de replicação viral. Surge após desaparecimento do HBeAg. HEPATITE B Interpretação dos Resultados Sorológicos** Interpretação HBsAg Anti-HBsAg Anti-HBcAg Total Anti-HBcAg IgM HBeAg Anti-HBeAg Não Imune Infecção Recente Início Convalescência Imune Infecção Passada Recente Imune Infecção Passada Imune Infecção Passada * Imune Uso de Vacina * O anti-hbsag pode estar em níveis indetectáveis pelos testes sorológicos em infecção pregressa após longo tempo. ** Perfis sorológicos atípicos podem ser encontrados no curso da infecção pelo HBV.

8 07 TERMO DE GARANTIA A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições. ENGLISH SUMMARY The Hepatitis B Virus (HBV) belongs to the Hepadnaviridae family, which makes it a hepatotrophic virus. It has an external or superficial structure (surface antigen - HBsAg), and another core (HBcAg). There is also an antigenic fraction, which grows from the core, called e antigen (HBeAg). In serum of infected patients one can observe two types of structures: a complete particle (Dane's particle), which is 42 nm in diameter and has a nucleocapside of 27 nm, which is an indication of viral replication through the HBeAg marker, and spherical or tubular particles of 22 nm in diameter, made out of the viral envelope. The main antigen of the envelope is the HBsAg, while in the core is HBcAg and HBeAg. There are four main serological HBsAg subtypes: adw, ayw, adr and ayr. The resolution of any infection by HBV from any serotype is the production of HBsAb against the a epitope present in all the serotypes. The HBsAg is the first serological marker to become positive in an infection by HBV. The presence of HBsAg frequently precedes the start the symptoms and the hepatic biochemical abnormalities by 6 to 8 weeks. In patients that are cured, the HBsAg disappears from the serum weeks after the onset of the symptoms or increase of the aminostransferase concentration. The presence of positive HBsAg for more than 6 months is usually an indication of chronic infection, which can develop into cirrhosis or hepatocelular carcinoma. The appearance of HBsAb and consequently disappearance of HBsAg grants immunity to the patient, which is the basis for the vaccination against Hepatitis B through the use of purified HBsAg for the development of HBsAb. Since 1982 the U.S. Center of Disease Control (CDC) has recommended vaccination against hepatitis B in individuals at risk, such as health care professionals who are frequently exposed to blood and contaminated needles. Since then, there has been several vaccination programs for hepatitis B, whose goal is to make these individuals immune to the disease. The quantitative detection of anti-hbsag antibodies is an important method to monitor the immunity of individuals who received the hepatitis B vaccine. The absence of anti- HBsAg and anti-hbcag antibodies indicates susceptibility to infection by HBV. The Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Quantitative) from WAMA is an immunoenzymatic test, sandwich type, which uses recombinant proteins from the viral envelope of HBV, to quantitatively detect the presence of anti- HBsAg antibodies in human serum or plasma, with the purpose of determining the concentration of anti- HBsAg antibodies to evaluate the immune response to vaccine for hepatitis B. PRINCIPLE OF THE METHOD The microtiter wells of the plate are covered with the recombinant HBsAg antigen (solid phase). Specimens of serum or plasma containing HBsAb antibodies are added to the wells together with a HBsAg conjugated with peroxidase. After incubation, it'll form an antigen-antibody-antigen complex represented by the HBsAg conjugated to peroxidase, by the HBsAb antibody from the specimen, and by the HBsAg antigen bound to the microtiter well. Material not bound is removed by washing. A chromogen substrate (TMB+ urea hydrogen peroxide) is added, which will develop a blue coloration on the cavities when the peroxidase enzyme is present, indicating the presence of the anti-hbsag antibody. The addition of an acidic stop solution to block the enzymatic reaction will change the coloration of the solution to yellow. The absorbance is then measured at 450 nm. The concentration of the HBsAb antibody is directly proportional to the intensity of the reaction color. KIT PRESENTATION R E F Q-E - 96 determinations 1. Microplates with wells coated with HBsAg antigen (12 removable strips with 8 wells each) 2. Wash Solution - concentrated 20x (1 x 30 ml) 3. HBsAg Conjugate tagged with peroxidase (1 x 6.5 ml) 4. Chromogen Substrate - Solution A (Hydrogen Peroxide) (1 x 7.0 ml) 5. Chromogen Substrate - Solution B (TMB) (1 x 7.0 ml) 6. Stop Solution (1 x 7.0 ml) 7. Calibrators: 0.0 miu/ml of anti-hbsag (1 x 0.5 ml). 8. Calibrators: 10.0 miu/ml of anti-hbsag (1 x 0.5 ml).

9 08 9. Calibrators: 20.0 miu/ml of anti-hbsag (1 x 0.5 ml). 10. Calibrators: 40.0 miu/ml of anti-hbsag (1 x 0.5 ml). 11. Calibrators: 80.0 miu/ml of anti-hbsag (1 x 0.5 ml). 12. Calibrators: miu/ml of anti-hbsag (1 x 0.5 ml). 13. Instructions for use R E F Q-E determinations 1. Microplates with wells coated with HBsAg antigen (24 removable strips with 8 wells each) 2. Wash Solution - concentrated 20x (2 x 30 ml) 3. HBsAg Conjugate tagged with peroxidase (2 x 6.5 ml) 4. Chromogen Substrate - Solution A (Hydrogen Peroxide) (2 x 7.0 ml) 5. Chromogen Substrate - Solution B (TMB) (2 x 7.0 ml) 6. Stop Solution (2 x 7.0 ml) 7. Calibrators: 0.0 miu/ml of anti-hbsag (2 x 0.5 ml). 8. Calibrators: 10.0 miu/ml of anti-hbsag (2 x 0.5 ml). 9. Calibrators: 20.0 miu/ml of anti-hbsag (2 x 0.5 ml). 10. Calibrators: 40.0 miu/ml of anti-hbsag (2 x 0.5 ml). 11. Calibrators: 80.0 miu/ml of anti-hbsag (2 x 0.5 ml). 12. Calibrators: miu/ml of anti-hbsag (2 x 0.5 ml). 13. Instructions for use REAGENT PREPARATION AND STABILITY MICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach room temperature (20-25 C). The strips that will not be used must be returned to the sealing envelope, with desiccant, and kept at 2-8 C. WASH SOLUTION (20x Concentrated) (2): Phosphate buffer saline (PBS). Dilute the volume of the concentrate, filling it to 1000 ml with distilled or deionized water. If crystals are formed in the concentrated diluent, they must be dissolved at 37 C before the dilution is made. During each wash cycle, each well must be washed completely with approximately 350µ l of the diluted wash solution. Allow it to reach room temperature (20-25 C) before using it. HBsAg CONJUGATE TAGGED WITH PEROXIDASE (3): ready to use. Stable at 2-8 C \up to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20-25 C) before using it. CHROMOGEN SUBSTRATE - SOLUTION A (UREA HYDROGEN PEROXIDE) (4): stabilized and ready for use. Stable at 2-8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20-25 C) before using it. CHROMOGEN SUBSTRATE - SOLUTION B (TMB) (5): solution stabilized with Tetramethyl Benzidine. Ready to use. Stable at 2-8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20-25 C) before using it. The TMB is not mutagenic and not carcinogenic. STOP SOLUTION (6): ready to use. Contains 1.0 M Sulfuric Acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive. On skin contact, immediately flush with large amounts of water. Allow it to reach room temperature (20-25 C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle. CALIBRATORS ( ): Anti-HBsAg antibody diluted in protein stabilizer buffer. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2-8 C \up to the expiration date printed on the bottle. Contains ProClin % as preservative. Note: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration date described on the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 C). SPECIMENS Use serum or plasma specimens not hemolysed, lipemic or contaminated. The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 C for 48 hours. For long-term storage, serum or plasma must be kept in the freezer at 20ºC. Frozen specimens must be homogenized before testing. Avoid making foam. Avoid repeated freezing and thawing as this may lead to false results. Do not use inactivated specimens. MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED Micropipettes (50µl) and tips Distilled and deionized water for the dilution of the wash solution.

10 09 Microplate shaker. Incubator at 37 C. ELISA plate reader with 450nm filter. Absorbent paper. Container for material disposal. PROCEDURE IMPORTANT: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. In this condition, the use of "blank" should be disregarded, since it should be used only when using a 450 nm single filter. 1. In accordance with the established plan for distribution in the plate, dispense 50 l of each calibrator ( ), as is, without dilution, to determine the Calibration Curve (one calibrator per cavity well). It is recommended to use the calibrators in duplicate. Pipete 50µl of the samples to be tested into the other microplate wells. Use individual tips for each sample, to avoid contamination.. Use one cavity well for the blank, which will only have 50µl of the chromogen substrate solution A (4), and 50µl of chromogen substrate solution B (5). 2. Pipete 50µl of the conjugate (3) in all the cavity wells, except on the blank. 3. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or use a microtiter plate shaker. 4. Cover the plate with adhesive foil and incubate at 37 C for 60 minutes. 5. Discard the contents of the plate in a container with disinfecting solution. 6. Wash the plate 5 times with diluted Wash Solution (2) (see Preparation and Stability of Reagents). Aspirate the contents of the plate, dispense 350µl of diluted Wash Solution (2) in each well, wait 30 seconds, and empty the contents of the wells. Repeat this procedure 4 times (total of 5 cycles). We recommend using a microplate washer (manual or automatic). WARNING: The correct washing procedure is essential for good performance of the test. 7. After the last wash, turn the plate over and tap it dry on absorbent paper to remove any residual liquid. 8. Pipette 50µl of chromogen substrate Solution A (4) and 50µl of chromogen substrate - Solution B (5) in each well of the microplate, including the blank. A blue color will develop wherever the peroxidase enzyme is present. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 9. Incubate at 37 C for 15 minutes, protecting from light. 13. Block the reaction by dispensing 50µl of Stop Solution (6) in each well of the microplate, including the blank. The solution will change the color to yellow. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 14. Read the absorbance (O.D.) in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank of the substrate, within 10 minutes. NOTE: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. IMPORTANT: The wash procedure is critical for the performance of the test. Insufficient washing will result in inaccurate readings or falsely elevated absorbance. Performing the tests in duplicate, though not required, is recommended. The pipetting time for the specimens and controls should not exceed 30 minutes. SUMMARY OF THE PROCEDURE 1. Pipette 50 l of calibrators (7 the 12 ), in duplicate, and samples of the microplate. 2. Pipette 50µl of enzyme conjugate (3) in each well of the plate, except blank. 3. Mix for 30 seconds and incubate at 37 C for 60 minutes. 4. Discard the contents of the plate and wash it 5 times with wash solution (2) 5. Completely discard the contents of the last wash, removing any residual liquid. 6. Pipette 50µl of chromogen substrate Solution A (4) and 50µl of chromogen substrate - Solution B (5) in each well of the microplate, including the blank. The color of the solution turns blue wherever there is peroxidase. 7. Mix for 30 seconds and incubated in the dark at 37 C for 15 minutes. 8. Pipette 50µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate. The color of the solution will turn yellow. 9. Mix for 30 seconds. 10. Read the O.D. in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank within 10 minutes.

11 10 EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM OF MICROPLATE A Blank C4 A4 B C1 C5 A5 C C1 C5 A6 D C2 C6 A7 E C2 C6 A8 F C3 A1 A9 G C3 A2 A10 H C4 A3 CALCULATION OF RESULTS Determine the optical density (OD) for each test and calibrator, whose the final value is obtained by subtracting the blank from the OD, if a reader with 450 nm is used. If the reading of O.D. is performed in a reader with dual wavelength (450/630 nm), do not subtract the value of O.D by the O.D. of the blank. In a log/log paper, plot the O.D. of the average (log of O.D.) for each calibrator on Y axis and the corresponding concentration in the X axis (log of concentration in miu/ml). Plot the Calibration Curve through the plotted points. Establish the best adjustment. To determine the concentration of the anti-hbsag antibody of unknown samples, plot the O.D. obtained from the unknown sample in the Y axis, trace the intersection point of the Calibration Curve and read the corresponding concentration in the X axis, in miu/ml. EXAMPLE OF CALIBRATION CURVE: Calibrators Concentration 10 mui/ml 20 mui/ml 40 mui/ml 80 mui/ml 160 mui/ml Log of Conc. miu/ml 1 1,30 1,60 1,90 2,20 Average of O.D. 0,186 0,380 0,770 1,427 2,249 Log of Average O.D. -0,728-0,420 0,113 0,154 0,352 Example of Anti-HBsAg Calibration Curve TEST VALIDATION: The test is valid if: The O.D. of the blank,which contains only Substrate Chromogen A and B and Stop Solution is less than at 450 nm. The O.D. value of the 0 miu/ml calibrator is less than at 450/630 nm or at 450 nm after subtracting the blank. The O.D. value of the 160 miu/ml calibrator is greater than at 450/630 nm or at 450 nm after subtracting the blank.

12 11 INTERPRETATION OF THE RESULTS: REACTIVE : Samples with antibody concentrations equal and greater than 5 miu/ml. NON-REACTIVE : Samples with antibody concentrations less than 5 miu/ml. SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE TEST ANALYTICAL SENSITIVITY In vaccinated individuals, the minimum value established by the WHO as protected for hepatitis B is 20 miu/ml. The Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Quantitative) has a sensitivity of 5 miu/ml. CLINICAL SENSITIVITY In a study to determine the performance of the Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Quantitative) with 120 individuals who will receive vaccine for hepatitis B, in comparison with a commercial test by chemiluminescence, the test showed antibody concentrations higher than 5 miu/ml, showing 100% concordance with the reference commercial test. In another study carried out by a reference laboratory that uses the chemiluminescence technique, 64 samples of patients who were in a convalescence state and who had negative HBsAg, Total anti-hbcag Positive and anti-hbsag positive, the Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Quantitative) showed 100% of sensitivity when compared with the reference test. SPECIFICITY The Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Quantitative) was used to determine the concentration of anti-hbsag antibodies of 180 serum samples from healthy individuals with levels of anti-hbsag historically below 5 miu/ml. The test showed 99,44% of specificity. Only 1 sample had result greater than 5 miu/ml. There was no cross-reaction in sera of infected patients by the hepatitis A virus, hepatitis C virus, Cytomegalovirus, HIV, and Treponema pallidum. No interference was verified with rheumatoid factor until the 2,000 U/mL concentration. During the tests, no effect "Hook" for high concentrations of antibodies was observed. The performance characteristic of the test is not affected by high concentrations of bilirubin and hemoglobin. PRECISION OF THE TEST: a.intra-assay Precision The intra-assay precision was determined by assaying 2 samples of, one positive and one negative, in 20 replicates. Specimens Number of times. Result (average) Deviation Standard Positive Negative CV (%) 20 10,50 0,2 2,4% 20 2,50 0,1 3,6% b.inter-assay Precision The inter-assay precision was determined by assaying 1 sample of positive serum and 1 sample of negative serum in 20 different runs. Specimens Number of times. Result (average) Deviation Standard Positive Negative CV (%) 20 10,7 0,1 1,0% 20 2,4 0,1 2,9% LIMITATIONS OF USE The test Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Quantitative) from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity and specificity. Results repeatedly reactives must always be interpreted with the clinical information of the patient and with other laboratory test results. Reactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive. Due to the high sensitivity of ELISA tests, false positive results may occur due to various reasons, many of which are related, but not limited to, improper washing step. The prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test.

13 12 Some individuals exhibit strong immune response after vaccination. Concentrations of antibodies beyond the last point of the Calibration Curve may be diluted and retested. However, keep in mind that such samples may not have linear properties after dilution. The same can happen if a kit calibrator is diluted. The comparison of results between kits from different manufacturers generally give similar quantitative results; however, some samples may have discrepancy in results due to diversity of antibodies and the antigenic properties of HBsAg used in the assay. PRECAUTIONS AND WARNINGS 1. The reagents should be kept between 2-8 ºC. 2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box. 3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight. 4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage. 5. The Imuno-ELISA anti-hbsag (quantitative) from WAMA contains materials of human origin, which have been tested, with negative results for anti-hiv I and II antibodies, Hepatitis B surface antigen virus (HBsAg) (except in the positive serum control) and anti-hcv. However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to deal with all the reagents as potentially infectious materials, as well as having the disposing these materials. 6. Do not use reagents or microplates fof different batches. 7. Allow the reagents to reach the room temperature (20-25ºC) before starting the test. 8. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use. 9. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test. 10. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination. 11. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the same test conditions. 12. Do not use the reagent after the expiration date. 13. Discard the material following local regulations. 14. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials. Marker HBsAg Anti-HBsAg Anti-HBcAg Total Anti-HBcAg IgM HBeAg Anti-HBeAg HEPATITIS B - Interpretation of Markers Meaning It is the first marker that appears in hepatit is B. Declines in up to 6 months. Its presence for more than 6 months indicates chronic hepatitis. Its presence indicates immunity to HBV. Present after the disappearance of HBsAg. Is this present by itself in vaccinated individuals. Its presence indicates recent or previous infection by HBV. Need other markers to characterize the phase of the disease. Indicates recent infection. Can be found up to 32 weeks after infection. It is a marker of viral replication. Its presence indicates the high infectivity. In strains with pre-core mutation (does not produce protein "e") may be absent, although the viral replication continues and, consequently, its high infectivity. Indicates the end of the viral replication stage. Comes after the disappearance of HBeAg. HEPATITIS B - Interpretation of Serological Results ** Interpretation Not immune Recent Infection Beginning Convalescence Immune - Recent Previous Infection HBsAg Anti-HBsAg Anti-HBcAg Total Anti-HBcAg IgM HBeAg Anti-HBeAg Immune - Previous Infection Immune - Previous Infection Immune - use of vaccine * * The anti-hbsag can be at undetectable levels by serological tests in prior infection after a long time. ** Atypical Serologic Profiles can be found in the course of infection with HBV.

14 13 WARRANTY WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions. ESPAÑOL IMPORTANCIA CLÍNICA El virus de la hepatitis B (HBV) pertenece a la familia Hepadnaviridae, que incluye una serie de virus hepatotrópicos. Cuenta con una estructura externa o superficial (antígeno de superficie - HBsAg) y otra interna denominada centro o core (HBcAg). También hay una fracción antigénica, oriunda de la parte central, denominada antígeno e (HBeAg). En sueros de pacientes infectados se pueden observar dos formas: una partícula completa (partícula de Dane) con 42 nm de diámetro y nucleocápside de 27 nm, indicativo de la replicación viral, cuyo marcador es la presencia del HBeAg, y partículas esféricas o tubulares de 22 nm de diámetro, constituidas sólo por la envoltura viral. El principal antígeno de la envoltura es el HBsAg, mientras que en el core se encuentran el HBcAg y el HBeAg. Existen cuatro principales subtipos serológicos de HBsAg: adw, ayw, adr y ayr. La resolución de cualquier infección por el HBV, ocasionada por cualquier serotipo, culmina con la producción de anti-hbsag contra elepítopo a presente en todos los serotipos. El HBsAg es el primero marcador serológico a tornar positivo en una infección por VHB. La presencia de El HBsAg frecuentemente precede a la aparición de los síntomas y alteraciones bioquímicas del hígado durante 6-8 semanas. En los pacientes que se curan, el HBsAg desaparece del suero semanas después de la aparición de los síntomas o aumento de las concentraciones de aminotransferasas. La persistencia de el HBsAg positivo por más de 6 meses es generalmente indicativo de una infección crónica, puede progresar a cirrosis o carcinoma hepatocelular. El aumento de anti-hbsag y la consiguiente desaparición de HBsAg confiere inmunidad al individuo, hecho en que se basa la vacunación contra la hepatitis B, por medio de la utilización de HBsAg purificado para el desarrollo del anti-hbsag. Desde 1982 el Centro de Control de Enfermedades de EE.UU. (CDC, por sus siglas en inglés) ha recomendado la vacunación contra la hepatitis B en personas de riesgo, como los profesionales de la salud que con frecuencia están expuestos a sangre y agujas contaminadas. Desde entonces, ha habido varios programas de vacunación para la hepatitis B, cuyo objetivo es hacer que estos individuos inmunes a la enfermedad. La detección cuantitativa de anticuerpos anti-hbsag es un método importante para vigilar la inmunidad de las personas que recibieron la vacuna contra la hepatitis B. La ausencia de anticuerpos anti-hbsag y anti-hbcag indica susceptibilidad a infección por lo virus de la hepatitis B. El Imuno-ELISA anti-hbsag (cuantitativa) de WAMA es un test inmunoenzimático, tipo sándwich, que utiliza proteínas recombinantes de la región de la envoltura viral de VHB, para detectar cuantitativamente la presencia de anticuerpos anti-hbsag en suero o plasma humano, con la finalidad de determinar la concentración de anticuerpos anti-hbsag para evaluar la respuesta inmune a la vacuna de la hepatitis B. PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos de la placa de micrititulación se recubren con lo antígeno recombinante de HBsAg (fase sólida). Muestras de suero o plasma que contiene anticuerpos HBsAg se añaden a los pozos junto con un HBsAg conjugado con peroxidasa. Después de la incubación, se formará un complejo antígeno-anticuerpo-antígeno representado por el conjugado HBsAg marcado con peroxidasa, por el anticuerpo anti-hbsag de la muestra y por el antígeno HBsAg ligado al pocillo de la microplaca. El material no ligado se elimina mediante lavado. Un substrato (TMB + peróxido de hidrogênio) es adicionado, el cual revelará un color azul en los pocillos donde la enzima peroxidasa esté presente, indicando la existencia del anticuerpo anti-hbsag. La adición de una solución stop ácida para bloquear la reacción enzimática cambiará la color de la solución a amarillo. Entonces, la absorbancia se mide a 450 nm. La concentración del anticuerpo anti-hbsag es directamente proporcional a la intensidad del color de la reacción. PRESENTACIÓN DEL KIT R E F Q-E - 96 determinaciones 1.Microplacas con pocillos recubiertos con antígeno HBsAg (12 tiras extraíbles, con 8 pocillos c/u). 2. Solución de lavado - 20 x concentrada (1 x 30 ml). 3. Conjugado HBsAg marcado con peroxidasa (1 x 6,5 ml).

15 14 4. Sustrato Cromógeno Solución A (Peróxido de Hidrógeno) (1 x 7,0 ml) 5. Sustrato Cromógeno Solución B (TMB) (1 x 7,0 ml) 6. Solución Stop (1 x 7,0 ml) 7. Calibradores: 0,0 mui/ml de anti-hbsag (1 x 0,5 ml). 8. Calibradores: 10,0 mui/ml de anti-hbsag (1 x 0,5 ml). 9. Calibradores: 20,0 mui/ml de anti-hbsag (1 x 0,5 ml). 10. Calibradores: 40,0 mui/ml de anti-hbsag (1 x 0,5 ml). 11. Calibradores: 80,0 mui/ml de anti-hbsag (1 x 0,5 ml). 12. Calibradores: 160,0 mui/ml de anti-hbsag (1 x 0,5 ml). 13. Instrucciones de uso R E F Q-E determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígeno HBsAg (24 tiras extraíbles, con 8 pocillos c/u). 2. Solución de lavado - 20 x concentrada (2 x 30 ml) 3. Conjugado HBsAg marcado con peroxidasa (2 x 6,5 ml). 4. Sustrato Cromógeno Solución A (Peróxido de Hidrógeno) (2 x 7,0 ml) 5. Sustrato Cromógeno Solución B (TMB) (2 x 7,0 ml) 6. Solución Stop (2 x 7,0 ml) 7. Calibradores: 0,0 mui/ml de anti-hbsag (2 x 0,5 ml). 8. Calibradores: 10,0 mui/ml de anti-hbsag (2 x 0,5 ml). 9. Calibradores: 20,0 mui/ml de anti-hbsag (2 x 0,5 ml). 10. Calibradores: 40,0 mui/ml de anti-hbsag (2 x 0,5 ml). 11. Calibradores: 80,0 mui/ml de anti-hbsag (2 x 0,5 ml). 12. Calibradores: 160,0 mui/ml de anti-hbsag (2 x 0,5 ml). 13. Instrucciones de uso PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE REACTIVOS MICRO PLACA (1): Retirar de la sobre la cantidad de tiras que se utilizarán, y dejar que alcancen a temperatura ambiente (20-25 C). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con desecante, y se mantendrá a 2-8 C. SOLUCIÓN DE LAVADO (20x concentrado) (2): Tampón fosfato salino (PBS) Diluir el volumen del concentrado, completando a 1000 ml con agua destilada o desionizada. Si hay cristales en el tampón concentrado, deben disolverse a 37 C antes de la dilución. Durante cada ciclo de lavado, se debe completar cada pocillo con aproximadamente 350µl del tampón diluído. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar CONJUGADO HBsAg MARCADO CON PEROXIDASA (3): listo para usar. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO SOLUCIÓN A (PERÓXIDO DE HIDRÓGÊNO UREIA) (4): estabilizado y listo para su uso. Estable a 2-8 C hasta que fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. SUSTRATO CROMÓGENO - SOLUCIÓN B (TMB) (5): Solución estabilizada con tetrametilbencidina. Listo para usar. Estable a 2-8 C hasta que fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. Lo TMB no es mutagénico ni carcinogénico. SOLUCIÓN STOP (6): Listo para usar. Contiene 1,0 M de ácido sulfúrico (H2SO4). Manejar con cuidado. Corrosivo. En caso de contacto con la piel, lavar abundantemente en agua corriente. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. Estable C hasta la fecha de vencimiento impresa en el frasco. CALIBRADORES (7, 8, 9, 10, 11, 12): Anticuerpos Anti-HBsAg diluido en tampón proteína estabilizador. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Contiene ProClin 300 0,1 % como conservante. Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la fecha de vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2-8ºC). ESPECÍMENES Usar muestras de suero o plasma libres de hemólisis, lipemia y contaminación. Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2-8 ºC, por 48 horas. Para un período mayor, deben guardarse en freezer a -20 ºC. Muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del test. Evite la

16 15 formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados falsos. No utilice muestras inactivadas. MATERIAL NECESARIO, PERO NO SUMINISTRADO Micropipettas (50µl) y puntas de pipeta Agua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado. Agitador de microplaca. Incubadora con una temperatura de 37 º C Lector de ELISA con filtro de 450 nm. Papel absorbente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMIENTO IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm. 1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, dispensar 50 µl de cada calibrador ( ), tal como está, sin dilución, para determinar la curva de calibración (un calibrador por pocillo). Se recomienda que utilice los calibradores por duplicado. Pipete 50 µl de las muestras que serán testeados en los otros pocillos. Usar puntas de pipeta individuales para cada pipeteo, evitando la contaminación.. Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá solamente 50µl delsustrato cromógeno Solución A (4) y 50µl del sustrato cromógeno Solución B (5). 2. Dispensar 50µl del conjugado (3) en todos los pocillos, excepto el blank. 3. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 4. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37 C por 60 minutos. 5. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante. 6. Lavar la placa 5 vezes con la solución de lavado diluida (2) (ver Preparación y Estabilidad de los Reactivos). Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350µl de solución de lavado diluida (2) en cada pocillo, esperar 30 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 4 veces este procedimiento (total de 5 ciclos). Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática o manual. ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los procedimientos de lavado sean adecuados. 7. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar cualquier residuo líquido. 8. Dispensar 50µl del sustrato cromógeno Solución A (4) y 50µl del sustrato cromógeno Solución B (5) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. Aparecerá un color azul donde esté presente la enzima. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 9. Incubar a 37 C durante 15 minutos, protegerlo de la luz. 13. Bloquear la reacción dispensando 50 µl de la solución Stop (7) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. La solución se cambiará al color amarillo. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 14. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, en un plazo de 10 minutos. NOTA: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. IMPORTANTE: El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a lecturas inexactas o absorbancias falsamente elevadas. Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio. El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO 1. Dispensar 50 μl de los calibradores (7 y 12), por duplicado, y las muestras de la microplaca. 2. Dispensar 50 μl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank. 3. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37 C por 60 minutos. 4. Descartar el contenido de la placa y lavar 5 veces con tampón de lavado (2)

17 16 5. Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido. 6. Dispensar 50μl del sustrato cromógeno Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (5) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. El color de la solución se volverá azul donde sea detectada la presencia de peroxidasa. 7. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar en la oscuridad a 37 C por 15 minutos. 8. Pipetear 50μl de la Solución Stop (6) en cada pocillo de la microplaca. El color de la solución se volverá amarillo. 9. Homogeneizar por 30 segundos. 10. Leer la D.O. en un lector de microplacas con filtro de 450 nm, contra el blank dentro de 10 minutos. EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA A Blank C4 A4 B C1 C5 A5 C C1 C5 A6 D C2 C6 A7 E C2 C6 A8 F C3 A1 A9 G C3 A2 A10 H C4 A3 CÁLCULO DE LOS RESULTADOS Determinar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene restando de la lectura de la D.O. el valor del blank. Si la lectura de D.O. se realiza en un lector con doble longitud de onda (450/630 nm), no restar el valor de D.O. por la D.O. del blanco. En un papel log/log, traze lo D.O. de la media (log de D.O.) para cada calibrador en el eje Y y la concentración correspondiente en el eje X (log de concentración en mui/ml). Traze la curva de calibración a través de los puntos. Establecer el mejor ajuste. Para determinar la concentración de los anticuerpos anti-hbsag de muestras desconocidas, traze la D.O. obtenido de la muestra desconocida en el eje Y, traza el punto de intersección de la curva de calibración y leer la concentración correspondiente en el eje X, en mui/ml. EJEMPLO DE CURVA DE CALIBRACIÓN: Calibradores Concentración 10 mui/ml 20 mui/ml 40 mui/ml 80 mui/ml 160 mui/ml Log de Conc. mui/ml 1 1,30 1,60 1,90 2,20 Promedio de D.O. 0,186 0,380 0,770 1,427 2,249 Log de Media D.O. -0,728-0,420 0,113 0,154 0,352 Ejemplo Curva de Calibración de anti-hbsag

18 17 VALIDACIÓN DEL TEST: El test es válido si: La D.O. del blanco, que contiene solamente Sustrato Cromógeno A y B y Solución Stop, debe ser inferior a 0,080 a 450 nm. Lo valor de la D.O. de lo calibrador 0 mui/ml es inferior a 0,100 a 450/630 nm o a 450 nm después de sustraer el "blank". Lo valor de lo calibrador 160 mui/ml es ser igual o mayor a 1,500 a 450/630 nm o a 450 nm después de sustraer el "blank". INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS REACTIVO : Muestras con concentraciones de anticuerpo igual y mayor que 5 mui/ml. NO REACTIVO: muestras con concentraciones de anticuerpo menor de 5 mui/ml. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TEST SENSIBILIDAD ANALÍTICA: En individuos vacunados, el valor mínimo establecido por la OMS como protegidas en el caso de la hepatitis B es de 20 mui/ml. La Imuno-ELISA anti-hbsag (Cuantitativo) tiene una sensibilidad de 5 mui/ml. SENSIBILIDAD CLÍNICA En un estudio para determinar el rendimiento de Imuno-ELISA anti-hbsag (cuantitativo) con la participación de 120 individuos que recibirán la vacuna de la hepatitis B, en comparación con un ensayo comercial por quimioluminiscencia, el ensayo demostró concentraciones de anticuerpo superiores a 5 mui/ml, mostrando 100% de concordancia con la prueba comercial de referencia. En otro estudio realizado en un laboratorio de referencia que utiliza la técnica de quimioluminiscencia, 64 muestras de pacientes que estaban en un estado de convalecencia y que tenian HBsAg negativo, anti-hbcag Total positivo y anti-hbsag positivo, la Imuno-ELISA anti-hbsag (cuantitativo) mostró sensibilidad de 100% en comparación con la prueba de referencia. ESPECIFICIDAD La Imuno-ELISA anti-hbsag (cuantitativo) se utilizó para determinar la concentración de anticuerpos anti-hbsag de 180 muestras de suero de individuos sanos y con niveles de anti-hbsag históricamente por debajo de 5 mui/ml. El ensayo demostró 99,44 % de especificidad. Sólo 1 muestra tuvo resultado superior a 5 mui/ml. No hubo reacción cruzada en sueros de pacientes infectados por el virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis C, Citomegalovirus, VIH y Treponema pallidum. No hay interferencia verificada con factor reumatoide hasta la concentración de U/mL. Durante las pruebas,, no se observó ningún efecto "gancho" para las altas concentraciones de anticuerpos. La característica de rendimiento de la prueba no se ve afectado por las altas concentraciones de bilirrubina y hemoglobina. PRECISIÓN DEL TEST: a. Precisión Intraensayo La precisión intraensayo se determinó analizando 2 muestras de sueros, un positivo y un negativo, en 20 replicas. Especímenes Número de Veces Resultado (promedio) Desviación Estándar CV (%) Positivo Negativo 20 10,50 0,2 2,4% 20 2,50 0,1 3,6% b. Precisión Interensayo La precisión inter-ensayo se determinó analizando 1 muestra de suero positivo y 1 muestra de suero negativo en 20 pruebas diferentes.

19 18 Especímenes Número de Veces Resultado (promedio) Desviación Estándar CV (%) Positivo Negativo 20 10,7 0,1 1,0% 20 2,4 0,1 2,9% LIMITACIONES DE USO Lo test Imuno-ELISAanti-HBsAg de WAMA fue desarrollado para obtener la más alta sensibilidad y especificidad. Resultados repetidamente reactivos deben interpretarse con la información clínica del paciente con otro resultado de las pruebas de laboratorio. Ejemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no reactivo. Debido a la alta sensibilidad de la ELISA, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a diversas razones, muchos de los cuales están relacionados, pero no se limitan a paso de lavado inadecuado. La prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba. Algunos individuos tienen una fuerte respuesta inmune después de la vacunación. Las concentraciones de anticuerpos más allá del último punto de la curva de calibración se pueden diluirse y reexaminar. Sin embargo, tenga en cuenta que estas muestras pueden no tener características lineales después de la dilución. Lo mismo puede ocurrir si un calibrador de kit se diluye. La comparación de los resultados entre los kits de diferentes fabricantes, generalmente, dan resultados cuantitativos Sin embargo, algunas muestras pueden tener discrepancia en los resultados debido a diversidad de anticuerpos y las propiedades antigénicas de HBsAg usada en el ensayo. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS 1. Los reactivos deben conservarse entre 2-8 ºC. 2. La fecha de caducidad se refiere al último día del mes indicado en las etiquetas del frasco y de la caja del kit. 3. Evite la exposición de los reactivos a altas temperaturas y la luz solar directa. 4. No congele el reactivo, ya que esto puede causar daños irreversibles. 5. La Imuno-ELISA anti-hbsag (cuantitativo) de WAMA contiene materiales de origen humano, que se han ensayado, con resultados negativos para anti-vih anticuerpos I y II, antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg) (excepto en el suero de control positivo) y anti-hepatitis C (VHC). Como ninguna prueba puede ofrecer completa seguridad, en la ausencia de éstos y otros agentes infecciosos, se recomienda para el tratamiento de todos los reactivos como materiales potencialmente infecciosos, y tener el mismo cuidado en la eliminación de estos materiales. 6. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes. 7. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de iniciar los tests. 8. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión y cubiertos de forma inmediata después de su uso. 9. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo. 10. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación. 11. Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo para mantener las mismas condiciones del test. 12. No utilice el reactivo después de la fecha de caducidad. 13. Desechar el material siguiendo regulaciones locales. 14. Utilice las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en el almacenamiento, la manipulación y eliminación de los materiales. Marcador HBsAg Anti-HBsAg Anti-HBcAg Total HEPATITIS B - Interpretación de los marcadores Significado Es el primer marcador que aparece en la hepatitis B. Disminue en hasta 6 meses. Su presencia por más de 6 meses, indica hepatitis crónica. Su presencia indica la inmunidad al VHB. Presente después de la desaparición del HBsAg. Está presente por sí mismo en los individuos vacunados. Su presencia indica una infección reciente o anterior HBV. Necesita otros marcadores para caracterizar la fase de la enfermedad Anti-HBcAg IgM Indica una infección reciente. Se pueden encontrar hasta 32 semanas después de la infección. HBeAg Anti-HBeAg Es un marcador de replicación viral. Su presencia indica alta infectividad. En las cepas con mutación de pre-núcleo (no produce proteína "e") puede estar ausente, aunque la replicación viral continúa y, en consecuencia, su alta infectividad. Indica lo final de la etapa de replicación viral. Viene después de la desaparición de HBeAg.

20 19 HEPATITIS B - Interpretación de los resultados serológicos ** Interpretación No inmune Infección Reciente Inicio Convalecencia Inmune - Infección - Anterior Reciente HBsAg Anti-HBsAg Anti-HBcAg Total Anti-HBcAg IgM HBeAg Anti-HBeAg Inmune - Infección Inmune - Infección Previa Imune - uso de vacunas * * El anti-hbsag puede ser a niveles no detectables por pruebas serológicas de infección previa después de un largo tiempo. ** Atípicos perfiles serológicos se pueden encontrar en el curso de la infección por el VHB GARANTÍA WAMA Diagnóstica garantiza el cambio del kit de diagnóstico, siempre que estea dentro de la fecha de caducidad y que ha sido probado por su apoyo técnico que no hubo errores técnicos en la ejecución, la manipulación y el almacenamiento de este producto. WAMA y sus distribuidores no se responsabiliza por fallas en el rendimiento de los kits en estas condiciones. BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA 1. Specter, S.: Hepatitis B Vaccines. In: Specter, S. editor. Viral Hepatitis Diagnosis, Therapy, and Prevention. Human Press: , Fagan, E.A. and Harrison, T.J.: Hepatitis B (HBV) and Hepatitis D (HDV, delta) Viruses. In Viral Hepatitis. BIOS, United Kingdom, , Sunbul, M., Leblebicioglu, H., Esen, S., Eroglu, C., Barut, S.: Response to hepatitis B vaccine in HbsAg/anti-HBs negative and anti-hbs positive subjects. Scan J Infect, 32(3): 315-6, Baldy, J.L. et al.: Intradermal vaccination of adults with three low doses (2 µg) of recombinant hepatitis B vaccine. I. Seroconvertion rate and adverse effects. Mem Inst Oswaldo Cruz, 98 (8): , McMahon, B.J., Bruden, D.L., Petersen, K.M., Nainan, O., et al.: Antibody levels and protection after hepatitis B vaccination: results of a 15-year follow-up. Ann Intern Med, 142(5): , Lasemi, E., Haddadpour, N., Navi, F., Rakhshan, A., Rakhshan, V.: Rate of Acquired Immunity in Dental Students after Hepatitis B Vaccination. Dent Res J, 8(3): , Edição I: Rev. 06/2012