Cryptococcus neoformans/gattii: 33 años de estudios en Puerto Rico Una travesía del diagnóstico convencional al molecular.

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1 Cryptococcus neoformans/gattii: 33 años de estudios en Puerto Rico Una travesía del diagnóstico convencional al molecular Alejandro Ruiz Acevedo, Ph.D, MT Departamento de Biología Recinto Universitario de Mayagüez, P.R. El autor es también profesor de los programas de Certificado y Maestría en Ciencias en Tecnología Médica del Recinto Metropolitano de la Universidad Interamericana de P.R. Introducción Por muchos años, al mencionar cryptococosis, se hacía referencia a la micosis sistémica ocasionada por las distintas variedades y serotipos capsulares de Cryptococcus neoformans (C. neoformans var. grubii/serotipo A; var. neoformans/serotipo D; un híbrido AD; y la var. gattii/serotipos B y C). Más recientemente, sin embargo, debido a diferencias en nichos ecológicos, así como en características fisiológicas y moleculares, se ha propuesto que la var. gattii se eleve a rango de especie dentro del mismo género. Esta nueva especie cobra particular importancia debido a que aparentemente su distribución geográfica es más amplia de lo originalmente informado y además, por la aparición de cepas altamente virulentas que ocasionan un alto índice de mortalidad. Ecología A nivel mundial, incluso en Puerto Rico, C. neoformans generalmente se asocia con excremento de aves, principalmente de palomas (Columba livia) (1). Estudios ecológicos realizados durante las últimas tres décadas en el Laboratorio de Micología Tropical del Recinto Universitario de Mayagüez, reflejan que esta especie abunda en la Isla; la levadura se aisló del 24.7% y 11% de las muestras recolectadas en pueblos de las regiones oeste y sur, respectivamente (2,3). Interesantemente, Isabela ha resultado ser repetidamente el pueblo con mayor índice de aislamiento (79%), la cifra más alta registrada a nivel mundial. El nicho ecológico de C. gatti, por el contrario, no ha estado tan claramente definido. En el 1990 científicos australianos arrojaron luz sobre este particular al asociar por vez primera a C. gattii con detrito de árboles de Eucalyptus en floración (4). Posteriormente ha sido aislado de materia vegetal en descomposición de muchos otros árboles, mayormente en regiones tropicales y subtropicales. Esta especie ha cobrado notoriedad en los últimos 10 años a partir de un brote de la enfermedad que ha afectado desde 1999 individuos inmunocompetentes y 1

2 animales en la isla de Vancouver, en la Columbia Británica, Canadá (5,6,7,8,9,10,11,12,13). Desde entonces los esfuerzos por dilucidar con precisión el nicho ecológico de C. gattii han aumentado. Los esfuerzos por aislar C. gattii de Eucalyptus en Puerto Rico han sido infructuosos (3). Sin embargo, durante 2007 se recuperó de árboles de almendros (Terminalia cattapa) y de mangó (Manguifera sp.), en el Sur Oeste de la isla. Sorprendentemente, también se logró aislar de lesiones en el cuerpo de varios cactus Cephalocereus royenii, localizados mayormente en el Bosque Seco de Guánica (14). Esta constituye la primera ocasión en que se informa en la literatura mundial el aislamiento de la levadura de un ambiente cuasi- extremo. Más recientemente, a finales de 2010, se recuperó C. gattii de cactus creciendo en el sector Playa Sucia, cercano al Faro en Cabo Rojo (no publicado aún). Aparentemente, la producción de fenoloxidasa (lacasa) por la levadura facilita la degradación de lignina y otros elementos vegetales (1,15,16). Nuestros resultados, así como el aislamiento de C. gatti de muestras clínicas y ambientales obtenidas en zonas templadas, como en la Columbia Británica, Canadá y en los estados de Washington y Oregón en Estados Unidos de América, apunta a una distribución ecológica más generalizada de lo pensado anteriormente (13,14,17). Cryptococosis La cryptococosis es una micosis sistémica que usualmente se origina al inhalar las partículas infecciosas ambientales, que luego se depositan en los pulmones produciendo una pulmonía subclínica o asintomática. Posteriormente se diseminan por vía hematógena a diversos órganos, particularmente al sistema nervioso central, produciendo meningitis o meningoencefalitis (17); C. gattii, sin embargo, tiende a producir masas o cryptococomas en los pulmones y en el cerebro (11,18,19). En ocasiones puede afectar los huesos y la piel. Los resultados de nuestros estudios aerobiológicos señalan a la levadura de 3-5 μ de diámetro y no encapsulada, como la partícula infecciosa más probable (20). Otros micólogos sostienen que las basidiosporas (esporas sexuales del hongo) también pudieran ser las partículas infecciosas (1,10,21,22). En los tejidos enfermos el hongo se manifiesta como una levadura encapsulada que puede alcanzar un diámetro de hasta 20 μ. La predilección de Cryptococcus por el sistema nervioso central parece deberse principalmente a la disponibilidad allí de compuestos catecolaminas (epinefrina, norepinefrina, dopa y dopamina). Además, en el proceso la levadura sintetiza melanina, la cual se deposita en la pared celular, protegiéndola contra antioxidantes del sistema inmunológico, fagocitosis y fungicidas (1,23,24). Por otro lado, en un trabajo colaborativo entre el Laboratorio de Biotecnología Microbiana y Bioprospectos y el de Micología Tropical, ambos del Recinto Universitario de Mayagüez, se ha estado utilizando la tecnología de Phage Display para tratar 2

3 de definir el proceso de reconocimiento y adhesión de Cryptococcus gattii, serotipo C a proteínas cerebrales humanas expresadas en el cápsido del bacteriófago T7. Los resultados preliminares han demostrado que dos proteinas asociadas al citoesqueleto de células del sistema nervioso central, podrían ser receptores específicos para la levadura. Este trabajo reviste particular importancia para lograr un mejor entendimiento de la patogénesis de la cryptococosis (25). Cryptococcus neoformans afecta principalmente a personas inmunodeficientes, ya sea por padecer el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), cáncer, o por recibir terapia inmunosupresora. Cryptococcus gattii, por el contrario, tiende a afectar hospederos inmunocompetentes (1). En Puerto Rico, durante los últimos 30 años se han diagnosticado 238 casos de cryptococosis, todos en pacientes de SIDA. Estos casos correspondieron a la especie C. neoformans (26). A nuestro mejor entender, hasta el momento actual no se han reportado casos ocasionados por C. gatti. Definir con precisión el periodo de incubación para esta micosis resulta enigmático. En el caso de C. neoformans se conocen casos agudos, pero además, varios autores, incluyendo el que suscribe, proponemos la teoría de latencia (1,2,27). La misma sostiene que la persona inmunocompetente se expone a la levadura y ésta se transforma morfológicamente (pseudohifa no encapsulada- avirulenta), localizándose temporeramente en algún lugar anatómico indeterminado y por tiempo indefinido. Posteriormente, al ocurrir inmunosupresión, el hongo recobra su morfología clásica (levadura encapsulada), así como su virulencia, ocasionando la micosis. En el caso de C. gatti, sin embargo, el fenómeno de latencia aparentemente es infrecuente (1). Factores de Virulencia Es ampliamente reconocido que la cápsula de Cryptococcus es su principal factor de virulencia. La misma está compuesta por glucoroxilomanana (GMX), galactoxilomanana (GalXM) y manoproteina (MP). GMX, es el más abundante de los tres (90%), y además, el más importante ya que interfiere con la fagocitosis y con la actividad del sistema de complemento (1). La levadura también produce fenoloxidasa, enzima que en presencia de compuestos catecolaminas, produce melanina, que como se indicó antes, se deposita en la pared celular, protegiéndola contra antioxidantes del sistema inmunológico, fagocitosis y fungicidas (1,23,24). Resulta interesante, sin embargo, que la disponibilidad de los referidos factores de virulencia, entre otros, particularmente en C. neoformans, son solo efectivos en individuos inmunodeficientes. 3

4 Diagnóstico de Laboratorio Una vez se expresa, la cryptococosis representa un alto índice de mortalidad (1). Por tal razón, tanto los profesionales médicos como los del laboratorio clínico, tienen que ser agresivos en sus métodos diagnósticos. El cultivo microbiológico, aunque es de ayuda, podría resultar tardío. Por tal razón, el examen directo, es decir, la detección de la levadura o del antígeno capsular en los fluidos o tejidos humanos es la mejor opción. Muestras clínicas Debido a que inicialmente la micosis es respiratoria, uno pensaría que esputos, naturales o inducidos, aspirados transtraqueales y biopsias pulmonares, pudieran ser de ayuda. Sin embargo, es necesario recordar que la mayoría de los casos son subclínicos o asintomáticos, por lo que podrían pasar desapercibidos (1). Por lo tanto, usualmente la mejor muestra clínica para realizar el diagnóstico de laboratorio es el líquido cefalorraquídeo. En la fase diseminada, también podemos procesar sangre, orina y raspados o biopsias de piel. Examen directo de las muestras clínicas Cryptococcus es fácilmente distinguible en el examen directo de las muestras clínicas, particularmente en los especímenes líquidos. Cualquier tinción negativa resalta el halo transparente correspondiente a la cápsula polisacárida alrededor de la levadura, dando la impresión de un cielo estrellado como trasfondo (Figura 1). Sin embargo, la relativa baja sensibilidad de la prueba (aproximadamente de 50%), obliga en muchas circunstancias a recurrir a la técnica de aglutinación con partículas latex, disponible en diversas variedades comerciales. Este ensayo clínico, cuya sensibilidad supera el 90%, detecta también antígeno capsular. Detectar levaduras encapsuladas en el examen directo de las muestras clínicas provee evidencia rápida y concluyente en el diagnóstico de la cryptococosis (1). Cultivo Ninguna de las dos especies patógenas de Cryptococcus es fastidiosa; es decir, ambas crecen muy bien en agar sangre y en medios micológicos rutinarios, como el agar Sabouraud (SDA) o el de papas (PDA), tanto a temperatura ambiente, como a 37 C. Acidificar el medio de cultivo a un ph entre 5.5 y 6.0 y añadir antibióticos antibacterianos son estrategias que han resultado ser muy efectivas al procesar muestras clínicas altamente contaminadas, como suelen ser los esputos y las heces fecales. Añadir ciclohexemida (actidione) para inhibir mohos contaminantes, sin embargo, puede ser contraproducente ya que la levadura es también 4

5 inhibida. En SDA o en PDA usualmente produce colonias pastosas, de color crema y mucoides, característica que usualmente distingue los microorganismos encapsulados. El medio de Staib (contiene extracto de semillas de Guizotia abyssinica) ha resultado muy conveniente en el aislamiento de la levadura tanto de muestras ambientales como clínicas. El medio de cultivo lo modificamos mediante la adición de antibióticos antibacterianos y de bifenil al 0.1%. Luego de tres días de incubación, ambas especies presentan colonias color marrón oscuro debido a la acumulación de melanina en la pared celular del hongo, producto de la acción de la fenoloxidasa sobre el sustrato presente en el extracto de las semillas (1,2,14) (Figura 2). Perfil bioquímico Las especies de Cryptococcus presentan algunas características bioquímicas comunes tales como la producción de las enzimas fenoloxidasa y ureasa, así como la inhabilidad para fermentar carbohidratos. Además, asimilan la mayoría de los azúcares, incluyendo inositol. No asimilan melobiosa y lactosa. C. gattii, contrario a C. neoformans, utiliza como fuente de carbono y energía los ácidos fumárico, succínico y málico (1). También asimila la glicina y es resistente a canavanina. Estas últimas características sirven de base para la confección del agar de canavanina, glicina, azul de bromotimol (CGB) (1,29). Este medio de cultivo nos permite diferenciar ambas especies. C. neoformans, al ser sensible a la canavanina y por no asimilar la glicina, no crece en el medio, conservando éste su color amarillo- verdoso original. C. gattii, por el contrario, es resistente a la canavanina y asimila glicina, produciendo amonio. Esta reacción alcaliniza el medio de cultivo y lo torna azul por efecto del indicador de cambio de ph, azul de bromotimol (Figura 3). Técnicas moleculares Las técnicas moleculares constituyen hoy día las principales herramientas en los esfuerzos por definir con precisión la epidemiología de estas levaduras, principalmente de C. gattii. Se destacan la determinación de huellas de DNA mediante PCR (PCR fingerprinting); polimorfismo de secuencias repetitivas mediante análisis con nucleasas de restricción (RFLP o restriction fragment length polymorphism); secuenciación de espaciadores intergénicos (intergenic spacer sequencing); polimorfismo de secuencias repetitivas mediante PCR (amplified fragment length polymorphism) y tipificación de secuencias en múltiples loci (MLST o multilocus secuence typing)(1,5,6,7,8,9,10,11,12,13). Usando las técnicas antes mencionadas se han identificado varias sublíneas haploides o genotipos de C. gattii obtenidas de muestras clínicas y ambientales, tales como VGI, VGII, VGIII y VGIV. A modo de ejemplo, la mayoría de las cepas de C. gattii aisladas de muestras clínicas y de eucaliptos en Australia pertenecen al genotipo VGI. Sin embargo, la mayoría de las cepas aisladas de muestras clínicas y ambientales en la Columbia 5

6 Británica, Canadá, pertenecen al genotipo VGII. Byrnes y sus colaboradores recientemente descubrieron en el estado de Oregon, EEUU, una nueva cepa VGllc que ha demostrado ser altamente virulenta en experimentos, tanto en macrófagos como en un modelo animal (13). Interesantemente, al utilizar la técnica que permite determinar las huellas de DNA mediante PCR, encontramos que 16 de 17 de las cepas ambientales de C. gattii aisladas en Puerto Rico corresponden al mismo genotipo de Columbia Británica, Canadá (VGII) (14). También son similares, aunque no idénticas, a las cepas aisladas en Sur América y Aruba (comunicación personal con Ed J. Byrnes). Lamentablemente, las referidas técnicas moleculares no están disponibles en el laboratorio clínico convencional, por lo que la clase médica y los profesionales de la tecnología médica todavía dependemos de métodos convencionales para el diagnóstico de la cryptococosis. La caracterización genética de las especies de Cryptococcus es de cardinal importancia para discernir la fuente infecciosa, así como para lograr un mejor entendimiento de las implicaciones concernientes a las manifestaciones clínicas, manejo y prognosis de la cryptococosis. Además, nos permite estudiar la evolución de ambas especies, producto de las variaciones genéticas y fenotípicas que experimentan. Por lo tanto, la incorporación de técnicas moleculares en el diagnóstico de laboratorio de las enfermedades infecciosas debe ser asunto prioritario en la agenda de desarrollo de la tecnología médica. Reconocimientos Han sido muchas las personas que me han acompañado durante estos 33 años de travesía cryptococal. A todas ellas mi reconocimiento. No obstante, deseo expresar mi más sincero y particular agradecimiento a mis maestros y mentores (Dr. Luis Roure- QPD y Dr. Glenn S. Bulmer), quienes me infundieron el amor y la pasión por la micología médica. También a mis alumnos, subgraduados y graduados, tanto del Colegio de Mayagüez, como de los programas de Tecnología Médica de la Universidad Interamericana de P.R., por ser inspiradores y el mejor antídoto contra el anquilosamiento intelectual. 6

7 Figuras Figura 1: Demostración de cápsulas por Cryptococcus en tinta china (A, B y C) y en microscopía Nomarsky (D) Figura 2: Crecimiento de Cryptococcus en el agar de Staib 7

8 Figura 3: Crecimiento de Cryptococcus en el agar de canavanina, glicina y azul de bromotimol (CGB); Cryptococcus gatti a la izquierda y Cryptococcus neoformans a la derecha. Referencias 1. Heitman J, kozel TR, Kwon- Chung KJ, Perfect JR y Casadevall A (2011) Cryptococcus: From Human Pathogen to Model Yeast. Washington, D.C. American Society for Microbiology Press. 2. Ruiz A, Velez D y Fromtling RA (1989) Isolation of saprophytic Cryptococcus neoformans from Puerto Rico: Distribution and variety. Mycopathol 106: Pérez J Aspectos ecológicos y epidemiológicos de Cryptococcus neoformans en Puerto Rico. Masters Degree Thesis. University of Puerto Rico- Mayagüez. 4. Ellis DJ y Pfeiffer TJ (1990) Natural habitat of Cryptococcus neoformans var. gattii. J Clin Microbiol 28: Fraser JA, Giles SS, Wenink EC, Geunes- Boyer SG, Wright JR, et al. (2005) Same- sex mating and the origin of the Vancouver Island Cryptococcus gattii outbreak. Nature 437: Kidd SE, Hagen F, Tscharke RL, Huynh M, Bartlett KH, et al. (2004) A rare genotype of Cryptococcus gattii caused the cryptococcosis outbreak on Vancouver Island (British Columbia, Canada). Proc Natl Acad Sci U S A 101: Byrnes EJ 3rd, Bildfell RJ, Frank SA, Mitchell TG, Marr KA, et al. (2009) Molecular evidence that the range of the Vancouver Island outbreak of Cryptococcus gattii infection has expanded into the Pacific Northwest in the United States. J Infect Dis 199:

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