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Transcripción

1 7gjXZ LVaaVXZ FHE=H7C7 :;B B78EH7JEH?E :; 8?EJ;9DEBE=ß7 <j V evgv Za ZhijY^VciZ *iv# ZY^X^ c

2 Prefacio

3 Prefacio La importancia de la ciencia que están por aplicar a veces se da por sentada ya que los protocolos se han estudiado y se han vuelto a estudiar una y otra vez, de modo que exista una alta probabilidad de que tengan éxito y obtengan el producto molecular deseado. El trabajo que están a punto de realizar se basa en una ciencia desarrollada por científicos galardonados con el Premio Nobel. Werner Arbor, Daniel Nathans y Hamilton Smith recibieron este premio por su trabajo con enzimas de restricción. Stanley Cohen, Paul Berg y Herb Boyer lo recibieron por obtener la primera molécula de ADN recombinante. La molécula de ADN recombinante que ustedes utilizarán va más allá de su trabajo porque emplea el gen de un organismo eucariota, en lugar de uno procariota. Hace apenas unos años, en 1993, Kary Mullis recibió el Premio Nobel por el descubrimiento de la reacción en cadena de la polimerasa, una suerte de química elegante que utilizarán en el Laboratorio 8. De modo que la ciencia que aprenderán durante las próximas semanas es muy importante y continuará teniendo un papel importante en el desarrollo de la biotecnología y la medicina. Su profesor merece buena parte del crédito por hacer que esta experiencia de laboratorio sea posible. Si bien Amgen provee los equipos y suministros necesarios para implementar los laboratorios, para que fuera posible utilizarlos, su profesor ha aportado muchas horas de preparación, a menudo durante las noches y los fines de semana. Si han disfrutado de esta experiencia de laboratorio, recuerden agradecerle a su profesor por haberla hecho realidad. Este programa de extensión educativa es en gran medida el resultado del esfuerzo del Dr. Bruce Wallace, científico de Amgen, que creía fervientemente que la industria de la biotecnología tenía la responsabilidad de contribuir a la educación científica de nuestra sociedad. Antes de su fallecimiento, el Dr. Wallace logró ver su programa de extensión educativa crecer y evolucionar hacia la aventura del descubrimiento que usted está a punto de iniciar. Estamos en condiciones de traer este programa a su establecimiento gracias a varias sociedades importantes: la Fundación Amgen, la Fundación de Pierce College, el Centro de Biotecnología del Condado de Orange/Los Angeles, el Instituto Bio-Bridge (biobridge.ucsd.edu/a1), New England Biolabs, Fotodyne, Invitrogen, Rainin Pipettes, VWR y Bio-Rad. Si tienen alguna pregunta sobre estas prácticas de laboratorio, no duden en enviarme un correo electrónico a la dirección que se indica a continuación. Martin Ikkanda Profesor de Biología Los Angeles Pierce College IkkandMJ@piercecollege.edu

4 Tabla de Contenidos

5 Tabla de Contenidos Tabla de Contenidos Introducción a los microvolúmenes y el pipeteado Análisis de restricción de para y pkan-r Digestión de restricción de para-r Introducción a los plásmidos y las enzimas de restricción Ligación de fragmentos de restricción de para y pkan-r Producción de un plásmido recombinante: para-r Confirmación de la restricción y la ligación utilizando electroforesis en gel de agarosa Confirmación de la digestión de restricción de para-r Transformación de la Escherichia coli con un plásmido recombinante Transformación de la Escherichia coli con para-r Preparación de un cultivo overnight de la Escherichia coli Purificación de mfp a partir de un cultivo overnight Extracción del ADN genómico de células epiteliales bucales a.1 2a a.1 4a a.1 5a

6 Laboratorio 1 Introducción a los microvolúmenes y el pipeteado El propósito de esta práctica de laboratorio es ofrecerles experiencia en el uso de algunas de las herramientas y las técnicas importantes más comunes en la biología molecular y presentarles algunas de las mediciones volumétricas de uso más frecuente en este campo de la ciencia. Se les brindará la oportunidad de practicar algunas de las destrezas que necesitarán para construir una molécula de ADN recombinante. Los instrumentos y suministros que utilizarán durante las próximas semanas son idénticos a los que se utilizan en los laboratorios de investigación. Si bien los fundamentos teóricos sobre los que se han construido la biotecnología y las ciencias de ADN se remontan a principios de 1900, la mayoría de las técnicas de laboratorio empleadas son relativamente recientes. Y, aunque las técnicas que irán aprendiendo en las próximas semanas se han vuelto de rutina en los modernos laboratorios de investigación, son pocos los estudiantes secundarios y universitarios que tienen la oportunidad de experimentar la biología molecular con tal grado de sofisticación. Cada vez que asistan a una clase de química, una de las cosas que notarán rápidamente será las diferencias en las cantidades de reactivos y productos químicos que emplean. En un laboratorio de química típico, los volúmenes se miden en grandes cilindros graduados. Por lo general, las soluciones se miden en volúmenes de 50, 100 ó 200 mililitros (ml). Generalmente, el peso de los elementos sólidos se expresa en gramos (g). En el laboratorio de biología molecular, por lo general los volúmenes se miden en microlitros (µl); donde 1 µl equivale a ml. El peso a menudo se expresa en términos de microgramos (µg) o nanogramos (ng), donde 1 µg equivale a gramo y 1 ng equivale a gramo. Quizás se estén preguntando por qué los biólogos moleculares emplean volúmenes y cantidades de material tan pequeños. El motivo se relaciona con el costo de estos materiales y lo difícil que resulta obtenerlos. Por ejemplo, en el próximo laboratorio recibirán algunos plásmidos diseñados especialmente (ADN). Si este ADN se vendiera por libra, ésta costaría unos 360 millones de dólares. De modo que no se sorprendan si sólo les entregamos una cantidad diminuta de moléculas de ADN. La razón por la que estos productos químicos son tan costosos se relaciona con la dificultad para prepararlos en forma pura. Muchos de estos productos químicos se producen en organismos vivos, como las bacterias, y deben purificarse y separarse de las otras miles de sustancias presentes en la célula. Sin embargo, la biología molecular realmente requiere este nivel de pureza y precisión. A medida que realicen este trabajo de laboratorio, recuerden que están realizando biología molecular como en el mundo real. 1.1

7 Laboratorio 1 Materiales Solución 1 Solución 2 Solución 3 H2O destilada (dh2o) Gel de agarosa al 0.8% (preparado con anterioridad) 1 x NaB (o TBE 0.5x) Tubos de microfuga de 1.5 ml Micropipeta P-20 (2-20 µl) Puntas para pipeta desechables Marcador indeleble Equipo de electroforesis Suministro eléctrico Gradilla plástica para tubos de microfuga Métodos La micropipeta digital Los protocolos de biología molecular exigen la utilización de micropipetas ajustables. Las micropipetas se emplean para verter diferentes volúmenes de líquidos. Si bien los investigadores tienen varios tipos de micropipetas en su mesa de trabajo, estos laboratorios han sido diseñados para utilizar una P-20. Esta pipeta está fabricada para verter entre 2 y 20 µl. Se trata de un instrumento de precisión de alta calidad y es fundamental que aprendan a usarlo correctamente. Les pedimos que lean y sigan estas precauciones: No definan el ajuste por debajo de 2 µl ni por encima de 20 µl, a menos que su profesor se los indique. No usen la micropipeta sin la punta desechable adecuada firmemente ajustada al cilindro. Si no utilizan una punta para pipeta contaminarán el cilindro de la pipeta. Ventana del visor Botón del émbolo Eyector de la punta No dejen la micropipeta con líquido en la punta ni la sostengan con la punta hacia arriba. Si la punta desechable no está bien ajustada al cilindro, el líquido puede caer nuevamente dentro de la pipeta. Eviten que el émbolo haga un chasquido al retirar o eyectar líquido; con el tiempo esto destruirá el pistón. Cilindro 1.2

8 Laboratorio 1 Al aspirar (succionar) una solución, presionen el émbolo hacia la primera marca y bajen la punta de la pipeta por debajo del nivel de la solución de la que están tomando una muestra. Deben sostener el tubo que contiene la solución en la mano a la altura de los ojos. Es importante ver que la solución entre realmente en la punta de la pipeta. Ejercicio de pipeteado Nº 1 Busquen la pantalla en el mango de la micropipeta y observen su configuración. Giren la perilla estriada del mango en el sentido de las agujas del reloj para disminuir el volumen, o en sentido contrario a las agujas del reloj para aumentar el volumen. Al girar esta perilla, cambia la distancia que viaja el émbolo. Las cifras a continuación representan algunas de las configuraciones de la pipeta y los volúmenes de líquido vertido Lentamente suelten el émbolo y dejen que el líquido ingrese a la punta de la pipeta. Asegúrense de no aspirar aire en la punta. Al verter (vaciar) el líquido, coloquen la punta de la pipeta en el tubo que recibirá la solución. Ubiquen la punta de manera que toque la pared interior del tubo y se acerque al fondo. Lentamente empujen el émbolo hacia la primera marca y luego hacia la segunda. Mantengan el pulgar en el émbolo y retiren la punta del tubo en el que están vertiendo el líquido. Esto evitará que vuelvan a aspirar el líquido en la punta de la pipeta. Asegúrense de ver que la solución salga de la punta L 12.4 L 5.5 L 2.0 L Coloquen una punta desechable en el extremo del cilindro de la pipeta. En un movimiento de torsión con el dedo pulgar e índice, verifiquen que la punta esté firmemente ajustada al cilindro. Eviten tocar el extremo de la punta porque pueden contaminarla. Recuerden que la punta debe estar en su lugar al utilizar la pipeta. Coloquen el pulgar sobre el botón que activa el émbolo. Presionen el botón y observen que tiene una marca de detención. Si ejercen un poco más de presión con el pulgar, pueden presionar el botón del émbolo hasta llegar a una segunda marca. En esta marca se introduce un pequeño volumen de aire en la punta para eyectar la solución. Retiren la punta: para ello utilicen el botón eyector de la pipeta y arrójenla a un recipiente de residuos. Si vierten el mismo reactivo en tubos separados y no hay peligro de contaminación cruzada, pueden utilizar la misma punta varias veces. Para evitar la contaminación, es bueno depositar cada reactivo sobre la pared lateral cerca del fondo del tubo de microfuga sin tocar ninguno de los demás reactivos. Esta técnica les permite utilizar la misma punta para verter el reactivo en varios tubos que contengan un reactivo diferente. Al verter un nuevo reactivo, utilicen siempre una punta nueva para evitar la contaminación. 1.3

9 Laboratorio 1 Ejercicio de pipeteado Nº 2 Utilicen un marcador indeleble para rotular los tres tubos de reacción: A, B y C. En la tabla de la página 1.4 se resumen los contenidos de cada tubo, pero sigan las instrucciones que comienzan en el paso 3 para preparar las muestras. Tubo dh 2 0 Solución 1 Solución 2 Solución 3 Volumen total A 2 µl 4 µl 4 µl 10 µl B 2 µl 8 µl 10 µl C 2 µl 8 µl 10 µl Coloquen la micropipeta P-20 en 2 µl y viertan dh2o en los tubos A, B y C. Expulsen la punta en el recipiente de residuos de plástico y reemplácenla por una nueva. Coloquen 4 µl de la solución 1 en el tubo A. Expulsen la punta en el recipiente de residuos de plástico y reemplácenla por una nueva. Utilicen una punta nueva y viertan 4 µl de la solución 3 en el tubo A. Utilicen una punta nueva y viertan 8 µl de la solución 2 en el tubo B. Utilicen una punta nueva y viertan 8 µl de la solución 3 en el tubo C. Guarden los tres tubos para la próxima parte de la experiencia. Comprobación de la precisión y la consistencia del pipeteado Los tubos A, B y C deben contener 10 µl de solución. Preparen su micropipeta P-20 en 10 µl y coloquen una punta nueva en el cilindro. Verifiquen con cuidado el volumen de cada tubo de microfuga. Debe haber 10 µl en cada uno de ellos. Guarden los tubos A, B y C para la próxima parte de la experiencia. 1.4

10 Pipette tip Laboratorio 1 Well TBE buffer Agarose gel Fig. 1.3 Utilización de la electroforesis en gel para separar moléculas La electroforesis en gel es un método en el que se utiliza corriente eléctrica y una matriz de gel (red) para separar moléculas como el ADN y las proteínas. Las moléculas que se separan tienen carga negativa o se cargan negativamente. Con la corriente eléctrica, las moléculas cargadas son atraídas y atraviesan una red del material que separará las moléculas de acuerdo con su tamaño, aunque la forma molecular y el grado de electronegatividad influirán en el movimiento al atravesar el gel. Debido a que las moléculas tienen carga negativa, se trasladarán por el gel hacia el electrodo positivo (rojo). A mayor carga negativa, mayor velocidad en la migración de la molécula. En este laboratorio, su profesor ha preparado un gel compuesto por agarosa, un polisacárido (azúcar compuesto). La agarosa se mezcla con una solución electrolítica llamada borato de sodio (NaB). Esta solución contiene iones que son átomos cargados eléctricamente. Estos iones ayudan a conducir la corriente eléctrica a través del gel. Como las moléculas son atraídas hacia el electrodo positivo, las más pequeñas pueden moverse en esta red de agarosa mucho más rápido que las moléculas más grandes. Por lo tanto, en toda la extensión del gel, las moléculas se separan por tamaño. Su profesor ya ha preparado un gel de agarosa, pero deberán cubrir el gel de agarosa con la cantidad adecuada de la solución reguladora de NaB para que el gel actúe adecuadamente. Dos grupos compartirán un gel. Lleven la cubeta hacia el suministro eléctrico que utilizarán para activar el gel. Add comb Controlen que el gel esté ubicado en la cubeta de modo que los orificios estén ubicados hacia el electrodo negativo (negro). Los colorantes están cargados negativamente Agarose y se moverán hacia el electrodo positivo (rojo). dissolved in elecrophoresis buffer Rellenen la cubeta con solución reguladora de NaB 1x (hay varios envases plásticos que contienen esta solución reguladora en el laboratorio) hasta un nivel que cubra toda la superficie del gel a una profundidad entre 1 y 2 mm. Controlen que el gel esté cubierto con la solución reguladora y que no aparezcan hoyuelos en los orificios; agreguen más solución reguladora si es necesario. Preparen la micropipeta en 10 µl y carguen cada muestra en un orificio separado como lo indica su profesor. Usen una punta nueva para cada muestra. Recuerden que su grupo compartirá este gel. Un grupo cargará sus muestras en tres separaciones a la izquierda mientras que el otro utilizará las tres separaciones a la derecha. Es recomendable que tomen nota de la solución que colocan en cada separación. Al cargar cada muestra, coloquen la punta de la pipeta en el centro y suavemente bajen el émbolo de la pipeta para expulsar lentamente la muestra. Utilicen ambas manos para sostener la pipeta para evitar que se mueva. Dado que sus densidades son mayores que la solución reguladora de NaB, los colorantes se hundirán en los orificios. Solución reguladora de NaB Gel de agarosa Punta para pipeta Orificio Cierren la tapa con firmeza sobre la cámara de electroforesis. Conecten los cables eléctricos al suministro de energía. Asegúrense de que ambos cables estén conectados al mismo canal con el cátodo ( ) al cátodo (negro con negro) y ánodo (+) al ánodo (rojo con rojo). Enciendan el suministro eléctrico y establezcan el voltaje en v. Luego de dos o tres minutos, observen los colorantes para asegurarse de que se estén moviendo hacia el electrodo positivo (rojo). Comenzarán a ver que el colorante púrpura (llamado azul de bromofenol) comienza a separarse del colorante azul (xilenocianol). En aproximadamente 10 minutos, o cuando puedan distinguir los tres colorantes, apaguen el interruptor de energía y desconecten los electrodos del suministro eléctrico. Háganlo tomando el enchufe del suministro eléctrico, no jalando el cable con fuerza. Retiren con cuidado la tapa de la cubeta de gel para que puedan ver mejor los colorantes en el gel. En un papel, registren las bandas o esquema de colores en cada una de las franjas que contienen sus muestras. Utilicen esta información para responder las preguntas en la sección Conclusiones. Dejen los geles en la cubeta de gel. 1.5

11 Laboratorio 1 Conclusiones Los colorantes que separaron utilizando la electroforesis en gel fueron: naranja G (amarillo), azul de bromofenol (púrpura) y xilenocianol (azul). Qué carga eléctrica transportaron estos colorantes? Qué evidencia les permitió arribar a esta conclusión? El tamaño molecular puede cumplir un rol importante en la separación ya que las moléculas pequeñas se mueven por la matriz del gel con mayor rapidez que las moléculas más grandes. El peso formular o molecular de estos colorantes son: naranja G (452.38), azul de bromofenol (669.98) y xilenocianol (538.62). Según sus resultados, les parece que estas moléculas se separaron claramente por el tamaño?... Qué otros factores pueden haber jugado un rol importante en la separación de estos colorantes?... Qué tubo contenía un solo colorante? El A, B o C?... Nombren este colorante.... Al aspirar una solución, por qué es importante ver que realmente la solución ingresa a la punta de la pipeta?... Luego de cargar el gel, permanece alguna solución en los tubos A, B o C?... Cómo se puede explicar que la solución quede en estos tubos?

12 Laboratorio 12 Análisis de restricción de para y pkan-r Los plásmidos son piezas circulares de ADN que se encuentran naturalmente en las células bacteriales. Los plásmidos utilizados en la biología molecular han sido modificados a través de la ingeniería genética para facilitar la clonación de genes y la producción de proteínas (expresión del gen) en bacterias. Los genes resistentes a los antibióticos han sido diseñados en estos plásmidos y funcionan como marcadores seleccionables; es decir, estos genes nos permiten seleccionar las bacterias que albergan los plásmidos de aquéllas que no lo hacen. Si una bacteria contiene un plásmido con un gen resistente a los antibióticos, la bacteria podrá crecer y reproducirse en presencia de ese antibiótico; aquellas bacterias sin el plásmido no podrán crecer. Por lo tanto, se pueden utilizar antibióticos para seleccionar las bacterias que son resistentes y que probablemente tienen un plásmido con el gen resistente de aquellas bacterias que no portan el plásmido. En este laboratorio se utilizarán dos plásmidos: el para contiene un gen de resistencia a la ampicilina, ampr, y el pkan-r contiene un gen con resistencia a la kanamicina, kanr. ubicación específica en este plásmido. La región del para rotulada como p BAD, en el mapa del plásmido, indica el lugar donde la ARN polimerasa necesita unirse para iniciar la transcripción. Los sitios rotulados como BamH I y Hind III representan los lugares de restricción de estas dos enzimas de restricción. Analicen el mapa del plásmido a continuación y ubiquen estos componentes del plásmido. El plásmido pkan-r porta el gen resistente a la kanamicina, kanr, que codifica una fosfotransferasa, enzima que transfiere un grupo de fosfato a la molécula de kanamicina destruyendo sus efectos antibióticos. La kanamicina es un antibiótico que mata a las bacterias evitando que se hagan proteínas. Si una célula no puede sintetizar proteínas, morirá. El gen kanr le otorga resistencia a la kanamicina a las bacterias que absorbió este gen. Además de kanr, el plásmido tiene el gen para la proteína fluorescente mutada, mfp, llamada proteína fluorescente roja rfp. El plásmido pkan-r tiene aproximadamente 5,408 pb de tamaño. El objetivo de este laboratorio tiene tres aspectos: 1) presentar un método comúnmente utilizado para analizar los elementos genéticos del plásmido de ADN; 2) analizar el papel y la naturaleza de las enzimas de restricción; y 3) realizar los primeros pasos para producir una molécula de ADN recombinante. El plásmido para tiene 4058 pares de base (pb) de tamaño. Un par de base sería la adenina:timina o guanina:citosina y es el método más común que se utiliza para expresar el tamaño de las moléculas de ADN. El plásmido tiene el gen ampr, que codifica la proteína betalactamasa, una enzima que destruye el antibiótico de la ampicilina. Así, la betalactamasa le permite a las bacterias reproducirse en presencia de la ampicilina. Además, el para porta un gen para la proteína AraC, una proteína que ayuda a la bacteria a hacer proteínas codificadas por genes insertados en este plásmido. Un gen, incluso uno extraño, se puede expresar (producir) si está dentro de una para a 4058 bp mp r arac P BAD BamH I Hind III pkan-r Ka5408 bp n r rfp Hind III rfp 702 bp BamH I El gen de la proteína fluorescente originalmente fue aislado del Discosoma sp, una anémona de mar encontrada en el océano Indo-Pacífico. El gen en estado natural ha sido mutado mediante un proceso llamado evolución dirigida, de modo que produzca colores que son mucho más brillantes que las proteínas en estado natural. El término en estado natural se refiere al gen original, el que encontraría en la naturaleza. El gen rfp ha sido transformado en un plásmido pkan-r. Observen que el gen rfp de la mfp tiene ambos sitios de restricción: BamH I y Hind III en cada lado. Un sitio de restricción marca la ubicación específica donde la enzima cortará al plásmido de ADN. Si pkan-r se digiere con BamH I y Hind III, el gen rfp se cortará físicamente del plásmido. Durante este laboratorio, sacarán el gen rfp del pkan-r y sacarán el pequeño fragmento de 40 pb del plásmido para utilizando las mismas enzimas. Durante el próximo laboratorio, insertarán el gen rfp en el para generando una molécula de ADN recombinante. 2.1

13 Laboratorio 12 Materiales para (80 ng/µl) pkan-r (80 ng/ µl) Enzimas de restricción (BamH I + Hind III) Solución reguladora de restricción 2.5x Agua destilada, dh2o Micropipeta P-20 y puntas Tubos de microfuga de 1.5 ml Minicentrifugador Baño María a 37 C Marcador indeleble Métodos Preparación de la digestión de restricción de para-r En este protocolo de laboratorio se utilizan las enzimas de restricción BamH I y Hind III para digerir los plásmidos para y pkan-r. Este es el primer paso para fabricar una molécula recombinante de ADN. Consigan los siguientes cuatro tubos de microfuga: para, pkan-r, BamH I y Hind III (mezcla de enzimas) y solución reguladora 2.5x. Tomen cuatro tubos de microfuga de 1.5 ml limpios y utilicen un marcador para rotularlos de la siguiente manera: A + = para + BamH I y Hind III A - = para no digerido (para sin enzima) K+ = pkan-r+ BamH I y Hind III K- = pkan-r no digerido (pkan-r sin enzima) A + = para + enzimas + solución reguladora La matriz de reacción resume los reactivos utilizados en la digestión de restricción. Para preparar la solución de digestión, sigan las instrucciones específicas a partir del paso 4. Tubo A+ A- K+ K- Solución reguladora 2.5x dh 2 0 para 4µL 4µL 4µL 4µL 2µL 2µL 4µL 4µL pkan-r Enzimas Volumen Total 2µL 10µL 10µL 4µL 4µL 2µL 10µL 10µL Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de solución reguladora de restricción 2.5x en todos los tubos. Agreguen 2µl de dh2o a los tubos rotulados A- y K -. Cuál es el objetivo de este paso? Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de para a los tubos rotulados con A+ y A-. Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de pkan-r a los tubos rotulados con K + y K -. Agreguen 2µl de la mezcla de enzimas que contiene BamH I y Hind III, a los tubos A+ y K +. Agreguen las enzimas directamente a la solución en el fondo del tubo de microfuga. Asegúrense de utilizar una punta nueva para cada tubo para evitar la contaminación. Luego de agregar las enzimas, bombeen suavemente la solución hacia adentro y hacia afuera con la pipeta para que se mezclen los reactivos y tapen los tubos. Si hay un minicentrifugador disponible, coloquen los tubos en el rotor, asegurándose de que los tubos estén en una configuración equilibrada y centrifuguen los tubos durante cuatro segundos. Este breve giro combinará todos los reactivos en el fondo de cada tubo. Coloquen los cuatro tubos a baño María a 37 C e incuben durante por lo menos 60 minutos. Luego de los 60 minutos de incubación, la solución de digestión se puede mantener congelada, a 20 C, hasta que sea el momento de la electroforesis. 2.2

14 Laboratorio 12 Conclusiones Analicen los mapas de restricciones de los plásmidos para y pkan-r. Dado que BamH I y Hind III son endonucleasas de restricción específica, cortarán de manera consistente el ADN cuando éste se encuentre con las secuencias de reconocimiento de base seis como se indica a continuación. La ubicación exacta donde se corta se llama sitio de restricción. La molécula de ADN consta de dos cadenas de componentes básicos de nucleótidos. Estos componentes básicos están orientados en dirección opuesta en cada cadena. Por lo tanto, se dice que las dos cadenas que constituyen la molécula de ADN son antiparalelas. Para comodidad, podemos decir que una cadena está orientada en dirección de 5 ( 5 primo ) a 3 ( tres primo ), mientras que la otra cadena está orientada de 3 a 5. Un cuidadoso análisis de las secuencias de restricción revelará que la secuencia de los nucleótidos es un palíndromo, es decir, dice lo mismo en ambas cadenas cuando se lee en dirección 5 3. BamH I 5,...G G A T C C...3, 3,...C C T A G G...5, Hind III 5,...A A G C T T...3, 3,...T T C G A A...5, Por lo tanto, cuando el Hind III se encuentra con esta secuencia de base seis, cortará la hélice de ADN entre las bases de adenina adyacentes. Esto deja cuatro bases no apareadas que forman un extremo cohesivo. 5,...A 3, 3,...T T C G A 5, Extremo cohesivo Extremo cohesivo 5, A G C T T...3, 3, A... 5, Cuál es la secuencia de reconocimiento del BamH I? En una dirección de 5 3, qué secuencia de bases representa los extremos cohesivos de cada uno? Analicen los mapas de plásmidos para y pkan-r y completen lo siguiente: la digestión para producirá fragmentos y tendrá pares de base de largo. la digestión pkan-r producirá fragmentos y tendrá pb y pb de largo. Supongan que reciben un cultivo de bacterias que tiene uno o ambos plásmidos. Diseñen un experimento simple que puedan usar para determinar cuál de estos plásmidos, para o pkan-r, portaba las bacterias del cultivo. 2.3

15 Laboratorio 12

16 Laboratorio 12a Digestión de restricción de para-r Introducción a los plásmidos y las enzimas de restricción ncia de imiento T C C 3, A G G 5, T T C 3, A A G 5, C T T 3, G A A 5, Dos herramientas poderosas pero fundamentales que se utilizan en la biotecnología son las enzimas de restricción y los plásmidos bacteriales. Las enzimas de restricción les permiten a los biólogos moleculares cortar las moléculas de ADN de diferentes organismos y recombinar las piezas moleculares para producir moléculas de ADN recombinantes. Los plásmidos son piezas circulares de ADN que se encuentran naturalmente en las bacterias. Mediante la tecnología del ADN recombinante y las enzimas de restricción, los plásmidos de ADN recombinante se pueden diseñar para que clonen genes o expresen proteínas codificadas por genes. Las enzimas de restricción fueron observadas por primera vez por Werner Arbor en Arbor descubrió que, al parecer, algunas bacterias utilizaban un sistema inmunológico primitivo que no dejaba que el ADN viral se duplicara dentro de la célula huésped infectada. Algunos años más tarde, se descubrió que este mecanismo inmunológico involucraba una clase de proteínas ahora conocidas como enzimas de restricción. El nombre deriva de la capacidad de las enzimas de restringir el crecimiento de los virus en las células bacteriales. Las enzimas de restricción logran esto al romper un enlace en la cadena fosfato-azúcar del ADN viral; las enzimas cortan el ADN viral en pequeños fragmentos. Las enzimas de restricción que se identificaron en primer lugar, al parecer, realizaron la digestión de la molécula de ADN al azar. Posteriormente, se encontraron y purificaron las enzimas de restricción que cortaban la cadena de fosfatoazúcar en un lugar específico o dentro de una secuencia de nucleótidos específica, por lo general, de cuatro a seis nucleótidos de largo. En la Tabla 1 se identifican algunas de estas enzimas de restricción específicas, su origen y las secuencias de nucleótidos que cada una reconoce. En 1978, Daniel Nathans (Universidad Johns Hopkins), Hamilton Smith (Universidad Johns Hopkins) y Werner Arbor recibieron el Premio Nobel de Medicina por su trabajo con las enzimas de restricción. Tabla 1. Enzimas de restricción utilizadas en este laboratorio. indica los sitios donde se corta o se separa la cadena fosfato-azúcar. 2a.1 Origen Bacillus amyloliquefaciens Escherichia coli Haemophilus influenzae Enzima de restricción Secuencia de reconocimiento BamH I 5, G G A T C C 3, 3, C C T A G G 5, EcoR I 5, G A A T T C 3, 3, C T T A A G 5, Hind III 5, A A G C T T 3, 3, T T C G A A 5, Cuando las enzimas de restricción cortan o digieren el ADN, los fragmentos que se obtienen, llamados fragmentos de restricción, poseen varias bases no apareadas que se extienden desde los extremos de corte. Estos son llamados extremos cohesivos. Si las moléculas de ADN de origen diferente se digieren utilizando la misma enzima de restricción, las bases no apareadas de cada pieza deben poder unirse (o recocerse), dado que las bases no apareadas en los extremos cohesivos serán complementarias, A:T y G: C. Este es el único atributo de las enzimas de restricción que les permite a los ingenieros genéticos combinar fragmentos de ADN de diferentes organismos para producir moléculas de ADN recombinante. (a) (b) Figura 1. (a) molécula de ADN con sitios de restricción BamH I y Hind III (en negritas). Las flechas indican los sitios donde las enzimas cortarán la cadena fosfato-azúcar de la molécula de ADN. (b) La molécula de ADN inferior indica la ubicación de los extremos cohesivos (negritas). Los plásmidos bacteriales son piezas circulares relativamente pequeñas de ADN que las bacterias pueden portar además de su ADN genómico (cromosoma único). En la naturaleza, el plásmido de ADN por lo general lleva de uno a varios genes que ayudan a que la bacteria sobreviva, tal vez brindándole resistencia a un antibiótico. Las bacterias pueden pasar a lo largo de los plásmidos durante la conjugación (apareamiento). Las bacterias que utilizamos en el laboratorio han sido mutadas, de manera que no pueden intercambiar plásmidos durante la reproducción sexual. Los plásmidos producidos en forma natural han sido modificados de modo que realicen funciones específicas: por lo general, la clonación y la expresión de genes. En este laboratorio se examina el para-r, un plásmido de ADN recombinante que ha sido modificado para que exprese el gen rfp a fin producir una proteína fluorescente roja mutante (mfp). El plásmido contiene varios elementos de control que le permiten a una bacteria portar este

17 Laboratorio 12a plásmido para expresar un gen extraño. El gen se obtuvo originalmente del genoma del Discosoma sp., una anémona de mar encontrada en el océano Indo-Pacífico. En el mapa de plásmido a continuación se indican algunas de las regiones de control más importantes, arac and PBAD, y la ubicación del gen rfp. Además, se indica la ubicación de los dos sitios de restricción: uno para Hind III y otro para BamH I. Cómo podrían proceder en el corte del gen rfp? arac para-r a4720 bp P BAD mp r BamH I rfp rfp 702 bp Hind III También tengan en cuenta que el plásmido posee un gen de resistencia a los antibióticos: ampr. Este gen le permitirá a la bacteria que porta el plásmido vivir en un ambiente que contenga el antibiótico ampicilina. Materiales para (70 ng/µl) Enzimas de restricción (Bamh I + Hind III) Solución reguladora de restricción 2.5x Agua destilada (dh2o) Micropipeta P-20 y puntas Tubos de microfuga de 1.5 ml Minicentrifugador Baño María a 37 C 2a.2

18 Laboratorio 12a Métodos Digestión de restricción de para-r El objetivo de este laboratorio tiene dos aspectos: 1) analizar el rol de las enzimas de restricción y su importancia en la ingeniería genética; y 2) analizar un plásmido bacterial y cómo se utiliza en la biotecnología. En este protocolo de laboratorio se utilizan las enzimas de restricción BamHI y Hind III para digerir el plásmido recombinante para-r. La digestión de restricción aislará del para el gen rfp de un fragmento más grande del plásmido que contiene ampr, arac y PBAD. En el protocolo se utiliza un para-r de control no digerido, junto con un marcador de tamaño o escala de ADN que lo ayudará a identificar y confirmar el tamaño de los fragmentos de restricción. Preparación de la digestión de restricción de para-r Soliciten a su profesor los siguientes tres tubos de microfuga de 1.5 ml: para-r, mezcla de enzimas y solución reguladora de restricción 2.5x. Coloquen dos tubos de microfuga de 1.5 ml limpios y utilicen un marcador para rotular los tubos de la siguiente manera: A+ y A-. Incluyan su número de grupo y horario de clase en cada tubo de manera que puedan ubicarlos en la próxima clase de laboratorio. La matriz de reacción resume los reactivos utilizados en la digestión de restricción. Para preparar la solución de digestión, sigan las instrucciones específicas a partir del paso 4. Tubo A+ Solución reguladora 2.5x 4µL H 2 O para-r 4µL Mezcla de enzimas 2µL Volumen total 10µL A- 4µL 2µL 4µL 10µL Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de solución reguladora de restricción 2.5x para ambos tubos. Agreguen 2µl de dh2o al tubo rotulado A-. Cuál es el objetivo de este paso? Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de para-r a los tubos rotulados A+ y A-. Lleven el tubo A+ a su profesor, quien verterá la mezcla de enzimas en el tubo o, si se les proporcionó esta mezcla de enzimas, agreguen con cuidado 2 µl de la mezcla de enzimas directamente en la solución del tubo A+ que contiene el plásmido y la solución reguladora. Luego de agregar las enzimas, cubran el tubo y den golpecitos suaves en la parte inferior de cada tubo para mezclar los contenidos. Si hay un minicentrifugador disponible, coloquen los tubos en el rotor, asegurándose de que los tubos estén en una configuración equilibrada y centrifuguen los tubos durante cuatro segundos. Este breve giro combinará todos los reactivos en el fondo de cada tubo. Coloquen ambos tubos a baño María a 37 C e incuben durante por lo menos 60 minutos. Luego de la incubación de 60 minutos, su profesor puede colocar los tubos en el congelador hasta que estén listos para la electroforesis (Laboratorio 4a). Los plásmidos digeridos se pueden conservar a -20 C de manera indefinida. 2a.3

19 Laboratorio 12a Conclusiones Analicen el mapa de restricción del plásmido para-r. BamH I y Hind III son enzimas de restricción específicas y cortarán consistentemente el ADN bicatenario cuando se encuentren con su respectiva secuencia de reconocimiento de base seis que se muestra en la tabla de la página 2a.1. Estas ubicaciones de corte se llaman sitios de restricción. La molécula de ADN consta de dos cadenas de componentes básicos de nucleótidos. Estos componentes básicos están orientados en dirección opuesta en cada cadena. Por lo tanto, se dice que las dos cadenas que constituyen la molécula de ADN son antiparalelas. Por convención, podemos decir que una cadena está orientada en dirección de 5 ( 5 primo ) a 3 ( tres primo ), mientras que la otra cadena está orientada de 3 a 5. Un cuidadoso análisis de las secuencias de restricción BamH I y Hind III revelará que las secuencias de nucleótidos son palíndromos; es decir, dicen lo mismo en ambas cadenas cuando se leen en sentido 5 3 5,...A A G C T T...3, 3,...T T C G A A...5, Por lo tanto, cuando el Hind III se encuentra con esta secuencia de base seis, cortará la hélice de ADN entre las bases de adenina adyacentes. Esto deja cuatro bases no apareadas que forman un extremo cohesivo. 5,...A 3, 3,...T T C G A 5, Extremo cohesivo 5, A G C T T...3, Extremo cohesivo 3, A... 5, Cuáles son las secuencias de reconocimiento de Hind III y BamH I?... En una dirección de 5 3, qué secuencia de bases representa los extremos cohesivos?... Analicen el mapa del plásmido para-r y completen lo siguiente: Cuántos fragmentos de restricción resultarán de la digestión de para con BamH I y Hind III? Cuáles serán las longitudes aproximadas, en pares de base, de estos fragmentos de restricción?... Qué fragmento de restricción llevará el gen ampr?... Qué fragmento de restricción llevará el gen rfp?... Supongan que su profesor les entrega un cultivo de bacterias. El cultivo puede contener bacterias que portan el plásmido para-r o un cultivo que contenga bacterias sin el plásmido. Diseñen un experimento simple que puedan usar para determinar cuál de los dos cultivos les entregó.... 2a.4

20 Laboratorio 3 Ligación de fragmentos de restricción para/pkan-r que producen un plásmido recombinante para-r En este laboratorio los fragmentos de restricción producidos durante el Laboratorio 2 se ligarán o se unirán, utilizando ADN ligasa, formando nuevos plásmidos recombinantes. Estos plásmidos recientemente formados representarán moléculas de ADN recombinante porque los cuatro fragmentos de restricción han sido recombinados de diferentes maneras para producir nuevas construcciones. Por ejemplo, suponga que los cuatro fragmentos de plásmidos se representaron con las letras A, A, K y R, en los que A y A representan los fragmentos para, y K y R representan los dos fragmentos que resultan de la digestión de pkan-r. Los plásmidos se pueden representar con cualquier combinación de dos letras, como AK o A R, y cualquier combinación incluso de fragmentos numerados, como por ejemplo AKA R o ARAAKK y así sucesivamente. Como pueden ver, hay muchos tipos de moléculas recombinantes que pueden resultar de mezclar estos fragmentos de restricción. Como recordarán, las enzimas de restricción que estamos utilizando son BamH I y Hind III. Al cortar los plásmidos en los sitios de restricción BamH I y Hind III se dejan extremos cohesivos. Los extremos cohesivos del ADN cortado pueden ligarse a cualquier otro fragmento de ADN que tenga un extremo cohesivo adicional. Analicen el mapa del plásmido para a continuación para ver las ubicaciones de los sitios de restricción de BamH I y Hind III y los extremos cohesivos que se forman en los extremos de 5 de su fragmento de restricción. Dado que para tiene un sitio de restricción BamH I y otro Hind III, la digestión dejará dos fragmentos. A continuación se representan los fragmentos de restricción. Es importante arac El fragmento más pequeño no porta ningún gen. El plásmido pkan-r tiene un sitio de restricción BamH I y otro Hind III que flanquea el gen rfp. La digestión de pkan-r dejará dos fragmentos, uno será de 4706 pb y el otro, de 702 pb. Con la ligación se unirá cualquiera de los dos extremos cohesivos BamH I con cualquiera de los dos extremos cohesivos Hind III. Deberían poder observar que son posibles combinaciones diferentes de fragmentos. La combinación que nos interesa es la del fragmento recombinado de 4018 pb para (que contiene el gen amp r ) con el fragmento de 702 pb pkan-r (gen rfp). La combinación de estos dos fragmentos proporcionará un plásmido recombinante que llamaremos para-r. pkan-r Ka5408 pb n r rfp Hind III rfp 702 pb BamH I 5, G A T C C 3, G 4706 pb A 3, T T C G A 5, 5 A G C T T G 3, 3 A 702 pb C C T A G 5 La ligación del fragmento de 702 pb pkan-r colocará al gen rfp del plásmido en un lugar que le permitirá a la bacteria sintetizar (expresar) la proteína fluorescente mutante, mfp. para a4058 pb P BAD Inicialmente, los fragmentos de restricción se mantienen juntos por el enlace de hidrógeno entre las bases de los mp r BamH I arac 5, G A T C C 3, G 4018 pb A 3, T T C G A 5, 5 A G C T T G 3, 3 A 40 pb C C T A G 5 recordar que el fragmento de restricción más grande porta el gen amp r, el gen que suministra la resistencia a la ampicilina. 3.1 Hind III para a4720 pb mp r rfp Hind III P BAD rfp 702 pb BamH I

21 Laboratorio 3 ADN ligasa + ATP 5 C T A A G G A T T C 3, T A 5 3, ADN ligasa + ATP nucleótidos que forman los extremos cohesivos. Cabe recordar que la adenina y la timina comparten dos enlaces de hidrógeno mientras que la citosina y la guanina comparten tres. Esto asegura que solamente coincidirán los extremos cohesivos complementarios. Los enlaces de hidrógeno son enlaces químicos débiles y no son adecuados para mantener los extremos cohesivos juntos de manera permanente. La enzima ADN ligasa, con la energía suministrada por ATP, formará enlaces covalentes entre el azúcar y los grupos de fosfato del esqueleto del ADN. En el diagrama a continuación pueden ver las ubicaciones de estos enlaces en cada lado de la molécula de ADN. Cuando se forman los enlaces covalentes, estos completan la unión fosfodiéster entre los dos azúcares y el grupo de fosfato de cada cadena. Los enlaces químicos que resultan constituyen un enlace relativamente fuerte. 5 C T A A G G A T T C 3, T A 5 3, Métodos Materiales para digerido (A+ del laboratorio 2) pkan-r digerido (K+ del laboratorio 2) Solución reguladora de ligación 5x con ATP ADN ligasa T4 en el tubo rotulado Lig Agua destilada Micropipeta P-20 y puntas Baño María a 70 C Gradilla plástica para tubos de microfuga Marcador indeleble Tomen los tubos A+ y K+ de la gradilla que se encuentra en el frente de la clase. Coloquen los dos tubos a baño María a 70 C durante 30 minutos. Esta exposición al calor desnaturalizará (inactivará) cualquier BamH I y Hind III que pudiera estar activo. Por qué es importante esto? Mientras sus tubos se encuentren a baño María, solicítenle a su profesor la solución reguladora 5x y un tubo de ligasa. El tubo de ligasa contiene 2 µl de ADN ligasa. Rotulen este tubo con sus iniciales. Luego de 30 minutos, duración del paso de incubación a 70 C, agreguen 4 µl de A+ directamente en la ligasa de ADN en el fondo del tubo de Ligasa. Utilizando una punta nueva, agreguen 4 µl de K+ a la solución en el tubo de Ligasa. Utilizando una punta nueva, agreguen 3 µl de solución reguladora de ligación 5x directamente en la solución en el fondo del tubo Ligasa. Desechen el tubo de la solución reguladora. Agreguen 2 µl de dh2o al tubo de Ligasa, utilizando una punta limpia. Suave y lentamente muevan el émbolo hacia adentro y hacia afuera para mezclar los reactivos. Realicen este paso sin salpicar la solución en los laterales del tubo de microfuga. En la tabla a continuación se resumen los contenidos del tubo de Ligasa. A+ Solución reguladora K+ de ligación 5x dh 2 O Ligasa Volumen total 4µL 4µL 3µL 2µL 2µL 15µL Si hay gotitas de líquido en los laterales del tubo, centrifuguen brevemente el tubo para combinar los reactivos. Coloquen sus tubos de ligasa, A+ y K+ en las gradillas en el frente de la clase. Su tubo de ligasa permanecerá durante la noche a temperatura ambiente. 3.2

22 Laboratorio 3 Conclusiones Por qué es importante colocar los tubos A+ y K+ a baño María a 70 C antes de preparar la reacción de ligación? Qué creen que podría pasar si se omitiera este paso? Realicen un diagrama para mostrar cómo se unieron los siguientes extremos cohesivos. (: = enlace de hidrógeno) Consulten la página 3.2 para ver el ejemplo de apareamiento de bases. A A G C T T.... T T C G A A Si bien son muchos los plásmidos recombinantes, dibujen tres plásmidos recombinantes posibles. Incluyan dentro de esos tres, la combinación en la que estamos más interesados, la que combina para con el fragmento pkan-r que porta el gen rfp Pueden dos fragmentos rfp unirse y circular en el tubo de ligasa? En la molécula de ADN, hay dos tipos de enlaces químicos: enlaces químicos covalentes y enlaces de hidrógeno. Describan brevemente cómo difieren estos enlaces en cuanto a qué tan fuertes son y en qué parte de la molécula de ADN los encontrará Durante la ligación, cuáles de estos enlaces (hidrógeno o covalente) se forma primero? Dónde se forman? Qué enlaces se forman después y dónde? Para formar qué enlaces se necesita ADN ligasa?

23 Laboratorio 3

24 Laboratorio 14 Confirmación de la restricción y la ligación Uso de electroforesis en gel de agarosa Es importante en esta etapa de nuestro procedimiento experimental que confirmemos que el BamH I y Hind III han digerido los plásmidos pkan-r y para originales, y que los fragmentos de restricción han sido ligados por el ADN ligasa. En este laboratorio se demostrará que tenemos moléculas de ADN recombinantes. La electroforesis en gel es un procedimiento comúnmente utilizado para separar fragmentos de ADN según su tamaño molecular. Como los colorantes que separaron en el Laboratorio 1, los fragmentos de ADN migrarán por el laberinto de la agarosa. El ADN, debido a los grupos de fosfato, tiene carga negativa y se moverá hacia el electrodo positivo (rojo). Dado que es más fácil que las moléculas pequeñas se muevan por la matriz de agarosa, éstas migrarán más rápido que los fragmentos más grandes. Imagínense un grupo de corredores de campo traviesa cruzando una espesa selva tropical. Con todos los demás factores iguales, los corredores de menos altura podrán circular por la espesura de enredaderas que cuelgan y el denso follaje más rápido que los corredores más altos. De manera que los fragmentos más pequeños de ADN se moverán más rápido por la espesura de las moléculas de agarosa que los fragmentos más grandes. Tomaremos todas las muestras de plásmidos: digeridos, no digeridos y ligados, y utilizaremos la electroforesis para separar estas piezas. Tal vez predijeron que sus plásmidos sin cortar producirían solamente una banda de ADN; no hay motivo para pensar lo contrario. Sin embargo, es posible que aparezcan dos o tres líneas en las franjas de plásmidos no digeridos. El motivo de esto es que los plásmidos aislados de las células existen de diversas formas. Una de las formas del plásmido se llama superenrollada. Es posible visualizar esta forma pensando en una pieza circular de tubería plástica retorcida. La torcedura o enrollamiento tiene como resultado una molécula muy compacta, que se moverá por el gel rápidamente debido a su tamaño. Una segunda forma de plásmido es llamada círculo mellado o círculo abierto. Con frecuencia, un plásmido experimentará el rompimiento de uno de los enlaces covalentes ubicados en la cadena de fosfato-azúcar a lo largo de una de las dos cadenas de nucleótidos. El congelamiento y descongelamiento repetido del plásmido u otro tratamiento severo puede causar el rompimiento. Cuando esto ocurre, la tensión acumulada en el plásmido superenrollado se libera a medida que el plásmido enrollado se desenrolla. Esta forma de plásmido circular no se moverá tan fácilmente por el gel de agarosa como la forma superenrollada. Si bien tiene el mismo tamaño, en términos de pares de base, estará ubicado más cerca del orificio que la forma superenrollada. La última forma del plásmido que podemos ver se llama multímero. Cuando las bacterias duplican los plásmidos, éstos por lo general se duplican tan rápido que terminan unidos como los eslabones de una cadena. Si los dos plásmidos se unen, el multímero será dos veces más grande que un solo plásmido y migrará muy lentamente por el gel. De hecho, se moverá más lentamente que el círculo mellado. Sus muestras de pkan-r y para, luego, pueden tener tres bandas que aparecen en el gel. Comenzando muy cerca del orificio, pueden observar que el multímero se desplaza primero, seguido de una banda con forma circular mellada y finalmente una banda superenrollada. Utilizaremos una técnica de tinción especial que nos permite ver los fragmentos incrustados en el gel; luego realizaremos un registro fotográfico del gel para documentar este importante paso. 4.1

25 Laboratorio 14 Materiales Muestras de plásmidos: K-, K+ A-, A+ Plásmido ligado (tubo LIG ) Gel de agarosa al 0.8% Colorante de carga 5x NaB 1x (o TBE 0.5x) Marcador de tamaño del ADN (25 ng/µl) Micropipeta P-20 y puntas Tubos de microfuga de 1.5 ml Aparato de electroforesis Suministro eléctrico Lapicera para marcar Gradilla plástica para tubos de microfuga Métodos Reúnan las cinco muestras de plásmidos y el marcador de ADN que su profesor les brindará y colóquenlos en la gradilla plástica para tubos. Deben tener seis tubos. Consigan cinco tubos de microfuga de 1.5 ml limpios y rotúlenlos de la siguiente manera: A-, A+, K-, K+, y L. El tubo de microfuga con el marcador ya debe estar rotulado. En la siguiente tabla se resume la preparación de la muestra de plásmidos para la electroforesis. Vean los Consejos antes de preparar estos tubos. Tubo A+ A K K+ L Colorante dh 2 0 K- Volumen de carga K+ A- A+ LIG total 4L 2L 4L 10L 4L 4L 4L 3L 2L 2L 2L 2L 4L 4L Consejos: Por ejemplo, al tubo rotulado con A-, agréguenle 4 µl de para-, 4 µl de dh2o y 2 µl de colorante de carga. El colorante de carga debe ubicarse en la gradilla plástica para tubos de microfuga al lado del tubo de dh2o. 4L 5L 10L 10L 10L 10L Si estudian esta tabla, verán que pueden agregar agua a los cinco tubos, luego agregar el colorante de carga a todos los tubos sin cambiar la punta. Luego, viertan la muestra de plásmido en cada tubo, cambiando la punta cada vez para evitar la contaminación. Guarden el tubo LIG que contiene su plásmido ligado; debe haber alrededor de 10µl restante en este tubo. Importante: regresen el tubo LIG a la gradilla con los tubos, en el frente del salón, porque lo necesitarán para el próximo laboratorio. Centrifuguen todas las muestras para combinar los reactivos en el fondo de cada tubo. Asegúrense de que los tubos estén ubicados en una configuración equilibrada. Preparen el gel y la cubeta de electroforesis para recibir las muestras de plásmidos. Asegúrense de que los orificios de gel estén orientados hacia el electrodo negativo (negro). Viertan la solución reguladora de NaB 1x (o TBE 0.5x) sobre el gel hasta que no haya hoyuelos que rompan la superficie de la solución reguladora sobre los orificios. Es importante que el gel esté completamente por debajo de la solución reguladora de NaB. No obstante, es recomendable que no utilicen demasiada solución en la cubeta para permitir que la corriente eléctrica vaya por la solución reguladora y no por el gel. Coloquen sus muestras de plásmidos y el marcador al gel, con la pipeta y las puntas. Continúa en la página siguiente