Anti-HIV Imuno-Elisa

Transcripción

1 BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA 1. Fagan, E.A. and Harrison, T.J.: Acquired Immunodeficiency Syndrome. Bios Scientific Publishers Limited, Brust, S., Duttmann, H. et al: Shortening of the diagnostic window with a new combined HIV p24 antigen and anti-hiv-1/2/o screening test. J Virol Meth, 90: , CDC. Revised guidelines for HIV counseling, testing, and referral. MMWR, 50 (No. RR-19): 1-62, Branson, B.M., Handsfield, H.H. et al: Revised Recommendations for HIV Testing of Adults, Adolescents, and Pregnant Women in Health-Care Settings. MMRW, 55 (RR14): 1-17, Yeom, J-S, Lee, J-B, Ryu, S-H et al: Evaluation of a New Third-Generation ELISA for the Detection of HIV Infection. Ann Clin Lab Science, 36: 73-78, Centers for Disease Control and Prevention. 09 Quality Assurance Standards for HIV Counseling, Testing, and Referral Data. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention; Craske, J.; Turner, A.; Abbott, R. et al.: Comparison of False-Positive Reactions in Direct-Binding Anti- HIV ELISA Using Cell Lysate or Recombinant Antigens. Vox Sanguinis, 59 (3): , 09. MS Imuno-Elisa Anti-HIV Kit de 3ª geração para determinação qualitativa de Anticorpos Contra o Vírus da Imunodeficiência Humana (Anti-HIV) 1 e 2 no soro ou plasma humano, por enzimaimunoensaio (ELISA). 3rd generation kit for the qualitative determination of antibodies against Human Immunodeficiency Virus (Anti-HIV) in human serum or plasma, by enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA). Kit de 3ª generación para determinación cualitativa de Anticuerpos Contra el Vírus de Inmunodeficiência Humaa (Anti-HIV 1 e 2 en suero o plasma humano, por enzimaimunoensaio (ELISA). R E F R E F 4296-E - 96 determinações / determinations / determinaciones E determinações / determinations / determinaciones WAMA Diagnóstica Rua Aldo Germano Klein, CEAT CEP São Carlos - SP - Brasi Fone / Fax SAC Edição I: Rev. 10/13

2 01 18 PORTUGUÊS IMPORTÂNCIA CLÍNICA A Síndrome da Imunodeficiência Humana é causada pelo vírus HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana), o qual foi determinado como agente etiológico nos anos 80 pelos trabalhos de Luc Montagnier, no Instituto Pasteur de Paris, e Robert Gallo, no Instituto Nacional do Câncer nos Estados Unidos. O HIV é um membro da família retroviridae, um tipo D de retrovírus que pertence à subfamília dos lentivirus. Incluídos nesta família estão os oncovírus HTLV-I e HTLV-II que primariamente induzem a formação de tumores. Há dois distintos tipos de HIV, o HIV-1 e o HIV-2. O HIV-1 está dividido dentro de 9 subtipos, Grupo M (subtipo A H), Grupo N e Grupo O, enquanto o HIV-2 está dividido dentro de 2 subtipos (Grupo A e B). O HIV-1 é composto de uma membrana lipídica, proteínas estruturais e glicoproteínas que se projetam. O genoma viral consiste de 3 importantes componentes estruturais: pol, gag e env. Eles codificam vários produtos: pol produz DNA polimerase e endonuclease, gag codifica p24, p17, p9 e p7, e env codifica gp41 e gp1. O HIV-2 tem um diferente envelope e ligeiramente diferentes proteínas core. As proteínas importantes no sorodiagnóstico do HIV são: para o HIV-1, a gp41 e gp160/1 do envelope (gene env) e a p24 do core (gene gag). Para o HIV-2, a gp34 e gp140 do envelope (gene env) e a p26 do core (gene gag). Os genes que codificam e os respectivos antígenos que podem induzir a produção de anticorpos após uma exposição ao vírus são: gene gag (antígenos p55, p24 e p17), gene pol (antígenos p66 e p51), gene sor (antígeno p24), gene env (antígeno gp160, gp1 e gp41) e gene 3'orf (p27). A homologia entre o HIV-1 e o HIV-2 é de 60% entre os genes gag e 30-40% entre os demais genes. O Imuno-ELISA HIV 1+ 2 da WAMA é um teste imunoenzimático de 3ª geração, tipo sanduiche, que utiliza proteínas recombinantes gp1, gp41 e gp36 do HIV para detectar a presença de anticorpos anti-hiv no soro ou plasma humano. PRINCÍPIO DO MÉTODO As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com proteínas recombinantes do vírus HIV (fase sólida), as quais correspondem à epítopes altamente antigênicas derivadas de proteínas do envelope e do core do HIV-1 e HIV-2. Quando anticorpos anti-hiv-1 e/ou anti-hiv-2 estão presentes na amostra de soro ou plasma, eles reagem com as proteínas da fase sólida. O material não ligado é removido por lavagem. Um conjugado de proteínas recombinantes do HIV, expressando as mesmas epítopes do antígeno fase sólida, marcado com peroxidase se ligará aos anticorpos anti-hiv imobilizados nas cavidades da placa. Um substrato (TMB) é adicionado, o qual revelará uma cor azul nas cavidades onde a enzima peroxidase estiver presente, indicando a presença de anticorpos anti-hiv. Uma solução stop ácida para bloqueio da reação enzimática é adicionada, a qual mudará a cor da solução para amarela. A absorbância é então medida e a concentração de anticorpos anti-hiv é diretamente proporcional a intensidade da cor da reação. APRESENTAÇÃO DO KIT R E F 4296-E - 96 determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com proteínas recombinantes do HIV 1 e 2 (12 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem - x concentrada (1 x 50 ml) 3. Conjugado de proteínas recombinantes do HIV 1 e 2 marcadas com peroxidase (1 x 10 ml) 4. Substrato Cromógeno Solução A (Peróxido de Hidrogênio) (1 x 6 ml) 5. Substrato Cromógeno Solução B (TMB) (1 x 6 ml) 6. Solução Stop (1 x 6 ml) 7. Soro Controle Negativo (1 x 1,0 ml) 8. Soro Controle Positivo 1 (1 x 1,0 ml) Ejemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no reactivo. Debido a la alta sensibilidad de la ELISA, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a diversas razones, muchos de los cuales están relacionados, pero no se limitan a paso de lavado inadecuado. 14 Cuando los factores de riesgo son bajos, una prueba de confirmación (Western Blot, NAT - Nucleic Acid Amplification Testing) debe realizarse para confirmar el diagnóstico. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir durante períodos de la llamada "ventana serológica", es decir, el tiempo entre la infección por VIH y la aparición de la concentración de anticuerpo que permite ser detectado por la prueba (seroconversión); general superiores a 8 semanas de infección. La prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS 1. Los reactivos deben conservarse entre 2 8 ºC. 2. La fecha de validez corresponde al último día del mes señalado en la etiqueta de los frascos y de la caja del kit 3. Se debe evitar exponer los reactivos a temperaturas elevadas, así como directamente al sol. 4. No congele cualquier reactivo, pues esto causará deterioro irreversible. 5. Lo Imuno-ELISA Anti-HIV 1+2 de WAMA contiene material de origen humano, que se pusieron a prueba con resultados negativos para anticuerpos anti-hiv I e II (excepto lo Suero Control Positivo), antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y anti-h. Debido a que ninguna prueba puede ofrecer completa seguridad, a falta de éstos y otros agentes infecciosos, se recomienda para el tratamiento de todos los reactivos como materiales potencialmente infecciosos, y tener el mismo cuidado en la eliminación de estos materiales. 6. Solución STOP contiene ácido sulfúrico (H2SO4) 1,0 M. Manipular con cuidado. Es corrosivo. En caso de contacto con la piel lavar abundantemente en agua corriente. 7. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes. 8. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente ( 25 ºC) antes de iniciar los tests 9. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión y cubiertos de forma inmediata después de su uso. 10. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo. 11. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación. 12. Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo para mantener las mismas condiciones del test. 13. No usar reactivos después de la fecha de validez. 14. Descartar el material conforme a las reglamentaciones locales. Seguir las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en la conservación, manipulación y descarte de los materiales. TÉRMINO DE GARANTÍA WAMA Diagnóstica garantiza el cambio de este conjunto diagnóstico, siempre y cuando esté dentro del plazo de validez y sea comprobado por su asesor técnico que no hubo fallas en la ejecución, manejo y conservación de este producto. WAMA y sus distribuidores no se responsabilizan por fallas en el kit bajo estas condiciones.

3 17 02 VALIDACIÓN DEL TEST: El test es válido si: La D.O. del "blank", que contiene solamiente los Sustrato Cromógeno A y B y Solución Stop, debe ser inferior a 0,080 a 450 nm. Lo valor de la D.O. de los controles negativos deben ser inferior a 0,100 a 450/630 nm o a 450 nm después de sustraer el "blank". Lo valor de la D.O. de los controles positivos deben ser igual o mayor a 0,800 a 450/630 nm o a 450 nm después de sustraer el "blank". INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Dividir lo valor de D.O. de la muestra de paciente por lo valor de Cut-off. Lo test es considerado: REACTIVO : valor igual o mayor que 1,1. DUDOSO (Borderline) : valor está entre 0,9 y 1,1. NO REACTIVO : valor menor que 0,9. ADVERTENCIA: ES SIEMPRE RECOMIENDADO REPETER LO TEST EN LAS MUESTRAS REACTIVAS. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TEST En un estudio de 500 muestras de suero y plasma obtenidas de un laboratorio de referencia y panel de suero comercial, de los cuales 104 eran positivos y 396 negativos se determinó la sensibilidad y la especificidad de lo kit Imuno-ELISA HIV 1+2 de WAMA. Sensibilidad = Verdaderos Positivos / (Verdaderos Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidad = Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos) x 100 Verdaderos Falsos Verdaderos Falsos Sensibilidad Especificidade Positivos Positivos Negativos Negativos RESULTADO ,75 PRECISIÓN DEL TEST a. Precisión Intraensayo La precisión intra-ensayo se determinó mediante el ensayo de 2 muestras de suero positivos, una alta y replica bajo, en replicas. Muestras Positivas Alta Baja Número de Veces Promedia de las Absorbancias 1,105 0,354 Desviación Estándar 0,051 0,018 4,8% 5,6% b. Precisión Interensayo La precisión inter-ensayo se determinó analizando 2 muestra de suero positivos en carreras diferentes. Muestras Positivas Positivo Negativo Número de Veces Promedia de las Absorbancias 1,112 0,367 Desviación Estándar 0,065 0,029 5,9% 8,6% LIMITACIONES DE USO La prueba Imuno-ELISA Anti HIV 1+2 de WAMA fue desarrollado para obtener la más alta sensibilidad y especificidad. Es de destacar también que los anticuerpos pueden ser indetectables en las etapas iniciales de la enfermedad y en algunos individuos inmunosuprimidos. Resultados repetidamente reactivos siempre se deben interpretar con información clínica del paciente y los resultados de otras pruebas de laboratorio. 9. Soro Controle Positivo 2 (1 x 1,0 ml) R E F E determinações 1. Microplacas com cavidades cobertas com proteínas recombinantes do HIV 1 e 2 (24 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem - x concentrada (2 x 50 ml) 3. Conjugado de proteínas recombinantes do HIV 1 e 2 marcadas com peroxidase (2 x 10ml) 4. Substrato Cromógeno Solução A (Peróxido de Hidrogênio) (2 x 6 ml) 5. Substrato Cromógeno Solução B (TMB) (2 x 6 ml) 6. Solução stop (2 x 6 ml) 7. Soro Controle Negativo (2 x 1,0 ml) 8. Soro Controle Positivo- 1 (2 x 1,0 ml) 9. Soro Controle Positivo- 2 (2 x 1,0 ml) 10. Instruções para uso PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES MICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a temperatura ambiente (-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-8 ºC. TAMPÃO DE LAVAGEM x concentrado (2): tampão salino-fosfato (PBS), ph 7,4 e tween- como detergente. Diluir o volume do concentrado completando para 1000 ml com água destilada ou deionizada. Se houver presença de cristais no tampão concentrado, eles devem ser dissolvidos a 37 ºC antes da diluição. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350 µl. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. CONJUGADO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DO HIV 1 E 2 MARCADAS COM PEROXIDASE (3): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO SOLUÇÃO A (PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO) (4): estabilizado e pronto para uso. Estável entre 2-8 C até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO SOLUÇÃO B (TMB) (5): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não carcinogênico. SOLUÇÃO STOP (6): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4) 1,0M. Manusear com cuidado. É corrosivo. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. SORO CONTROLE NEGATIVO (7): soro humano negativo para HIV. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. SORO CONTROLE POSITIVO-1 (8): soro humano inativado positivo para HIV 1. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Contém Proclim 300 a 0,05% como conservante.estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. SORO CONTROLE POSITIVO-2 (9): soro humano inativado positivo para HIV 2. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Contém ProClin 300 a 0,05% como conservante.estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2-8ºC). AMOSTRAS Usar amostra de soro ou plasma livre de hemólise, lipemia e contaminação. A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser mantidas no freezer a - ºC. Amostras congeladas devem ser homogeneizadas antes do teste. Evitar formação de espuma. Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos, pois isto pode causar falsos resultados.

4 03 16 MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO Micropipeta de 50 µl e 100 µl e ponteiras. Água destilada ou deionizada para diluição do tampão de lavagem. Agitador de microplaca. Incubador com temperatura de 37 ºC. Leitor de microplaca com filtro de 450 nm. Lavador de microplaca Papel absorvente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMENTO IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do blank deve ser desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm. 1. De acordo com o plano estabelecido da distribuição na placa, usar 3 cavidades para soro controle negativo (7), e 2 cavidades para o soro controle positivo, uma para o positivo-1 (HIV-1) (8) e uma para o positivo-2 (HIV-2) (9). Usar 1 cavidade para o blank, o qual conterá somente 50 µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno Solução B (5). 2. Dispensar 100 µl dos soros controles positivo e negativo (sem diluir) conforme o estabelecido no item 1. Dispensar 100 µl das amostras nas outras cavidades a serem testadas. Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, evitando com isso contaminação. 3. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 4. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar por 30 minutos a 37ºC. 5. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante, tendo o cuidado de evitar contaminação entre as cavidades. 6. Lavar a placa 5 vezes com a solução de lavagem diluída (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos). Aspirar o conteúdo da microplaca, dispensar 350 µl de solução de lavagem diluída em cada cavidade, aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 4 vezes este procedimento (total de 5 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática. ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do ensaio. 7. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo líquido residual. 8. Dispensar 100µl do conjugado em todas as cavidades, exceto no blank. 9. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 10. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37ºC por 30 minutos. 11. Repetir as etapas de 5 a Dispensar 50µl do substrato cromógeno (Solução A)(4) e 50µl do substrato cromógeno (Solução B)(5) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. Haverá o desenvolvimento da cor azul onde a enzima peroxidase estiver presente. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placas) por 30 segundos. 13. Incubar a 37ºC por 15 minutos, protegendo da luz. 14. Bloquear a reação dispensando 50 µl da solução stop em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. A cor da solução mudará para amarela. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 15. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o blank do substrato, dentro de 10 minutos. NOTA: recomenda-se usar um duplo comprimento de onda utilizando um filtro de referência de 630 nm quando disponível. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO 1. Pipetear 100 μl de los control negativo (7) (3 pocillos) y controles positivo-1 (8) y positivo-2 (9) en la microplaca. Pipetear 100 μl de la muestra en otros pocillos. 2. Homogeneizar por 30 segundos y incubar a 37 C por 30 minutos. 3. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante y enjuague 5 vezes con solución de lavado (2). 4. Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido. 5. Dispensar 100μl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank.. 6. Homogeneizar por 30 segundos y incubar a 37 C por 30 minutos. 7. Repetir los passos 3 y Dispensar 50μl del sustrato cromógeno Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (5) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank (debese contener solamiente estes reactivos). El color de la solución se volverá azul donde sea detectada la presencia de peroxidasa. 9. Homogeneizar por 30 segundos y incubar, en la oscuridad, a a 37 C por 15 minutos. 10. Pipetear 50μl de la Solución Stop (6) en cada pocillo de la microplaca. El color de la solución se volverá amarillo. 11. Homogeneizar por 30 segundos. 12. Leer la D.O. en un lector de microplacas con filtro de 450 nm, contra el blank, o en duplo comprimiento de onda (450/630nm), dentro de 10 minutos. A B C D E F G H EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA 1 Blank Neg. Coltrol Neg. Control Neg. Control Pos. Control Pos. Control A1 A2 2 A3 A4 A5 A6 A CÁLCULOS DE LOS RESULTADOS Determinar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene restando de la lectura de la D.O. el valor del blank. Si dupla longitud de onda dual se utiliza, lo "blanco" se omite, y por lo tanto las lecturas de D.Os. se utilizan sin sustracción. Si más de una placa que se utiliza debe ser considerado por separado para el cálculo y la interpretación de los resultados. Determinar el valor del Cut-off: Cut-off = promedio de la D.O. de los Controles Negativos + 0,12 Atención: Si el valor de D.O. en uno de los controles negativos no atender la pista del control especificado para validar el ensayo, la D.O. de este control debe ser desechada. Si más de un control negativo no pasó, la prueba debe considerarse inválida y deberá repetirse. Ejemplo: Valor de las D.Os. de los Controles Negativos = 0,055 0,125 0,057 Entonces, D.O. de 0,125 deve ser desechada y la promedia de D.O. de los controles negativos es (0, ,057)/2 = 0,056 Entonces, Cut-off = 0, ,12 = 0,176

5 15 04 Agitador de microplaca. Incubadora con una temperatura de 37 º C Lector de microplaca con filtro de 450 nm Lavador de microplaca Papel absorbente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMIENTO IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm. 1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, usar 3 pocillos para el suero control negativo (7) y 2 pocillos para el suero control positivo, una para o positivo-1 (VIH-1) (8) y una para o positivo-2 (VIH-2) (9). Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá solamente 50μl delsustrato cromógeno Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (5). 2. Dispensar 100μl de los sueros controles positivo y negativo (sin diluir) conforme a lo establecido en el ítem 1. Dispensar 100μl de las muestras en los otros pocillos que serán testeados. Usar puntas de pipeta individuales para cada pipeteo, evitando la contaminación. 3. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 4. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37 ºC por 30 minutos. 5. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante, teniendo cuidado de evitar la contaminación entre pocillos. 6. Lavar la placa 5 vezes con la solución de lavado diluida (2) (ver Preparación y Estabilidad de los Reactivos). Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado diluida en cada pocillo, esperar 30 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 4 veces este procedimiento (total de 5 ciclos). Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática o manual. ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los procedimientos de lavado sean adecuados. 7. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar cualquier residuo líquido. 8. Dispensar 100μl del conjugado en todos los pocillos, excepto el blank. 9. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 10. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37 ºC por 30 minutos. 11. Repetir los pasos 5 al Dispensar 50μl del sustrato cromógeno (Solución A) (4) y 50μl del sustrato cromógeno (Solución B) (5) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. Aparecerá un color azul donde esté presente la enzima peroxidasa. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 13. Incubar a 37 C por 15 minutos, protegerlo de la luz. 14. Bloquear la reacción dispensando 50μl de la solución Stop en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. La solución se tornará amarilla. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 15. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, en un plazo de 10 minutos. NOTA: Se recomienda mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia de 630 nm cuando disponible. IMPORTANTE: El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a lecturas inexactas o absorbancias falsamente elevadas. Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio. El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos. IMPORTANTE: O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas. A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada. O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30minutos. RESUMO DO PROCEDIMENTO 1. Pipetar 100 µl dos controles negativos (7) (3 cavidades) e controles positivo-1 (8) e positivo-2 (9) na microplaca. Pipetar 100 µl da amostra nas outras cavidades. 2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37 C por 30 minutos. 3. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante e lavar 5 vezes com solução de lavagem (2). 4. Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual. 5. Pipetar 100 µl do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto blank. 6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37 C por 30 minutos. 7. Repetir as etapas 3 e Pipetar 50 µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno Solução B (5) em cada cavidade da placa, inclusive no blank (deverá conter somente estes reativos). A cor da solução fica azul onde houver peroxidase. 9. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar no escuro a 37 C por 15 minutos. 10. Pipetar 50 µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca. A cor da solução ficará amarela. 11. Homogeneizar por 30 segundos. 12. Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank, ou um duplo comprimento de onda (450/630 nm), dentro de 10 minutos. A B C D E F G H EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA 1 Blank Controle Neg. Controle Neg. Controle Neg. Controle Pos. Controle Pos. A1 A2 2 A3 A4 A5 A6 A CÁLCULOS DOS RESULTADOS Determinar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo da leitura da D.O. do blank. Se duplo comprimento de onda é usado o blank é omitido e, portanto, as leituras das D.Os. são usadas sem subtração. Se mais do que uma microplaca é usada elas deveriam ser consideradas separadamente para cálculos e interpretação dos resultados. Determinar o valor do Cut-off: Cut-off = média da D.O. dos Controles Negativos + 0,12 Atenção: Se o valor da D.O. de um dos controles negativos não atender a faixa controle especificada para validação do teste, a D.O. deste controle deve ser descartada. Se mais do que um controle negativo não atender, o teste deve ser considerado inválido e deve ser repetido.

6 05 14 Exemplo: Valor das D.Os. dos Controles Negativos = 0,055 0,125 0,057 Então, D.O. de 0,125 deve ser descartada e a média da D.O. dos controles negativos é (0, ,057)/2 = 0,056 Portanto, Cut-off = 0, ,12 = 0,176 VALIDAÇÃO DO TESTE: O teste é válido se: A D.O. do blank, que contém somente Substrato Cromógeno A e B e Solução Stop, deve ser menor do que 0,080 a 450 nm. O valor da D.O. dos controles negativos deve ser menor do que 0,100 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank. O valor da D.O. dos controles positivos deve ser igual ou maior do que 0,800 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Dividir o valor da D.O. da amostra do paciente pelo valor do Cut-off. O teste é considerado: REAGENTE : se valor igual ou maior do que 1,1. DUVIDOSO (Borderline) : se valor entre 0,9 e 1,1. NÃO REAGENTE : se valor menor do que 0,9. ATENÇÃO: É SEMPRE RECOMENDADO REPETIR O TESTE NAS AMOSTRAS REAGENTES SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE Em um estudo realizado com 500 amostras de soro e plasma obtidas de um Laboratório de referência e painel de soro comercial, das quais 104 eram positivas e 396 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit Imuno-ELISA Anti HIV 1+2 da WAMA. Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100 Verdadeiros Positivos RESULTADO 104 Falsos Verdadeiros Falsos Sensibilidade Especificidade Positivos Negativos Negativos ,75 PRECISÃO DO TESTE a. Precisão Intra-Ensaio A precisão intra-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros positivos, uma alta e outra baixa, em replicatas. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 1,105 0,354 Desvio Padrão 0,051 0,018 4,8% 5,6% b. Precisão Inter-Ensaio A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 2 pools de soros positivos em diferentes corridas. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 1,112 0,367 Desvio Padrão 0,065 0,029 5,9% 8,6% 6. Solución Stop (2 x 6 ml) 7. Suero Control Negativo (2 x 1,0 ml) 8. Suero Control Positivo- 1 (2 x 1,0 ml) 9. Suero Control Positivo- 2 (2 x 1,0 ml) 10. Instrucciones de uso PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS MICROPLACA (1): Retirar del envelope la cantidad de tiras que se utilizarán y dejar que alcancen la temperatura ambiente (-25 ºC). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con disecante, y deben mantenerse entre 2-8 ºC. SOLUCIÓN DE LAVADO X concentrado (2): tampão salino-fosfato (PBS), ph 7,4, conteniendo Tween como detergentep. Diluir el volumen del concentrado completando 1000 ml con agua destilada o desionizada. Si hay cristales en el tampón concentrado, deben disolverse a 37 C antes de la dilución.durante cada ciclo de lavado, cada pocillo debe completarse con, aproximadamente, 350μl de tampón diluido. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25ºC) antes de usar. CONJUGADO DE PROTEINAS RECOMBINANTES DE LO VIH 1 Y 2 MARCADOS CON PEROXIDASE (3): Listo para usar. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar SUBSTRATO CROMÓGENO SOLUCIÓN A (PERÓXIDO DE HIDRÓGÊNO) (4): estabilizado y listo para usar Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar SUSTRATO CROMÓGENO SOLUCIÓN B (TMB) (5): solución estabilizada de tetrametilbenzidina Listo para usar. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar La TMB no es ni mutagénica ni carcinogénica. SOLUCIÓN STOP (6): listo para usar. Contiene ácido sulfúrico (H2SO4) 1,0 M. Manosear con cuidado. Es corrosivo. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar Estable hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. SUERO CONTROL NEGATIVO (7): suero humano negativo para VIH. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. SUERO CONTROLE POSITIVO-1 (8): suero humano inactivado positivo para VIH 1. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Contiene Proclim 300 a 0,05% como conservante. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. SUERO CONTROL POSITIVO-2(9): suero humano inactivado positivo para VIH 2. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Contiene Proclim 300 a 0,05% como conservante. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la fecha de vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2-8ºC). MUESTRAS Usar muestras de suero libres de hemólisis, lipemia y contaminación. Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2-8 ºC, por 48 horas. Durante un período mayor, deben guardarse en freezer a - ºC. Las muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del test. Evite la formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados falsos. MATERIAL NECESARIO, NO SUMINISTRADO Micropipeta de 50 µl y 100 µl y puntas de pipeta. Agua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado.

7 13 06 induce la formación de tumores. Hay dos tipos distintos de VIH, el VIH-1 y VIH-2. VIH-1 se divide en 9 subtipos, Grupo M (subtipo A - H), Grupo N y Grupo O, mientras que el VIH-2 se divide en dos subtipos (Grupo A y B). VIH-1 se compone de una membrana de lípidos, proteínas estructurales y glicoproteínas que sobresalen. El genoma viral consiste de tres componentes estructurales principales: pol, gag y env. Ellos codifican productos diversos: pol produce ADN polimerasa y endonucleasa, gag codifica p24, p17, p9 y p7, y env codifica gp41 y gp1. VIH-2 tiene una envoltura diferente y ligeramente diferentes proteínas del core. Las proteínas importantes en el diagnóstico serológico de VIH son: para VIH-1, la gp41 y gp160/1 del envoltura (gen env) y p24 del locore (gen gag). Para el VIH-2, la gp34 y gp140 de la envoltura (gen env) y p26 de lo core (gen gag). Lo genes que codifican y sus respectivos antígenos que puede inducir la producción de anticuerpos después de la exposición al virus incluyen:gag (antígenos p55, p24 y p17), gen pol (antígenos p66 y p51), gen sor (antígeno p24), gen env (antígeno gp160, gp1 y gp41) y gene 3'orf (p27). La homología entre VIH-1 y VIH-2 son 60% entre los genes gag y 30-40% entre otros genes. El Imuno-ELISA Anti HIV 1+2 de WAMA es un test imunoenzimático de tercera generación que utiliza proteínas recombinantes gp1, gp41 y gp36 de lo HIV para detectar la presencia de anticuerpos anti-hiv en suero o plasma humano. PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos de la placa de microtitulación se recubren con proteínas recombinantes del core del virus VIH (fase sólida), que corresponden a epítopos altamente antigénicas derivadas de proteínas de la envoltura y el núcleo de VIH-1 y VIH-2. Cuando anticuerpos anti-vih-1 y / o VIH-2 están presentes en el suero o plasma, que reaccionan con las proteínas de la fase sólida. El material no ligado se elimina mediante lavado. Un conjugado de proteínas recombinantes del VIH, que expresan el mismo antígeno apítopos fase sólida, marcado com peroxidase se unen a anticuerpos anti-vih inmovilizadasen los pocillos de la placa. Un substrato (TMB) es adicionado, el cual revelará un color azul en los pocillos donde la enzima peroxidasa esté presente, indicando la existencia del anticuerpo anti-hiv. Una solución stop ácida de bloquear la reacción enzimática se añade, que cambiará el color de la solución a amarillo. La absorbancia se entonces es medida y la concentración de anticuerpos anti-h es directamente proporcional a la intensidad del color de la reacción. PRESENTACIÓN DEL KIT R E F 4296-E - 96 determinaciones 1. Microplaca con pocillos recubiertos con proteínas recombinantes de VIH 1 y 2 (12 tiras extraíbles, con 8 pocillos c/u) 2. Solución de lavado - x concentrada (1 x 50 ml)3. Conjugado de proteinas recombinantes de lo VIH 1 y 2 marcados con peroxidase (1x10 ml) 4. Sustrato Cromógeno Solución A (Peróxido de Hidrógeno) (1 x 6 ml) 5. Sustrato Cromógeno Solución B (TMB) (1 x 6 ml) 6. Solución Stop (1 x 6 ml) 7. Suero Control Negativo (1 x 1,0 ml) 8. Suero Control Positivo - 1 (1 x 1,0 ml) 9. Suero Control Positivo 2 (1 x 1,0 ml) 10. Instrucciones de uso R E F E determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con proteínas recombinantes de lo VIH 1 y 2 (24 tiras extraíbles, con 8 pocillos c/u). 2. Solución de lavado - x concentrada (2 x 50 ml) 3. Conjugado de proteinas recombinantes de lo VIH 1 y 2 marcados con peroxidase (2x10 ml) 4. Sustrato Cromógeno Solución A (Peróxido de Hidrógeno) (2 x 6 ml) 5. Sustrato Cromógeno Solución B (TMB) (2 x 6 ml) LIMITAÇÕES DE USO O teste Imuno-ELISA Anti HIV 1+2 da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade e especificidade. Ressalta-se também que os anticorpos podem ser indetectáveis nos estágios iniciais da doença e em alguns indivíduos imunossuprimidos. Resultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as informações clínicas do paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais. Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não reagentes. Devido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados positivos podem ocorrer devido a várias razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem. Quando os fatores de risco forem baixos um teste confirmatório (Western Blot, NAT Nucleic Acid Amplification Testing) deve ser realizado para confirmação diagnóstica. Podem ocorrer falsos resultados negativos nos períodos da chamada janela sorológica, ou seja, período entre a contaminação pelo HIV e o surgimento de anticorpos em concentração que permita ser detectado pelo teste (soroconversão); geralmente acima de 8 semanas do contágio. A prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste. PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS 1. Os reagentes devem ser conservados entre 2 8 ºC. 2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit. 3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol. 4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível. 5. O Imuno-ELISA anti-hiv 1+2 da WAMA contém materiais de origem humana, os quais foram testados, com resultados negativos para anticorpos anti-hiv 1 e 2 (exceto o Soro Controle Positivo), antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) e anti-h. Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa segurança, na ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar todos os reagentes como materiais potencialmente infecciosos, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais. 6. Solução STOP contém ácido sulfúrico (H2SO4) 1,0 M. Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. 7. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes. 8. Deixar os reagentes adquirirem a temperatura ambiente ( 25 ºC) antes de iniciar os testes. 9. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso. 10. Não deixar os cavidades da microplaca secar durante o ensaio. 11. Evitar repetidas pipetagens dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação. 12. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as mesmas condições do teste. 13. Não usar reagentes após a data de validade. 14. Descartar o material conforme regulamentações locais. 15. Utilizar a Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais. TERMO DE GARANTIA A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições.

8 07 12 ENGLISH SUMMARY The Human Immunodeficiency Syndrome is caused by HIV (Human Immunodeficiency Virus), which was determined as the etiologic agent in the 80s by the work of Luc Montagnier, in the Pasteur Institute in Paris, and Robert Gallo, in the National Cancer Institute in the United States. The HIV is a member of the retroviridae family, a type D retrovirus that belongs to the lentiviruses subfamily. Included in this family are the oncovirus HTLV-I and HTLV-II that primarily induce the formation of tumors. There are two distinct types of HIV, HIV-1 and HIV-2. The HIV-1 is divided into 9 subtypes, Group M (subtype A - H), Group N and Group O, while HIV-2 is divided into 2 subtypes (Group A and B). HIV-1 is made of a lipid membrane, structural proteins and glycoproteins that protrudes from the outer surface. The viral genome consists of 3 major structural components: pol, gag e env. They encode several products: pol produces DNA polymerase and endonuclease, gag encodes p24, q17, p9 and p7, and env encodes gp41 and gp1. HIV-2 has a different envelope and slightly different core proteins. The proteins important in sero-diagnosis of HIV are: for HIV-1, the gp41 and gp160/1 from the envelope (env gene) and p24 from the core(gag gene). For the HIV-2, gp34 and gp140 from the envelope (env gene) and p26 from the core (gag gene). The genes that encode and their respective antigens that may induce the production of antibodies after exposure to the virus are: gag gene (antigens p55, p24 and p17), pol gene (antigens p66 and p51), sorgene (antigen p24), env gene (antigen gp160, gp1 and gp41) and gene 3 'orf (p27). The homology between HIV-1 and HIV-2 is 60% between the gag and 30-40% of remaining genes. The Imuno-ELISA Anti HIV 1+2 from WAMA is a 3rd generation enzyme immunoassay test, sandwich type, that uses HIV recombinant proteins gp1, gp41 and gp36 to detect the presence of anti-hiv antibodies in the serum or plasma. PRINCIPLE OF THE METHOD The wells of microtiter late are coated with HIV virus recombinant proteins (solid phase), which correspond to epitopes highly antigenic derived from envelope and core proteins of HIV-1 and HIV-2. When anti-hiv-1 and/or anti-hiv-2 antibodies are present in the serum or plasma sample, they react with the proteins from the solid phase. Material not bound is removed by washing. A conjugate of recombinant proteins of HIV, expressing the same epitopes of antigen of solid phase, marked with peroxidase that will bind to anti-hiv antibodies immobilized in the wells of the plate. A substrate (TMB) is added, which will reveal a blue coloration on the cavities when the peroxidase enzyme is present, indicating the presence of the anti-h antibodies. An acidic stop solution to block the enzymatic reaction is added, which will change the color of the solution to yellow. The absorbance is then measured and the concentration of anti-hiv antibodies is directly proportional to the intensity of the reaction color. APRESENTAÇÃO DO KIT R E F 4296-E - 96 determinations 1. Microplate with wells covered with recombinant proteins of HIV 1 and 2 (12 removable strips with 8 cavities each) 2. Wash Solution concentrated x (1 x 50 ml) 3. Conjugate of HIV 1 and 2 recombinant proteins marked with peroxidase (1 x 10 ml) 4. Chromogen Substrate Solution A (Hydrogen Peroxide) (1 x 6 ml) 5. Chromogen Substrate Solution B (TMB) (1 x 6 ml) 6. Stop Solution (1 x 6 ml) 7. Negative Serum Control (1 x 1 ml) 8. Positive Serum Control - 1 (1 x 1.0 ml) 9. Positive Serum Control - 2 (1 x 1.0 ml) 10. Instructions for use sensitivity and specificity. Also note that that the antibodies may be undetectable in the initial stages of the disease and in some immunosuppressed individuals. Results repeatedly reactives must always be interpreted with the clinical information of the patient and with other laboratory test results. Reactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive. Due to the high sensitivity of ELISA tests, false positive results may occur due to various reasons, many of which are related, but not limited to, improper washing step. When the risk factors are low a confirmatory test (Western Blot, NAT - Nucleic Acid Amplification Testing) must be performed for diagnostic confirmation. There may be false negative results in the periods of so-called "serological window", i.e. period between HIV infection and the appearance of antibodies in concentrations that can be detected by the test (seroconversion); usually over 8 weeks of infection. The prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test. PRECAUTIONS AND WARNINGS 1. The reagents should be kept between 2-8 ºC. 2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box. 3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight. 4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage. 5. The Imuno-ELISA anti-hiv 1+2 from WAMA contains materials of human origin, which have been tested, with negative results for anti-hiv I and 2 antibodies (except the Positive Serum Control), Hepatitis B surface antigen (HBsAg) and anti-h. However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to deal with all the reagents as potentially infectious materials, as well as having the disposing these materials. 6. Stop Solution contains 1.0 M Sulfuric Acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive. On skin contact, immediately flush with large amounts of water. 7. Do not use reagents or microplates fof different batches. 8. Allow the reagents to reach the room temperature ( -25ºC) before starting the test. 9. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use. 10. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test. 11. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination. 12. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the same test conditions. 13. Do not use the reagent after the expiration date. 14. Discard the material following local regulations. 15. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials. WARRANTY WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions. ESPAÑOL IMPORTANCIA CLÍNICA El Síndrome de Inmunodeficiencia Humana es causada por el VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana), que se determinó como agente etiológico en los años 80 por trabajos de Luc Montagnier en el Instituto Pasteur de París y Robert Gallo en el Instituto Nacional del Cáncer en los Estados Unidos. El VIH es un miembro de la familia Retroviridae, un retrovirus de tipo D que pertenece a la subfamilia de los lentivirus. Se incluyen en esta familia los oncovirus HTLV-I y HTLV-II que principalmente

9 11 08 ( ) /2 = Therefore, Cut-off = = TEST VALIDATION: The test is valid if: The O.D. of the blank,which contains only Substrate Chromogen A and B and the Stop Solution, must be less than at 450 nm. The O.D. value of the negative controls must be less than at 450/630 nm or at 450 nm after subracting the blank. The O.D. value of the positive controls must be equal or greater than at 450/630 nm or at 450 nm after subtracting the blank. INTERPRETATION OF THE RESULTS Divide the OD value of the patient sample by the Cut-off value. The test is considered: REACTIVE : if the value is equal or greater than.1. INDETERMINATE (Borderline) : if value is between and 1.1. NOT REACTIVE : if value is less than 0.9. WARNING: IT IS ALWAYS RECOMMENDED REPEAT THE TEST IN THE REACTIVE SAMPLES SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE TEST In a study conducted with 500 samples of serum and plasma obtained from a reference laboratory and a panel of commercial serum, of which 104 were positive and 396 negative, the sensitivity and specificity were determined for the Imuno-ELISA Anti HIV 1+2 from WAMA. Sensitivity = True Positive / (True Positive + False Negative) x 100 Specificity = True Negative / (True Negative + False Positive ) x 100 True Positives RESULTS 104 False True Falses Sensitivity Especificity Positives Negatives Negatives ,75 PRECISION OF THE TEST: a. Intra-Assay Precision The intra-assay precision was determined by assaying 2 samples of positive sera, one high and one low in replicates. Positive Samples High Low Number of times Average of Absorbances 1,105 0,354 Deviation Standard 0,051 0,018 4,8% 5,6% b. Inter-Assay Precision The inter-assay precision was determined by assaying 2 pools of positive serum in different runs. Positive Samples High Low Number of times Average of Absorbances 1,112 0,367 Deviation Standard 0,065 0,029 5,9% 8,6% LIMITATIONS OF USE The test Imuno-ELISA Anti HIV 1+2 from WAMA was developed to obtain the highest R E F E determinations 1. Microplate2 with wells covered with recombinant proteins of HIV 1 and 2 (24 removable strips with 8 cavities each) 2. Wash Solution concentrated x (2 x 50 ml) 3. Conjugate of HIV 1 and 2 recombinant proteins marked with peroxidase (2 x 10ml) 4. Chromogen Substrate Solution A (Hydrogen Peroxide) (2 x 6 ml) 5. Chromogen Substrate Solution B (TMB) (2 x 6 ml) 6. Stop Solution (2 x 6 ml) 7. Negative Serum Control (2 x 1 ml) 8. Positive Serum Control - 1 (2 x 1.0 ml) 9. Positive Serum Control - 2 (2 x 1.0 ml) 10. Instructions for use REAGENT PREPARATION AND STABILITY MICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach room temperature ( 25 C). The strips that will not be used must be returned to the sealing envelope, with desiccant, and kept at 2 8 C. WASH SOLUTION (x Concentrated) (2): Phosphate buffered Saline (PBS), ph 7.4, containing Tween as detergent. Dilute the volume of the concentrate, filling it to 1000 ml with distilled or deionized water. If crystals are formed in the concentrated diluent, they must be dissolved at 37 C before the dilution is made. During each wash cycle, each cavity should be supplemented with approximately 350uL. Let it reach room temperature (-25 C) before using. CONJUGATE OF HIV 1 AND 2 RECOMBINANT PROTEINS MARKED WITH PEROXIDASE (3): ready to use. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. CHROMOGEN SUBSTRATE SOLUTION A (HYDROGEN PEROXIDE) (4): stabilized and ready for use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. CHROMOGEN SUBSTRATE SOLUTION B (TMB) (5): solution stabilized with Tetramethyl Benzidine. Ready to use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. The TMB is not mutagenic and not carcinogenic. STOP SOLUTION (6): ready to use. Contains sulfuric acid (H2SO4) 1.0 M. Handle with care. Corrosive. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle. NEGATIVE SERUM CONTROL (7): negative human serum for HIV. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. POSITIVE SERUM CONTROL-1 (8): positive human serum inactivated for HIV 1. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Contains Proclim 300 at 0,05% as preservative. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. POSITIVE SERUM CONTROL-2 (9): positive human serum inactivated for HIV 2. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Contains ProClin 300 at 0,05% as preservative. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Note.: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration date described on the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 C). SPECIMENS Use serum or plasma specimens not hemolysed, lipemic or contaminated. The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 C for 48 hours. For long-term storage, serum or plasma must be kept in the freezer at ºC. Frozen specimens must be homogenized before testing. Avoid making foam. Avoid repeated freezing and thawing as this may lead to false results.

10 09 10 MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED Micropipette of 50 µl and 100 µl and tips. Distilled and deionized water for the dilution of the wash solution. Microplate shaker. Incubator at 37 C. Microplate reader with 450nm filter. Microplate Washer Absorbent paper. Container for material disposal PROCEDURE IMPORTANT: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. In this condition, the use of "blank" should be disregarded, since it should be used only when using a 450 nm single filter. 1. In accordance with the plan established plan for the plate distribution, use 3 wells for the serum negative control (7) and 2 wells for the positive serum control, one for the positive-1 (HIV-1) (8) and one for the positive-2 (HIV-2) (9). Use one cavity well for the blank, which will only have 50µl of the chromogen substrate solution A (4), and 50µl of chromogen substrate solution B (5). 2. Pipette 100µl of the positive and negative serum control (without diluting them) as instructed in step 1. Pipete 100µl of the samples to be tested into the other microplate wells. Use individual tips for each sample, to avoid contamination. 3. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or use a microtiter plate shaker. 4. Cover the plate with adhesive sheet and incubate at 37 C for 30 minutes. 5. Discard the contents of the plate into a container with disinfecting solution carefully, to avoid contamination between the cavities. 6. Wash the plate 5 times with diluted Wash Solution (2) (see Preparation and Stability of Reagents). Aspirate the contents of the plate, dispense 350µl of diluted Wash Solution in each well, wait 30 seconds, and empty the contents of the wells. Repeat this procedure 4 times (total of 5 cycles). We recommend using a microplate washer (manual or automatic). WARNING: The correct washing procedure is essential for good performance of the test. 7. After the last wash, turn the plate over and tap it dry on absorbent paper to remove any residual liquid. 8. Pipete 100µl of the conjugate in all the cavity wells, except on the blank. 9. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or use a microtiter plate shaker. 10. Cover the plate with adhesive sheet and incubate at 37 C for 30 minutes. 11. Repeat the steps 5 to Pipette 50µl of chromogen substrate (Solution A) (4) and 50µl of chromogen substrate (Solution B) (5) in each well of the microplate, including the blank. A blue color will develop wherever the peroxidase enzyme is present. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 13. Incubate at 37 C for 15 minutes, protecting from light. 14. Block the reaction by dispensing 50µl of Stop Solution (6) in each well of the microplate, including the blank. The solution will change the color to yellow. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 15. Read the absorbance (O.D.) in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank of the substrate, within 10 minutes. NOTE: it is recommended to use a dual wavelength using a reference filter of 630 nm when available. IMPORTANT: The wash procedure is critical for the performance of the test. Insufficient washing will result in inaccurate readings or falsely elevated absorbance. Performing the tests in duplicate, though not required, is recommended. The pipetting time for the specimens and controls should not exceed 30 minutes. SUMMARY OF THE PROCEDURE 1. Pipette 100 µl of negative controls (7) (3 wells) and serum controls positive-1 (8) and positive-2 (9) in the microplate. Pipette 100 µl of the sample in other cavities. 2. Mix for 30 seconds and incubated at 37 C for 30 minutes. 3. Discard the contents of the microplate within a container containing disinfectant solution and wash 5 times with wash solution (2). 4. Completely discard the contents of the last wash, removing any residual liquid. 5. Pipette 100µl of enzyme conjugate (3) in each well of the plate, except blank. 6. Mix for 30 seconds and incubated at 37 C for 30 minutes. 7. Repeat the steps 3 and Pipette 50µl of Chromogen Substrate - Solution A (4) and 50µl of Chromogen Substrate - Solution B (5) in each well of the plate, including the blank (which should contain only these reagents). The color of the solution turns blue wherever there is peroxidase. 9. Mix for 30 seconds and incubated in the dark at 37 C for 15 minutes. 10. Pipette 50µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate. The color of the solution will turn yellow. 11. Mix for 30 seconds. 12. Read the OD in a microplate reader with a 450 nm filter against the blank, or in a double wavelength (450/630 nm), within 10 minutes. A B C D E F G H EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM OF MICROPILATE 1 Blank Neg. Coltrol Neg. Control Neg. Control Pos. Control Pos. Control A1 A2 2 A3 A4 A5 A6 A CALCULATION OF RESULTS Determine the optical density (OD) for each test and control serum. whose the final value is obtained by subtracting the blank from the OD. If double wavelength is used, the blank is ommited, therefore, the the O.D readings are used without subtracting. If more than one microplate is used they should be considered separately for calculation and interpretation of results. Determine the Cut-off value: Cut-off = average OD of Negative Control Warning: If the value of OD one of negative controls does not fall within the control range specified in the test validation, the OD of this this control should be discarded. If more than one negative control does not meet the specification, the test should be considered invalid and must be repeated. Example: OD value of the of negative controls = Then, the OD of must be discarded and the average of OD of negative controls is