Investigador Principal: Carlos Alberto Parra López M.D. Ph.D. Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina. Co-Investigadores:

Transcripción

1 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neoadyuvante en pacientes con cáncer de mama Investigador Principal: Carlos Alberto Parra López M.D. Ph.D. Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Co-Investigadores: David Andrés Bernal Estévez M.D. Ph.D. (c) Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Rafael Tejada Cabrera M.D. Internista Oncólogo Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Hospital El Tunal Servicio Oncología Ramiro Sánchez R. M.D. Mastólogo Oncólogo Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Director Clínica del Seno - Bogotá UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA BOGOTA

2 TABLA DE CONTENIDOS LISTA DE ABREVIATURAS... 3 PALABRAS CLAVE:... 5 TEMATICA:... 5 RESUMEN EJECUTIVO... 5 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA... 6 JUSTIFICACION... 7 OBJETIVOS... 8 MARCO DE REFERENCIA... 9 Quimioterapia neo-adyuvante... 9 Activación del sistema inmune durante la terapia neo-adyuvante Inmunoterapia y autoinmunidad en cáncer Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) Antígenos Asociados a Tumor (TAAs) Diversidad del repertorio del receptor de células T (TCR) Importancia de la frecuencia de precursores de LT en cáncer METODOLOGIA PROPUESTA GRUPOS DE ESTUDIO: Criterios de inclusión y exclusión Metodología detallada utilizada para alcanzar cada uno de los objetivos específicos: CONSIDERACIONES ÉTICAS Y AMBIENTALES PROCEDIMIENTO PARA LA TOMA DEL CONSENTIMIENTO INFORMADO IDENTIFICACION DE LA POBLACION Y/O AREA TERRITORIAL BENEFICIADA PRODUCTOS DEL PROYECTO POSIBLES RIESGOS Y DIFICULTADES IMPACTOS CRONOGRAMA PRESUPUESTO GLOBAL ANÁLISIS SITUACIONAL DE LA TEMÁTICA DEL PROYECTO BIBLIOGRAFIA ANEXOS Página 2 de 43

3 LISTA DE ABREVIATURAS APC Célula presentadora de antígeno AINEs Anti-inflamatorios no esteroideos ANAs Anticuerpos anti-nucleares BFA Brefeldina A CD Cluster de diferenciación CF Citometría de flujo CRT Calreticulina CTA Cancer testis antigens CTL Linfocitos T citotóxicos DC Célula dendrítica DMSO Dimetil sulfóxido FITC Isotiocianato de fluoresceína GM-CSF Factor estimulante de colonia granulocito macrófago HLA Antígeno leucocitario humano HMGB1 High mobility group box 1 HSP Proteína de choque térmico IDO indolamina 2,3-dioxigenasa IFN-γ Interferón gamma IL Interleuquina LT Linfocito T LT-CD4+ Linfocito T CD4+ LT-CD8+ Linfocito T CD8+ M-CSF Factor estimulador de colonia de monocitos Melan-A Antígeno de diferenciación de melanocitos Melan-A/MART MHC Complejo Mayor de Histocompatibilidad NF-κβ Factor Nuclear Kappa beta NK Linfocitos asesinos naturales NLR Receptor tipo NOD PBMC del inglés Peripheral Blood Mononuclear Cells (Células mononucleares de sangre periférica) PCR-SSP PCR con iniciadores específicos de secuencias PE Ficoeritrina pmhc Complejo MHC - péptido SEB Superantígeno de staphylococcus sp. SFB Suero fetal bovino STAT-3 Signal Transducer and Activator of Transcription-3 TAAs del inglés Tumor Associated Antigens (Antígenos asociados a tumor) TCM Linfocito T de memoria central TCR Receptor de células T TEF Linfocito T efector TEM Linfocito T de memoria efectora TIL Linfocitos infiltrantes de tumor TLR Receptor tipo Toll Página 3 de 43

4 TN TNF-α Treg VEGF Linfocito T virgen Factor de necrosis tumoral alfa Linfocitos T reguladores Factor de crecimiento de vénulas y endotelio Página 4 de 43

5 PALABRAS CLAVE: Inmunoterapia, quimioterapia, cáncer de mama, antígenos asociados a tumor (TAA) TEMATICA: MEDICINA REGENERATIVA, INGENIERIA DE TEJIDOS, MEDICINA MOLECULAR E INMUNOTERAPIA RESUMEN EJECUTIVO El cáncer de mama es la tercera causa de muerte por cáncer en Colombia y la primera causa de muerte por cáncer de mujeres en el mundo. Por lo anterior explorar nuevas u optimizar viejas estrategias terapéuticas es importante. La quimioterapia es una importante herramienta para el manejo del cáncer. La quimioterapia con Doxorrubicina y Ciclofosfamida es utilizada ampliamente en esquemas de y otros tumores. Aunque clásicamente se le ha atribuido a este régimen de quimioterapia un papel supresor de la respuesta inmune, estudios recientes en ratones sugieren: (i) que la Doxorrubicina induce muerte de células tumorales con liberación de señales de peligro y antígenos tumorales que estimulan eficientemente la inmunidad contra el tumor y (ii) que la Ciclofosfamida inhibe selectivamente linfocitos supresores de la respuesta inmune. No obstante la trascendencia de estos resultados, ellos no han sido demostrados en pacientes con cáncer tratados con Doxorrubicina/Ciclofosfamida. Para demostrar si existe un efecto inmuno-estimulador de Doxorrubicina/Ciclofosfamida utilizados en terapia neo-adyuvante, en este estudio se monitoreará en sangre de pacientes con cáncer de mama en quimioterapia con Doxorrubicina/Ciclofosfamida el inmunofenotipo y grado de expansión de linfocitos T de memoria específicos contra el tumor y células supresoras antes y después del tratamiento con el fin de evaluar si: (i) la quimioterapia aumenta el reconocimiento del tumor por el sistema inmune y (ii) si hay relación entre reconocimiento inmune y evolución clínica del tumor en cada paciente. Para ello se implementarán metodologías que permitan detectar, cuantificar y analizar la respuesta de LT específicos contra antígenos tumorales en mujeres distribuidas en dos grupos: (i) pacientes con cáncer de mama que recibirán terapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida y (ii) mujeres sanas no tratadas como grupo control. Con la metodología y diseño experimental propuestos en este proyecto buscamos responder las siguientes preguntas: Se favorece la expansión de linfocitos T de memoria con actividad anti-tumoral y la liberación de señales de peligro por las células tumorales con el uso de la quimioterapia neo-adyuvante?, Existe relación entre el grado de activación del sistema inmune inducido por la quimioterapia y la respuesta clínica del tumor? Y por último qué valor predictivo tienen los inmuno-fenotipos analizados con la respuesta clínica de las pacientes? Confiamos que los resultados de este proyecto brinden información que permita proponer el uso de la quimioterapia con Doxorrubicina y Ciclofosfamida como complemento útil de la inmunoterapia en pacientes con cáncer. Página 5 de 43

6 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El carcinoma de mama es una de las principales patologías tumorales en la mujer que ha venido experimentando un incremento en la incidencia y mortalidad durante las últimas décadas. En el 2002, este tumor representó un 22,8% de los casos de cáncer en las mujeres del mundo, por lo que se estima que se diagnostican aproximadamente un millón de casos nuevos por año [1]. Estas cifras de prevalencia de países desarrollados no difieren mucho de las registradas en nuestro país. Según el Anuario Estadístico del 2008 [2], el porcentaje de casos nuevos (sin discriminar los pacientes por género) de cáncer de mama en Colombia fue de 11.8%, un porcentaje similar al del cáncer de cuello uterino, siendo éste el segundo cáncer más frecuente después del cáncer de piel (16.2%) y duplicando al cáncer de estómago y de próstata (6% cada uno). Clásicamente se le ha atribuido a la quimioterapia un papel supresor de la respuesta inmune, sin embargo, existe abundante evidencia experimental en modelos animales que sugieren que el éxito de ciertos regímenes de quimio- o radio-terapia es en parte debido a que con ellos se logra una activación de la inmunidad adaptativa contra los tumores. Las evidencias demuestran que la Doxorrubicina induce en las células tumorales un tipo especial de apoptosis (apoptosis inmunogénica), caracterizada por la liberación de señales de peligro endógenas responsable de la maduración de células dendríticas y la generación de CTL de memoria específicos contra antígenos del tumor. No obstante la trascendencia que estos resultados pudiesen tener para las pacientes con cáncer de mama tratadas con Doxorrubicina, el papel inmuno-estimulante de la Doxorrubicina en pacientes con cáncer de mama tratadas con este fármaco, aún no ha sido examinado. De otra parte, la posibilidad de que el tratamiento con Doxorrubicina tenga capacidad inmuno-estimulante en algunas pacientes, hace necesario la implementación de metodologías confiables que permitan evaluar la calidad de la respuesta inmunológica contra el tumor (expansión de linfocitos T anti-tumorales y el fenotipo de memoria en pacientes tratadas con estos fármacos), con el fin de evaluar si en pacientes con una evolución y pronóstico clínico favorables estas drogas inducen un mejor reconocimiento del tumor por el sistema inmune. Con el fin de demostrar un efecto inmuno-estimulador de la Doxorrubicina y Ciclofosfamida, en este estudio se monitoreará antes y después del tratamiento el nivel de LT anti-tumorales en sangre de pacientes con cáncer de mama en quimioterapia con estos fármacos con el fin de evaluar: (i) si la quimioterapia aumenta el reconocimiento del tumor por el sistema inmune y (ii) si hay relación entre reconocimiento inmune y evolución clínica del tumor en cada paciente tratada. Página 6 de 43

7 JUSTIFICACION Doxorrubicina y Ciclofosfamida son dos fármacos ampliamente utilizados en terapia neoadyuvante en cáncer de mama que han evidenciado en modelos animales poseer propiedades inmuno-potenciadoras de la respuesta inmune contra los tumores. En este trabajo evaluaremos en pacientes con cáncer de mama la capacidad de estas drogas para favorecer el reconocimiento de los tumores por el sistema inmune. El demostrar con este trabajo una correlación entre respuesta clínica y reconocimiento inmunológico del tumor atribuible a la quimioterapia con Doxorrubicina y Ciclofosfamida permitiría revelar por primera vez en pacientes con cáncer de mama las propiedades inmuno-estimulantes de dos medicamentos de bajo costo ampliamente utilizados en quimioterapia del cáncer de mama y otros tumores. Esto y la implementación de tecnologías de punta como la citometría de flujo multi-paramétrica y tetrámeros fluorescentes HLA-A2 para monitorear LT-CD8+ anti-tumorales utilizadas en este proyecto para monitorear la respuesta inmune contra los tumores en pacientes con cáncer tratadas con Doxorrubicina y Ciclofosfamida, hacen de este un proyecto de investigación clínica orientado a aportar posibles alternativas de monitoreo inmunológico y manejo futuro del cáncer de mama en Colombia. Además de contribuir a la generación de nuevo conocimiento y al fortalecimiento de la comunidad científica con la formación de un estudiante de Doctorado, si podemos demostrar por primera vez en nuestro medio una capacidad adyuvante de la quimioterapia, los resultados de este trabajo quizás tenga importantes implicaciones para la implementación en Colombia del uso combinado de esquemas de quimio e inmunoterapia combinados. Página 7 de 43

8 OBJETIVOS Objetivo general: Evaluar la capacidad inmuno-estimulante de la quimioterapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida en pacientes con cáncer de mama. Objetivos específicos: Objetivo específico 1: Evidenciar un aumento de la respuesta inmune contra el tumor (inmunogenicidad de los tumores) inducida por la Doxorrubicina y Ciclofosfamida en pacientes con cáncer de mama en quimioterapia neo-adyuvante. Objetivo específico 2: Cotejar la inmunogenicidad de los tumores inducida por la quimioterapia con el grado de regresión tumoral en pacientes con cáncer de mama en quimioterapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida. Objetivo específico 3: Evaluar en pacientes con cáncer de mama en terapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida si la liberación de señales de peligro inducida por la quimioterapia favorece la inmunogenicidad de los tumores. Objetivo específico 4: Examinar si existe relación entre el grado de regresión del tumor inducida por la quimioterapia neo-adyuvante con la inmunogenicidad de los tumores; con la liberación de señales de peligro o con el polimorfismo de receptores específicos para estas señales. Página 8 de 43

9 MARCO DE REFERENCIA Quimioterapia neo-adyuvante La terapia neo-adyuvante también llamada terapia sistémica primaria o terapia de inducción, ha venido ganando importancia en el tratamiento multidisciplinario del cáncer. Inicialmente reservada para tumores localmente avanzados en un intento de convertirlos en tumores operables y ante el beneficio que significa el descenso del estadiaje tumoral después de dicha terapia (downstaging), hoy en día es alternativa terapéutica incluso para pacientes que se encuentran en estadio temprano, y en casos de progresión que no han recibido ningún tipo de tratamiento [3]. Estudios recientes sugieren que la quimioterapia en combinación con la inmunoterapia podría ofrecer ventajas terapéuticas cuando se compara con la quimioterapia administrada bajo los regímenes tradicionales [4]. Las ventajas del uso de la quimioterapia en combinación con la inmunoterapia pueden ser explicadas por diferentes razones sustentadas por evidencia experimental reciente: (i) el efecto de la quimioterapia en el estroma tumoral resulta en una mejor penetración al tumor de Linfocitos T Citotóxicos (CTLs); (ii) la quimioterapia induce la disminución local de la actividad supresora de las células tumorales mediada por: ligandos de muerte programada (PD1), disminución de los niveles de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) [5] y/o citoquinas inmunosupresoras; (iii) la quimioterapia favorece el aumento de la permeabilidad de las células tumorales a las granenzimas; (iv) la muerte masiva de células tumorales inducidas por la quimioterapia aumenta la expresión de antígenos asociados a tumor (TAAs) circulantes, lo que hace a las células tumorales un mejor blanco de CTLs; (v) la quimioterapia induce el aumento de Fas y otros receptores de muerte en las células tumorales, o de Fas-L en los CTLs; y finalmente (vi) se ha reportado un efecto inducido por la quimioterapia de sinérgia de la caspasa-3, granenzimas y Fas y elevación de ciertos marcadores pro-inflamatorios [6]. Evidencias recientes sugieren que la quimio- y la radio-terapia al favorecer la muerte de células tumorales, aumenta la presentación cruzada de antígenos tumorales in vivo [7, 8] y que la mielo-supresión inducida por la quimio- o radio-terapia favorece la proliferación homeostática de células del sistema inmune que producen citoquinas y/o la inhibición de la actividad de células T reguladoras (Treg) [9, 10], este último efecto especialmente asociado a la administración de bajas dosis de ciclofosfamida [11]. La quimioterapia adicionalmente aumenta el número de TAAs circulantes los cuales son posiblemente tomados por las Células Presentadoras de Antígeno (APCs) como las células dendríticas (DCs), procesados y presentados eficientemente a los LT. Señales en células tumorales que mueren por un tipo de apoptosis pro-inflamatoria inducida por la quimioterapia tienen un importante impacto en la eficiencia de fagocitosis, procesamiento de antígenos tumorales y maduración de DCs [12] que al migrar hacia órganos linfoides favorecen la expansión clonal de LT antitumorales [13, 14]. La muerte por quimioterapia induce la expresión del receptor transmembrana Fas tipo 1 y DR4/DR5 que son mediadores importantes de la apoptosis celular inducida por sus respectivos ligandos Fas-L y TRAIL expresados en los linfocitos NK y en LT-CD8+ activados [4]. Las concentraciones sub-tóxicas de las drogas quimioterapéuticas restauran la respuesta de Fas-L y Página 9 de 43

10 TRAIL en las células cancerosas, las cuales no son espontáneamente sensibles a estas citoquinas. Así los quimio-fármacos como Cisplatino, Doxorrubicina, Mitomicina C y el Fluoracilo, inducen efectos citotóxicos directos, ya que preparan las células tumorales para su propia eliminación por las células inmunes como las NK o CTLs usando una vía dependiente de Fas o TRAIL [12]. Activación del sistema inmune durante la terapia neo-adyuvante El manejo clásico de la patología tumoral persigue inducir una toxicidad directa sobre las células cancerosas sin ser esto suficiente para su completa destrucción. El daño producido por fármacos y por la radioterapia a células tumorales genera un microambiente inflamatorio de activación de LT efectores tempranos y la migración al tumor de APCs que fagocitan las células en proceso de muerte que cargan sus antígenos y migran al encuentro de LT vírgenes en nódulos linfoides en los que inducen la diferenciación hacia células efectoras y de memoria específicas contra el tumor. Las células efectoras deben haber adquirido receptores para quemoquinas y modular la expresión de distintas integrinas que les permite viajar desde el nódulo linfoide al tumor, lo cual es necesario para su eliminación. Estas células (en su mayoría LT-CD8+ y LT-CD4+), se activan a expensas de la estimulación de antígenos presentados por las APCs en el contexto del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) clase I y clase II respectivamente. Para que este proceso ocurra, es necesario que ocurra un tipo especial de muerte de las células tumorales, y contrario a lo que se consideraba hasta hace poco tiempo, es la muerte por apoptosis la que dispara la cadena de eventos inmunológicos descritos, y no la muerte por necrosis [15] [16], probablemente debido a que su desencadenamiento no depende del tipo de muerte per se, sino de la naturaleza de la célula y de estímulos que indujeron su muerte [16]. Las células reaccionan ante agentes citotóxicos con alteraciones en la diferenciación celular, detención de la proliferación y muerte. Un tipo de muerte por apoptosis de células tumorales que genera inflamación ha sido demostrada con el uso de antraciclinas [17-20]. En ensayos in vivo con Doxorrubicina se evidenció importante actividad tumoricida mientras que la medición de inmuno-fenotipos del sistema inmune del hospedero permanecieron indemnes [21]. Sorprendentemente, a pesar de la infiltración del fármaco en células sanas, incluidas las células del sistema inmune, en algunos casos se ha demostrado que lejos de ser tóxicas para ellas estos fármacos potencian su acción antitumoral [22]. Estas observaciones han llevado a considerar la posibilidad de combinar este tipo de terapia anti-tumoral farmacológica con la terapia inmune, esta última en distintas modalidades que van desde la transferencia adoptiva de células hasta la infusión de citoquinas (IL-2 recombinante, Interferones de tipo I, Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α)), entre otros. La combinación de quimio- e inmuno-terapia en distintos tipos de tumores ha evidenciado en varios estudios clínicos regresión de los tumores acompañada de la prolongación del periodo de sobrevida con limitada toxicidad [23-25]. Estudios recientes en modelos animales, demuestran claramente que el tratamiento con Doxorrubicina de células tumorales, incrementa su inmunogenicidad al punto que cuando son utilizadas como vacuna confieran inmunidad contra el tumor a expensas de LT-CD8+ antitumorales específicos [17-20, 26-29]. Página 10 de 43

11 Hasta hace poco la quimioterapia y la inmunoterapia eran consideradas como tratamientos antagónicos. Siempre se ha considerado que el uso de agentes quimioterapéuticos no sólo afecta a las células tumorales sino que también generan supresión medular secundaria que compromete la integridad de los linfocitos y otras células del sistema inmune. Sin embargo, actualmente se ha encontrado evidencia de que estas dos estrategias pueden complementarse, e incluso potenciarse de diferentes maneras, entre ellas, incrementando de manera altamente específica la respuestas de LT a antígenos tumorales [30]. Varios son los mecanismos propuestos como responsables de la inmunogenicidad de los tumores inducida por la quimio-terapia. La generación de una muerte celular inmunogénica, acompañada de la expresión de proteínas de choque térmico (HSP) en la superficie de las células tumorales muertas ha sido analizada en estos casos [31]. Lo anterior estimula la activación de una respuesta inmune adaptativa antitumoral, que a su vez ayuda a erradicar las células de cáncer residual (Stem cells). Entre los agentes que se han identificado que producen una muerte celular de tales características se encuentran las antraciclinas (Doxorrubicina, Daunorubicina o Idarrubicina), los taxanos (docixatel y Taxol), Imanitib, Bortezumib y la irradiación gamma [31]. Algunas de las características que se han encontrado en este tipo de muerte, es la translocación de moléculas que se encuentran a nivel intracelular a la superficie de la célula que entró en muerte celular programada, que incluso aparecen mucho antes de que ocurran cambios típicos de la apoptosis. Dichas moléculas incluyen la calreticulina (CRT, esta es una proteína soluble que actúa como chaperona en el Retículo endoplásmico y que está asociada con la modulación y homeostasis del calcio (Ca 2+ ) e involucrada en la presentación de péptidos en el MHC) y la fosfatidilserina como señal de inversión de la cara interna de la membrana plasmática hacia el medio extracelular. Estas actúan como una señal cómeme para las DCs, facilitando que las células tumorales sean fagocitadas, aumentando así el procesamiento y presentación de antígenos tumorales a los CTLs [32-35]. En experimentos con células de cáncer de colon murino (CT26) y fibrosarcoma (MCA205) tratadas con antraciclinas o radiación ionizante se encontró traslocación del 5-10% del contenido de CRT desde el retículo endoplásmico hacia la superficie celular en etapas tempranas del proceso, incluso antes de la exposición de la fosfatidilserina [36]. La traslocación de CRT estuvo acompañada de la expresión de Erp57 formando un complejo protéico en la superficie como indicador de estrés del retículo endoplásmico; este proceso de traslocación no ocurrió en la muerte celular no inmunogénica [37, 38]. Al parecer la expresión de este tipo de señales no es suficiente para generar una muerte celular inmunogénica; se necesita simultáneamente la activación de toda una cascada de señalización que induce una muerte celular programada con la activación de algunas caspasas pero que generan inflamación [32, 35]. Además de lo anterior se ha observado que se requieren de otras señales como la liberación de nucleoproteínas de la célula apoptótica como la proteína High Mobility Group Box 1 (HMGB-1) la cual una vez liberada se fija al TLR-4 lo cual induce la maduración de las DCs [31]. La complejidad del proceso de activación de las DCs por células tumorales es sugerida por evidencia experimental a favor de que células tumorales deficientes en CRT tratadas con Doxorrubicina no tienen la Página 11 de 43

12 capacidad de inducir maduración de DCs a pesar de la adición de CRT y HMGB-1 de manera exógena [39]. Además de la Doxorrubicina, actualmente se explora el poder adyuvante de otras moléculas que han mostrado ser capaces de inducir inmunogenicidad en los tumores in vitro. En este nuevo grupo de antineoplásicos se encuentran fármacos como los taxanos (docetaxel y paclitaxel), los cuales tienen su acción principal sobre la polimerización de los microtúbulos, aunque se ha descrito que a bajas dosis actúan sobre moléculas reguladoras del ciclo celular como p53 y p21, logrando la detención de la célula tumoral en fase G2 y favoreciendo la senescencia celular o la apoptosis [40-42]. Estudios in vitro con células de cáncer de mama muestran como el Taxol altera la expresión y funcionalidad de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl2/Bcl-X(L) por disminución en el mrna o fosforilación directa de éstas, favoreciendo la inducción de la apoptosis [43]. Adicionalmente, otros estudios han postulado la capacidad del Taxol de mimetizar ligandos de TLR-4 a altas dosis, pero con dosis normales se observa un incremento en la producción de IL-6; este hallazgo muestra que el taxol involucra mecanismos de activación del sistema inmune innato para la inducción de apoptosis [40, 44]. Sin embargo, en diferentes líneas celulares de ovario y carcinoma de mama la muerte inducida por taxol es independiente de caspasa 3 y caspasa 9 [45]. Además de las antraciclinas y los taxanos, se han 12erán12ir anti-inflamatorios no esteroideos (AINEs) logrando disminución de la masa tumoral en diferentes modelos como cáncer de colon [46, 47] y cáncer gástrico [48]. Al parecer el efecto apoptótico de medicamentos como la Mesalazina en carcinoma de colon, está relacionado con la inhibición de las ciclooxigenasas, favoreciendo de forma indirecta la acumulación de ceramidas, conocidas como potentes inmunomoduladores al actuar como quimio-atrayentes de CTLs [46, 49]. Finalmente, se ha reportado un aumento de Linfocitos Infiltrantes de Tumor (TIL) considerado como un factor pronóstico positivo en el seguimiento de la respuesta al tratamiento en carcinoma de colon con la administración del Sulindac [47]. Inmunogenicidad generada por liberación de señales de peligro Es de particular interés poder encontrar las alteraciones metabólicas o bioquímicas que emplea el sistema inmune para poder distinguir las células en muerte inmunogénica y no inmunogénica [50]. La muerte fisiológica de las células no induce una respuesta inmune e incluso son tolerogénicas para evitar el reconocimiento de patrones moleculares por receptores TLR o NLR que se encargan del reconocimiento de patógenos y patrones moleculares asociados a peligro [51, 52]. Ciertos regímenes de quimioterapia como oxaliplatino y antraciclinas como la Doxorrubicina generan una muerte celular que favorece la activación del sistema inmune[53]. La muerte celular inmunogénica inducida por estos agentes quimioterapéuticos se caracteriza, primero por la traslocación preapoptótica de Calreticulina (CRT) [36] y segundo por la liberación de HMGB-1 que actúa sobre el TLR-4. Estos dos componentes facilita el procesamiento de antígenos por las células dendríticas induciendo una activación de Linfocitos T específicos [54]. No obstante la activación mediada por CRT y HMGB-1, no es suficiente para la generación de una respuesta inmune anti-tumoral[55]. En macrófagos, el inflamosoma (complejo protéico de la familia de NLR que activa caspasa-1) sirve Página 12 de 43

13 como un sensor central de PAMPs y DAMP (patrones moleculares asociados a patógenos o a peligro respectivamente)[56]. La activación del inflamosoma por el NLRP3 activa la caspasa 1 la cual madura la IL-1B y posterior secreción dependiente de la activación del receptor purinérgico P2XR7 (receptor de ATP) y TLR-4[57-59]. La HMGB-1 es una nucleoproteína que tiene una función chaperona, permanece unida a las histonas durante la apoptosis favoreciendo la formación de segmentos de DNA con un tamaño definido (observable en un corrido electroforético del DNA). Durante la necrosis o la apoptosis inflamatoria, la HMGB-1 es liberada del núcleo hacia el citoplasma [28, 60, 61]. La HMGB-1 permanece en el núcleo de la célula y actúa como factor de transcripción [62], pero cuando es liberada al medio extracelular ejerce su acción sobre receptores de DCs (TLR-2 y TLR-4) [62-65]. Su acción sobre DCs se ha relacionado con la inducción de una respuesta inflamatoria similar a la desencadenada por el lipopolisacárido (LPS), la cual se caracteriza por la traslocación del factor NFκB, induciendo la maduración de DCs [27, 63]. De estos receptores, el TLR-4 es el más relevante en la respuesta a la quimioterapia dado que facilita la presentación de antígenos vía MHC clase I [27]. La muerte celular inmunogénica inducida por antraciclinas favorece la liberación de HMGB1, la cual puede ser detectada en el sobrenadante de los cultivos de células tumorales tratadas con este grupo de agentes quimioterapéuticos. En relación con esto, se encontró que la falta de liberación de HMGB-1 por parte de células tumorales tratadas con quimioterapia, inhibe la capacidad de éstas últimas para inducir la maduración de DCs [66, 67]. Por último, pacientes con cáncer de seno en quimioterapia que portan el alelo TLR-4 Asp299Gly el cual es disfuncional para la unión de HMGB-1 a este receptor, tienen una probabilidad de 17 veces mayor de desarrollar metástasis comparados con aquellos que exhiben una copia normal del alelo de TLR-4 [65]. Recientemente, Zitvogel y cols [68] han mostrado como el tratamiento de las células tumorales con antraciclinas, oxaliplatino o radio-terapia favorecen la liberación de ATP, el cual activa receptores purinérgicos, específicamente el receptor P2RX7 (miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral TNF) en las células dendríticas induciendo la activación del inflamosoma (conformado por NLRP3, ASC y Caspasa-1). Una vez activado el inflamosoma la caspasa-1 madura la IL-1B (de pro-il-1b a IL-1B). Esta misma señalización (ATP receptor P2XR7), favorece la secreción de la IL-1B[59]. Zitvogel y cols y Ferrari y cols, evidencian la importancia de todo el proceso de la señalización: (i) la detección de las señales de peligro (HMGB-1 y CRT) para favorecer la producción de la forma inmadura de IL-1B a través de la activación de TLR-4, (ii) la activación del inflamosoma para la maduración de esta citoquina y (iii) la activación de P2XR7 para favorecer su secreción. Sin embargo la evaluación de este sistema no ha sido realizada en pacientes con cáncer de mama que entran en quimioterapia neo-adyuvante. Memoria inmunológica Se describen 4 sub-poblaciones de memoria, tanto en LT-CD4+ como en LT-CD8+ [69, 70], determinados fenotípicamente por la expresión diferencial de marcadores de membrana, capacidad funcional (producción de citoquinas, migración a tejidos linfoides) y por la capacidad Página 13 de 43

14 proliferativa para su mantenimiento homeostático o para su diferenciación hacia otro fenotipo de memoria o efector (análisis de proliferación por longitud del telómero o cuantificación de TRECs del inglés T-cell Receptor Excision Circle-) [71, 72]. Los LT vírgenes (TN) se caracterizan por no haber experimentado un contacto previo con el antígeno. Una vez estimulados por APCs maduras cargadas con el péptido específico para la TN y bajo un ambiente pro-inflamatorio, comienza el proceso de diferenciación a LT de memoria o LT efectores [73]. LT de memoria central (TCM) expresan receptores de migración a nódulos linfáticos (como CCR7) y unión a células endoteliales (como L-selectina, CD62-L). Se ha descrito que TCM poseen un telómero más largo lo cual sugiere una mayor capacidad de proliferación a diferencia de los LT de memoria efectora (TEM) [70], los cuales disminuyen la expresión en superficie de CD45RO, CD28 y CD27 durante su proceso de diferenciación a LT-CD8+ efectores terminales (TEF) [74]. Este proceso de maduración parece ser dirigido adicionalmente por presencia del antígeno o por ciertas citoquinas como IL-7 e IL-15 para TEM, mientras que estas citoquinas no tienen tanto efecto sobre TCM y ningún efecto sobre TN [75]. Cada una de estas cuatro sub-poblaciones posee funciones particulares que las diferencian entre sí, por ejemplo TCM produce principalmente IL-2, mientras que TEM se caracteriza por la rápida expresión de funciones efectoras como la producción de citoquinas (IL-4 o IFN-γ) [69]. Los TEF migran a los tejidos donde se encuentra activo un proceso inflamatorio, expresan grandes cantidades de TNF-α, perforina y granulosinas, poseen una reducida capacidad para proliferar y producir IL-2 [70]. Memoria inmunológica y cáncer Con el desarrollo de diferentes ensayos clínicos con inmunoterapia, se ha analizado el papel que juegan los diferentes tipos de perfiles de memoria en esquemas de transferencia adoptiva de LT para el manejo de cáncer. Estos ensayos han sido realizados tanto en modelos animales como en algunos ensayos clínicos en humanos. Inicialmente se postularía que un perfil de tipo efector proporcionaría una respuesta anti-tumoral eficiente, pero estudios realizados por Gattinoni y cols [76] muestra el efecto anti-tumoral en los diferentes niveles de diferenciación de TEF, observando que a menor diferenciación mayor actividad anti-tumoral. En concordancia con ello, en modelos in vivo de melanoma, se comparó la transferencia de TCM con la transferencia de TEM, ambas generadas de cultivo in vitro en medio condicionado con citoquinas, y describen como los TCM tienen una mejor capacidad para la reducción de un tumor preestablecido [77]. Por otra parte, el estudio de la diferenciación de la memoria a través de la vía de señalización Wnt β-catenina, conocida por regular el proceso de maduración de LT post-tímicos, ha mostrado que la generación de TCM similares a células madre (inducidos por la presencia de IL-2 e IL-21) genera una mejor respuesta anti-tumoral de LT-CD8+ [78] comparado con la transferencia adoptiva de TEM o TCM. Inmunoterapia y autoinmunidad en cáncer Los diferentes ensayos clínicos con inmunoterapia contra el cáncer han permitido evidenciar diversos grados de respuesta clínica e inmunológica, junto con algunos efectos colaterales; entre los cuales se han reportado en pacientes con melanoma, casos de 14erán14ir transitorio tras la administración de DCs pulsadas con antígenos del melanocito [79, 80]. De manera interesante, en Página 14 de 43

15 un modelo animal de melanoma fue demostrado en ratones que padecieron este efecto tuvieron una mejor respuesta antitumoral [81, 82]. Esto ha hecho que el temor de generar autoinmunidad con vacunas terapéuticas basadas en DCs no sea hoy en día un tema que despierte mayor preocupación; por el contrario, algunos autores han sugerido que este tipo de reacciones pueden estar asociadas a una mejor eficacia de la inmunoterapia [83]. En algunos casos, el carácter autoinmune de estas terapias está dado por la elevación de anticuerpos antinucleares (ANAs), en especial DNA de doble cadena (anti-dsdna), que reaccionan preferencialmente contra las células de tipo tumoral, inhibiendo su crecimiento [81, 84]. Es por ello que no suelen observarse manifestaciones clínicas o histológicas de un proceso patológico autoinmune, o se presentan sólo de manera transitoria, como el 15erán15ir en el caso de tratamientos con péptidos de Melan-A. Esto también ha sido analizado en el modelo murino, en el cual se ha observado que al aplicar DCs sin antígeno, se presenta una autoinmunidad transitoria, especialmente dirigida contra las células tumorales [84]. Evidencias que los auto-anticuerpos no reaccionen con las células normales es el hecho que tales anticuerpos suelen estar aumentados en el suero tanto de humanos como de ratones seniles sin procesos clínicos de enfermedad autoinmune [81], la elevación podría ser una resultante de procesos de citotoxicidad dependiente de anticuerpos que aumenta con la edad [85]. Algunos investigadores han sugerido la inducción de autoinmunidad como alternativa para tratar el cáncer [83, 84], debido a que existen resultados altamente sugestivos de que la inducción deliberada de reactividad autoinmune luego de la vacunación con antígenos de diferenciación, puede permitir la destrucción del tumor [84]. Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) Para una buena actividad antitumoral por parte del sistema inmune, incluyendo la lisis de las células tumorales por parte de CTLs, se requiere del adecuado reconocimiento de péptidos específicos de tumor presentado por las células tumorales. Para ello, es necesario la generación inicial de LT-CD4+ con actividad helper junto con la activación de LT-CD8+ con actividad citotóxica; esta generación requiere de la presentación y co-estimulación adecuada de TAAs por parte de APCs como las DCs. Inicialmente, la presentación de los TAAs debe realizarse en un MHC específico con una afinidad adecuada para resistir los procesos de selección y edición por parte de HLA-DM [86] para clase II y por parte de Tapasina para MHC de clase I [87] y finalmente este complejo péptido/mhc (pmhc) debe ser reconocido adecuadamente por un TCR específico. Posteriormente se requiere de una co-estimulación (segunda señal) por parte de las APCs mediante la expresión de CD40, CD80 y CD86 a sus ligandos CD28 o CD40L en los LT; todo lo anterior debe estar dentro de un ambiente pro-inflamatorio mediado por citoquinas como IL-12 [88] para una adecuada activación de los LT. Con el proceso de maduración de las DCs (evidenciado fenotípicamente por incremento de la expresión de señales de co-estimulación y pérdida de CD209), los pmhc de clase II se acumulan en la superficie de la DC permitiendo una interacción de los TAAs con los LT-CD4+, cuyo papel en la respuesta anti-tumoral no solo radica en la función helper a los CTLs sino también en la generación de memoria [89]. Página 15 de 43

16 Antígenos Asociados a Tumor (TAAs) En los últimos 15 años se ha logrado la identificación, purificación y síntesis de múltiples antígenos peptídicos provenientes de moléculas que se expresan de forma diferencial en células tumorales [90], tanto por aparición de proteínas que normalmente no se expresan, como por una sobreexpresión o mutación de proteínas normales; estos antígenos son conocidos como TAAs (del inglés Tumor Associated Antigens). La gran mayoría de estos antígenos peptídicos han sido estudiados en personas HLA-A*0201 (por su alta frecuencia en caucásicos, 48% [91]), describiendo secuencias de péptidos restringidos a este alelo capaces de generar una respuesta celular en LT-CD8+. Estos TAAs al ser HLA-A*0201 restringidos, requiere que los estudios en voluntarios donde se empleen, deban presentar al menos una copia de este alelo, motivo por el cual en el presente estudio todas las mujeres participantes (tanto pacientes con cáncer de mama como mujeres sanas) deben ser HLA-A*0201; para ello ya se ha identificado la frecuencia de expresión de este alelo en la población de Bogotá por Alfonso R. y cols [92], encontrando una frecuencia fenotípica de 27.4% similar al encontrado en otro estudio en la ciudad de Cali (29%) [93]. La caracterización de los diferentes tipos de péptidos ha permitido clasificarlos en 3 grupos [94]: (i) Antígenos de diferenciación, expresados según el grado de progresión del tumor, como tirosinasa, melan-a, gp100 y TRP-1 y TRP-2; (ii) Antígenos testiculares asociados a cáncer (Cancer testis antigens), normalmente expresados en órganos invisibles al sistema inmune, como MAGE, BAGE, CAGE, NY-ESO-1 y SSX [95, 96]; y (iii) antígenos sobre-expresados, que se encuentran normalmente en los tejidos sanos, lo que puede generar fenómenos de tolerancia, como, HER- 2/neu [97], Survivina y Telomerasa. Antígenos de diferenciación Comprenden un linaje de antígenos específicos que se expresan en células tumorales también como en células normales de las cuales se origina el tumor. Los pacientes tienen LT capaces de reconocer antígenos codificados por los genes de diferenciación de los melanocitos normales. En el caso de diferenciación de antígenos de melanoma significa que ellos son expresados a través de los estados de progresión del tumor melanocítico empezando en el melanocito, tales como tirosinasa, melan-a, gp100 y TRP-1 y 2. Muchos de los antígenos de diferenciación de melanoma tienen que ver con la producción de melanina. Antígenos testiculares asociados a cáncer CTAs (Cancer testis antigens) Los CTAs fueron originalmente descubiertos en melanoma y se expresan de forma normal en testículos y placenta, órganos no visibles al sistema inmune. Se agrupan en varias subfamilias que incluyen varios miembros. Estos antígenos son expresados en diferentes tipos de tumores malignos y son restringidos en tejidos normales a células germinales del testículo, los cuales son ocasionalmente expresados en bajos niveles en órganos reproductivos de la mujer. Los CTAs no son presentados por las células germinales ya que no expresan HLA en la superficie para ser Página 16 de 43

17 reconocidos por los LT. Los CTAs están codificados principalmente en el cromosoma X en el que están los genes de la familia MAGE, BAGE, CAGE, NY-ESO-1 y SSX. Antígenos sobre-expresados Genes ampliamente expresados en muchos tejidos normales que pueden algunas veces dar origen a respuesta inmunológica. Cuando hay sobre-expresión de estas proteínas en tumores pueden ser reconocidos por LT como resultado de rompimiento de la tolerancia antigénica. El gen PRAME fue identificado como sobre-expresado en melanomas y otros tipos de cáncer y es reconocido por CTLs; survivina, que inhibe la familia de proteínas de 17erán17irá (IAP) y telomerasa, que es funcionalmente necesaria para la inmortalización de las células tumorales. HER-2/neu Es un proto-oncogen, con actividad kinasa involucrada en la transducción de señales de crecimiento, de la familia receptores del factor de crecimiento epidermal (EGF), localizado en el cromosoma 17q Se expresa en tumores epiteliales y en el 30% de los tumores primarios de mama, siendo éste un factor de pobre pronóstico. Posee un dominio extracelular que puede ser blanco de Linfocitos B y ambas regiones poseen péptidos que pueden ser presentados en HLA-I y II. Se clasifica como un TAA mutado y sobre-expresado, pertenece a la familia de receptores transmembranales incluído HER-1 (EGFR), HER-3 y HER-4 que guardan una alta homología. HER- 2/neu posee un dominio intracelular de 50aa con actividad tirosin kinasa que es activado por ligandos de unión a EGFR y un segmento regulatorio, una región transmembranal lipofílica y una extracitoplasmática rica en cisteínas. Los ligandos de HER tienen mayor afinidad por los receptores excepto para HER-2 que es importante para la heterodimerización. La señalización a través de los receptores lleva a la activación de múltiples segundos mensajeros e interacciones entre dominios proteicos, lo que conduce a la transcripción de genes nucleares, los más importantes son protein kinasa ras/ mitogen- activated, la ruta PI3 kinasa y la fosfolipasa C-g y genes como c-fos, c-jun, c-myc y EGR1. Los niveles de dominio extracelular clivado de HER-2/neu circulante predice con éxito la presencia y progresión de cáncer de mama HER-2/neu positivo y se correlaciona con sobrevida y ausencia de respuesta clínica a la terapia hormonal en tumores ER positivos demostrado por algunos estudios [98]. La sobre-expresión de HER-2/neu consistentemente se asocia a formas más agresivas y extensas de carcinoma ductal in situ y enfermedad de Pager s. Bajos niveles de HER-2/neu han sido identificados en biopsias de cáncer de mama inicial y se asocia con un incrementado riesgo de subsecuente cáncer de mama invasivo [99]. La determinación de HER-2/neu aprobada por la FDA es por técnicas de inmunohistoquímica (IHC) (proteína) y FISH (gen). Otras de las metodologías no aprobadas pero que ampliamente son manejadas con fines investigativos son Southern blot, PCR, RT-PCR y ELISA. A pesar que existen CTLs específicos anti-her-2/neu en pacientes con cáncer de mama, en muchos casos no previene Página 17 de 43

18 la progresión de la enfermedad y es posiblemente debido a que es un antígeno propio que induce tolerancia activa por deleción de clonos que reconocen las epítopes inmunodominantes presentadas; sin embargo, la mayoría de péptidos son epítopes subdominantes inmunogénicos [100]. Diversidad del repertorio del receptor de células T (TCR) La composición de los ligandos péptidicos propios presentes en el timo juega un papel importante en el repertorio pre-inmune[101]. Timocitos inmaduros que expresan TCR de baja afinidad para complejos péptido propio con MHC sobreviven y maduran posteriormente (denominado selección positiva). Por el contrario, LT autoreactivos son eliminados por la inducción de muerte celular programada (selección negativa). Los timocitos maduros de baja afinidad para péptidos propios, migran del timo a la periferia, creando un en el sistema inmune un repertorio altamente diverso [102]. Adicionalmente ligandos de péptidos propios con MHC envían señales de sobrevida a los TN para su persistencia en la periferia [103]. El reconocimiento de péptidos propios por LT a través del TCR posee una gran especificidad como lo demuestra la sustitución de un solo aminoácido con efectos muy drásticos [104], sin embargo, el alto grado de reactividad cruzada en el repertorio asegura teóricamente el reconocimiento de cualquier péptido presentable. Las librerías de péptidos sintéticos han contribuido a la identificación de múltiples ligandos que estimula el mismo clono de LT sin que necesariamente muestren homología en su secuencia [105]. Se ha estimado que la frecuencia de células TN específicas para una epítope oscila entre 1 a 5 x10-5 [106], la cual está por debajo de los límites de detección directa por las técnicas estándar. En humanos, la baja frecuencia de los LT específicos de péptidos propios en el repertorio pre-inmune ha limitado su investigación. El antígeno de diferenciación de melanocitos Melan-A/MART (Melan-A) es una proteína cuya función es desconocida y se expresa en melanocitos y en la mayoría de células de melanomas pero no en otros tejidos [107, 108]. Con el empleo de multímeros de Melan-A (con un análogo A27L ELAGIGILTV) restringido a HLA-A*0201 en LT- CD8+, se ha podido establecer ex vivo, LT específicos de Melan-A tanto en ganglios linfáticos infiltrados por tumor como LT circulantes de pacientes con melanoma e incluso en individuos sanos [109, 110]. Posteriormente, se identificó que LT Melan-A específicos son fenotípicamente vírgenes (CCR7+, CD45RA altas, CD45RO- y CD28+) y de forma llamativa comprenden alrededor de 10-3 de los LT-CD8+ circulantes, 10 2 veces más que las calculadas para los precursores vírgenes [111, 112]. Estos hallazgos cuestionan cómo se establece y se mantiene un repertorio amplio de LT no esperado como el de Melan-A. Estudios previos donde se emplean marcadores de superficie no reflejan el estado funcional de LT-específicos. Con relación a esto, se ha mostrado que TN pueden expandirse sin cambiar su fenotipo [113] o devolverse al estado virgen posterior a una fase de activación transitoria [114, 115]. Aún más, células de memoria pueden revertirse a un fenotipo de TN. Estudios realizados por Romero P. muestran que la alta frecuencia de LT-CD8+ específicos de Melan-A, proviene de un repertorio pre-inmune [71]. Página 18 de 43

19 Importancia de la frecuencia de precursores de LT en cáncer El monitoreo clínico de la respuesta de LT específicos de tumor es muy importante durante y posterior a los tratamientos tanto de inmunoterapia como quimioterapia. Estos tratamientos pueden afectar el repertorio de LT que responde a una epítope blanco [116, 117]. Actualmente existen diversos métodos para evaluar tanto la respuesta de LT como el repertorio, utilizando dilución límite, ELISPOT, determinación por citometría de flujo del segmento variable del TCR, análisis de la longitud del TCR-CDR3 o espectratipo o mediante el empleo de complejos multiméricos de MHC péptido específicos (tetrámeros). Este tipo de análisis sirve para definir si la respuesta de LT específicos es policlonal, monoclonal o con predominio de algunos clonotipos de TCRs con su respectiva capacidad funcional (mediante la determinación de la producción de citoquinas intracelulares) [118]. La especificidad de un TCR reside principalmente en el CDR3 que es la resultante dela recombinación somática de los elementos del TCR, región variable (V), de unión (j del inglés joining) y de la región constante (C) del heterodímero del TCR [119]. El tipo de respuesta de un LT específico de un antígeno dado se puede describir mediante tres características: (i) la especificidad de las funciones efectoras de una población de LT, (ii) la cuantificación de la respuesta, mediante el número de células que responden (tanto LT-CD4+ como LT-CD8+) y (iii) la calidad de la respuesta definido por la afinidad de un TCR por el péptido estudiado. Diversos estudios han analizado el TCR de pacientes con cáncer mediante espectratipo [ ] y algunos estudios han mostrado durante la inmunización en terapias contra el cáncer una activación y proliferación de clonos de LT [124, 125]. Página 19 de 43

20 METODOLOGIA PROPUESTA Basados en resultados de estudios en animales y algunos estudios clínicos en que se atribuyen a la Doxorrubicina la capacidad de favorecer la generación de linfocitos T CD8+ anti-tumorales y a la Ciclofosfamida la capacidad para reducir los niveles de LT supresores, en este proyecto proponemos realizar un estudio observacional prospectivo con el fin de evaluar en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama en quimioterapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida (esquema A/C), si un aumento del reconocimiento del tumor y actividad antitumoral de LT CD8+ específicos para HER-2/neu (utilizado como antígeno tumoral modelo) se relacionan con una reducción del tamaño del tumor en las pacientes tratadas. Esta relación se tratara de establecer cotejando el inmuno-fenotipo y tamaño del repertorio de linfocitos T de memoria específicos contra HER-2/neu presentes en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama antes y después de la quimioterapia neo-adyuvante con el grado de regresión del tumor en cada paciente. Una línea base del inmuno-fenotipo y tamaño del repertorio de linfocitos T CD8+ específicos para el antígeno HER-2/neu se establecerá en un grupo de mujeres sanas sin antecedentes familiares de cáncer de mama. Confiamos que la metodología y diseño experimental propuestos permitan evidenciar que estos fármacos potencia la respuesta inmune contra los tumores a expensas de la generación de linfocitos T CD8+ de memoria con potente actividad antitumoral. Adicional a lo anterior, se evaluará si tres señales de peligro endógenas (HMGB-1, ATP e IL-1β) liberadas por células tumorales que mueren en respuesta al tratamiento con A/C juega un papel inmuno-potenciador de la respuesta inmune contra el tumor. Estudios en modelos animales de cáncer han demostrado que estas tres señales de peligro son inducidas por células que mueren como consecuencia de la quimioterapia y que su liberación es importante para el control de los tumores por el sistema inmune. Los estudios en animales e in vitro sugieren que HMGB-1 estimula el TLR-4; que el ATP es censado por el receptor purinérgico P2XR7 y que la IL-1β es liberada como consecuencia del ensamble del inflamosoma y que estas son tres señales de alarma que promueven la maduración de células dendríticas necesaria para la generación de linfocitos T CD8+ anti-tumorales. En este estudio se cuantificará por ELISA en plasma de las participantes los niveles de HMGB-1 e IL-1β antes y durante la quimioterapia y se analizara la frecuencia de polimorfismos específicos de nucleótidos (SNPs) de los receptores TLR-4 y P2XR7 como posibles marcadores biológicos de resistencia/susceptibilidad al desarrollo de enfermedad sistémica (desarrollo de metástasis). Finalmente, luego de los tres primeros ciclos de quimioterapia neo-adyuvante se cotejarán en cada paciente los datos obtenidos de estos estudios con la respuesta clínica (ver diagrama diseño metodológico Anexo), con el fin de cotejar la liberación de estas señales de peligro como posibles marcadores biológicos de respuesta inmune celular de LT CD8+ antitumorales con valor pronóstico de respuesta clínica favorable a la quimioterapia neoadyuvante en pacientes con cáncer de mama. Página 20 de 43