Colesterol. BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM Enzymatic BioAnalysis/Food Analysis

Transcripción

1 Colesterol Método colorimétrico Para la determinación de colesterol en alimentos y otros materiales Procedimiento simplificado: ver Determinación de colesterol en huevo líquido, etc. (ver Pto. 12) Cat. No Test-Combinado para 31 determinaciones BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM Enzymatic BioAnalysis/Food Analysis Para uso in vitro solamente Almacenar a 2-8 C Esta traducción en español has sido realizada por R Biopharm Latinoamérica con el objeto de ayudar a los usuarios a entender el procedimiento, pero no se actualizan regularmente por lo que no pueden remplazar las instrucciones en inglés. Las instrucciones de uso que son válidas, son aquellas incluidas en cada kit en Alemán y en Inglés, dado que están escritas e impresas por el fabricante (Roche). Refiérase siempre a las instrucciones incluidas en cada kit. Principio (Ref. 1) El colesterol se oxida por la colesterol oxidasa a colestenona (1). (1) Colesterol + O 2 colesterol oxidase 4 -colestenona + H 2 O 2 En presencia de catalasa, el peróxido de hidrógeno producido en esta reacción oxida metanol a formaldehído (2). (2) Metanol + H 2 O 2 catalase formaldehído + 2 H 2 O Este último reacciona con acetilacetona generando un color amarillo en presencia de iones NH 4 + (3). (3) formaldehído + NH acetilacetona laca lutidínica + 3 H 2 O La concentración de la laca lutidínica (3,5-diacetil-1,4-dihidrolutidia) formada es estequiométrica con la cantidad de colesterol y se mide por el incremento de absorbancia de luz en el rango visible a 405 nm. El test combinado contiene 1. Botella 1 con aprox. 95 ml de solución de: Buffer amonio fosfato, ph aprox. 7.0; metanol, 2.6 M; catalasa aprox U 2. Botella 2 con aprox. 60 ml de solución de: acetilacetona, 0.05 M; metanol, 0.3 M 3. Botella 3 con aprox. 0.8 ml de suspensión de colesterol oxidasa, aprox. 12 U 4. Botella 5 con solución control del ensayo de colesterol para control del ensayo (la medición del control no es necesaria para el cálculo de los resultados). Usar la solución control sin diluir (vencimiento: ver etiqueta). Preparación de las soluciones Mezcla de reacción de colesterol (solución 4 del ensayo): Mezclar 3 partes de la solución de la botella 1 con 2 partes de la solución de la botella 2 ajustadas a 20-25ºC (usar botella color caramelo). Dejar reposar la mezcla a 20-25ºC por 1 hora antes de usar. Usar el contenido de la botella sin diluir ( solución 3 del ensayo). Estabilidad de los reactivos El contenido de las Botellas 1, 2 y 3 son estables a 2-8ºC (ver etiqueta). Solución 4 es estable por 3 meses en una botella caramelo a 2-8ºC. El desarrollo de un ligero color amarillo no interfiere con el ensayo. Llevar la solución 4 a 20-25ºC y dejar reposar por 1 h antes de su uso. Procedimiento Longitud de onda: Hg 405 nm Cubeta de vidrio 1 : 1.00 cm de paso de luz Temperatura: 37-40ºC Volumen final: ml Volumen de medida: aprox. 2.5 ml Medir el blanco y la muestra una después de la otra en la misma cubeta contra aire (sin cubeta en el paso de luz) Soluc. de muestra: ug colesterol/ensayo 2 (en ml de volumen de muestra) 1 Si se desea se pueden utilizar cubetas descartables en lugar de cubetas de vidrio. 2 Ver las instrucciones para el rendimiento del ensayo. 3 El residuo que queda en la pipeta se vuelca en el tubo de ensayo que contiene el blanco de muestra. 4 Por ejemplo con Parafilm (marca registrada de American Can Company, Greenich, Ct. USA) ó mejor con una tapa de vidrio. Pipetear en tubos de vidrio Blanco Muestra Solución ml - Solución de muestra* ml - Mezclar el contenido del tubo exhaustivamente Tomar del tubo del blanco 3 y colocar en otro tubo de vidrio ml Solución ml Mezclar exhaustivamente, cubrir los tubos que contienen el blanco y las muestras, e incubar en baño de agua a ºC por 60 min. Dejar enfriar a ºC. Leer las absorbancias del blanco y de las muestras un después de la otra en la misma cubeta contra blanco de aire (ver Pto. 2.8). Sustraer la absorbancia del blanco de la absorbancia de la muestra (= A). * Enjuagar el tip de la pipeta con la solución de muestra antes de dispensar la solución de muestra. Las diferencias en las medidas de absorbancia debe, como regla, ser al menos de unidades de absorbancia para obtener suficiente precisión en los resultados (ver Instrucciones para el rendimiento del ensayo y Sensibilidad y límite de detección, punto 5). Cálculos De acuerdo a la ecuación general del cálculo de las concentraciones: V x MW c = x A (g/l) ε x d x v x 1000 V = volumen final (ml) v = volumen de muestra (ml) MW = peso molecular de la sustancia a ensayar (g/mol) d ε = paso de luz (cm) = coeficiente de extinción de la lutidina a 405 nm = 7.4 (l x mmol -1 x cm -1 ) Considerando la dilución hecha en la mezcla de reacción 2.52 (factor de dilución = 1.008) 2.5 se calcula el contenido de esteroles, calculado como colesterol: x x c = x A = x A (g colesterol. / l de 7.4 x 1.00 x x 1000 sol. de muestra Si la muestra se ha diluido durante la preparación, los resultados deben multiplicarse por el factor de dilución F. Cuando se analizan muestras sólidas ó semisólidas que se pesan para la preparación de la muestra, los resultados se calculan a partir de la cantidad pesadas: c colesterol (g/l de sol. de muestra) Contenido colesterol = x 100 (g/100g) peso muestra en g/l sol. de muestra 1. Instrucciones para el funcionamiento del kit La cantidad de colesterol presente en el ensayo debe ser entre 8 ug y 160 ug. Para obtener una diferencia de absorbancias suficiente, la solución de muestra debe diluirse para dar una concentración de colesterol entre 0.07 y 0.4 g/l /5

2 Tabla de dilución Cantidad estimada de colesterol por litro Dilución con Isopropanol Dilución Factor F < 0,4 g - 1 0,4-4,0 g ,0-40,0 g Información técnica 2.1. Moler muestras sólidas (ej. fideos) y pasar cuantitativamente por un cernidor con < 0.2 mm de malla De las distintas posibilidades de preparación de muestra (ver Pto. 1.1) el procedimiento simplificado (= hervir bajo reflujo en recipiente de 50 ml) es el que se recomienda generalmente (ver Pto. 11 c). Los errores de volumen por calentamiento del recipiente y el volumen desplazado por partes insolubles de la muestra pueden despreciarse El recipiente que se utiliza para hervir bajo reflujo debe poseer un fondo plano. La longitud del agitador magnético debe ser igual al diámetro del fondo del recipiente y la velocidad de agitaron debe ser tal que ni la muestra ni la arena deben permanecer en el fondo para evitar un retrazo en la ebullición Pueden utilizarse pequeños fragmentos de piedra pómez en vez de arena (desplazamiento del volumen aprox. 0.4 ml). Es este aso el desplazamiento del volumen puede despreciarse El hervido bajo reflujo puede hacerse tanto con aun agitador térmico como con un agitador magnético en conjunto con un calentador eléctrico. Se recomienda calentar lentamente para evitar sobrecalentamiento Debe realizarse un experimento de recuperación para control del ensayo. Para detalles ver solución control de colesterol La incubación con colesterol oxidasa no debe realizarse en tubos de plástico dado que el plástico puede absorber colesterol (y los resultados ser muy bajos); además el plástico puede liberar acetaldehído (y los resultados pueden ser muy altos). Se recomienda incubar en tubos de vidrio que están cerrados con tapa de vidrio. No se recomienda tapar con Parafilm (marca registrada de American Can Company, Greenich, Ct. USA) porque pueden hacerse agujeros en el film y el solvente puede evaporarse Cuando se realizan las lecturas fotométricas, se mide A 2 de la muestra contra A 2 del blanco de muestra. (Se omite la lectura de A 1 ) Se recomienda el siguiente procedimiento: Colocar el blanco de la mezcla de reacción en una cubeta seca y medir la absorbancia contra aire. Colocar la solución nuevamente en el tubo del blanco de reacción. Golpear la boca de la cubeta contra papel absorbente. Colocar la solución de muestra en la misma cubeta y enjuagarla con la solución para evitar no homogeneidades. Leer la absorbancia de la solución de muestra contra aire. Usar una cubeta nueva para cada blanco y muestra. No medir el blanco después de la muestra: el resultado puede ser muy bajo debido a contaminación transmisión. Cuando se realiza una serie de mediciones, leer primero todos los blancos y luego todas las muestras (si se va a utilizar solamente una cubeta). La medición del blanco y la muestra en diferentes cubetas solamente es posible cuando el paso de luz de ambas cubetas es absolutamente idéntico a la longitud de onda usada para las mediciones. 3. Especificidad (Re. 1.4) La colesterol oxidasa oxida colesterol y otros esteroles en los cuales el grupo hidroxilo en el carbono 3 está en la posición β (excepto lanosterol). Por lo tanto los fitoesteroles, como stigmasterol y sitosterol también reaccionan en el ensayo. Esto debe tenerse en cuenta cuando se calcula el contenido del huevo en alimentos que contienen huevo. La Comisión de Aceites, Grasas y Derivados de la Comisión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) recomienda expresar el contenido total de colesterol arbitrariamente como colesterol (peso molecular g/ mol) para grasa animal ó como β-sitoesteroles (peso molecular g/mol) para grasas vegetales (Ref. 2.1). Tabla: Contenido promedio de esteroles de aceites vegetales (Ref. 3.11) semilla poroto Compuesto Girasol maní de maíz oliva palma de soja algodón Colesterol 0,5 6,2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Brassicasterol 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Campesterol Stigmasterol ,5 42 β-sitosterol Avenasterol ,5 7 -Stigmasterol 298 0,5 92 0,5 96 0, Avenasterol ,5 24-Metilen-cicloartenol 204 0,5 53 0, ,5 datos en mg/kg 4. Exactitud de la medición En el análisis de colesterol comercial, se han obtenido valores de 92 ± 1.8%. La medición del Material Estándar de Referencia 911b del National Bureau of Standards, Washington D.C., USA, dió 99 ± 0.5% (Ref. 1.3). La especificidad del método enzimático (ver pto. 3) ha sido considerado en la evaluación de los datos: en el análisis de muestras animales, el método enzimático es relativamente específico porque los sustratos de las reacciones no-específicas prácticamente no están contenidos en las muestras. En el análisis de muestras vegetales ó en mezclas de muestras animales y vegetales, se tiene que tener en cuenta que un número de esteroles vegetales también reaccionan (Ref. 1.4). En la comparación de los datos del contenido de colesterol a partir de procedimientos analíticos diferentes, deben tomarse en cuenta las diferentes selectividades. El rendimiento de experimentos de recuperación (ej. el análisis de la muestra con y sin agregado de material estándar) se recomienda para propósitos de control del ensayo. Para detalles ver pto. 9.2 y la información sobre solución control del ensayo de colesterol. 5. Sensibilidad y límite de detección (Ref. 1.2) La mínima diferencia en absorbancia para el procedimiento es de unidades de absorbancia. Este valor corresponde a un volumen de muestra v = ml de una concentración de colesterol de 7 mg/l de solución de muestra. El límite de detección de 20 mg/l deriva de la diferencia de absorbancia de y un volumen de muestra de v = 400ml. 6. Linealidad La linealidad de la determinación es desde 8 ug colesterol/ensayo (20 mg colesterol/l de solución de muestra, volumen de muestra v = ml) hasta 160 ug colesterol/ensayo (0.4 ug colesterol/l de solución de muestra; volumen de muestra v = ml). 7. Precisión En una determinación por duplicado utilizando una única solución de muestra, pueden obtenerse diferencias de a unidades de absorbancia. Con un volumen de muestra de v = ml, esto corresponde a una concentración aproximada de colesterol de 7-15 mg/l. (Si la muestra se diluye durante la preparación, el resultado debe multiplicarse por el factor de dilución F. Si la muestra se pesa durante la preparación, ej. usar 1 g de muestra /100 ml = 10 g/l, se puede esperar una diferencia aprox. de g/100 g). En la literatura se han publicado los siguientes datos: x = 0.05 μmol/ensayo CV = 1.05 % n = 18 in series x = 0.2 μmol/ensayo CV = 0.80 % n = 18in series x = 0.5 μmol/ensayo CV = 1.46 % n = 18 in series (Ref. 1.3) Huevo entero en polvo: x = 1665 mg/100 g r = 111 mg/100 g R = 172 mg/100 g s (r) = 39 mg/100 g s (R) = 61 mg/100 g (Ref 2.2) 8. Interferencia / Fuentes de error La solución de hidróxido de potasio metanólica usualmente contiene estabilizadores que pueden inhibir a la colesterol oxidasa. Por ello, la solución de hidróxido de potasio metanólica debe prepararse fresca por cada usuario. Para esto diluya KOH acuoso (10 M; A.R.) con 9 volúmenes de metanol (A.R.) /5

3 Los alcoholes no interfieren en la reacción aún en exceso. Tampoco sustancias reductoras como ácido ascórbico, dióxido de azufre (hasta 50 ug SO 2 /ensayo) afectan la determinación de acetaldehído. 9. Reconociendo interferencias durante el desarrollo del ensayo 9.1 Se pueden reconocer errores de operatividad ó interferencia de la determinación por la presencia de sustancias presentes en la muestra realizando una doble determinación utilizando dos volúmenes diferentes (ej ml y ml): las diferencias medidas de absorbancia deben ser proporcionales a los volúmenes de muestra utilizados. Cuando se analizan muestras sólidas, se recomienda usar distintas cantidades (ej. 1 g y 2 g). Las diferencias medidas de las absorbancias y los pesos de las muestras utilizados deben ser proporcionales para volúmenes idénticos de muestra. 9.2 La extracción insuficiente de la muestra y posibles pérdidas durante la determinación se pueden reconocer llevando a cabo ensayos de recuperación: la muestra debe prepararse y analizarse con y sin el agregado de material estándar. El material agregado debe recuperar cuantitativamente dentro del rango de error del método (para detalles ver ensayo de solución control de colesterol ). Colesterol. 10. Riesgo de los reactivos La botella 1 contiene aprox. 8 g de metanol en aprox. 100 ml de solución acuosa; la botella 2 contiene aprox. 0.6 g de metanol y aprox. 0.3 ml de acetil-lactona en aprox. 60 ml de solución acuosa; la botella 5 contiene aprox. 32 ml de isopropanol. El metanol en las concentraciones a.m. es riesgoso para la salud, para aspirar ó para ingerir; el isopropanol es inflamable. Luego de su utilización, los reactivos pueden descartarse con el descarte del laboratorio, pero deben siempre observarse las regulaciones locales. El material de empaque puede descartarse con los desechos para reciclar. 11. Información general sobre preparación de muestra Muestras semisólidas ó pastosas deben homogeneizarse suficientemente; muestras sólidas deben molerse y pasarse cuantitativamente por una saranda con malla de < 0.2 mm. El colesterol debe disociarse de la matriz de la muestra; sus ésteres deben hidrolizarse en álcali. Estas son la posibilidades para la determinación de colesterol total: a) Hervido bajo reflujo con solución de hidróxido de potasio metanólica, filtrado del sobrenadante por medio de filtro (cuando se usa un recipiente Potterat-Eschmann) seguido del hervido del residuo dos veces bajo reflujo con isopropanol y nuevo filtrado, colección del los filtrados en recipientes volumétricos. b) Hervido bajo reflujo en recipiente de 50 ml de fondo redondo con solución de hidróxido de potasio metanólica, transferencia del sobrenadante a un recipiente de 25 ml, seguido del hervido del residuo dos veces bajo reflujo con isopropanol y transferencia del sobrenadante al mismo frasco volumétrico. c) Hervido bajo reflujo en un recipiente volumétrico de 50 ml con solución metanólica de hidróxido de potasio en presencia de isopropanol ( procedimiento simplificado ). Esta técnica de trabajo se recomienda generalmente, especialmente si no se dispone de un recipiente Potterat-Eschmann y si no es posible transferir un sobrenadante claro. En la determinación de colesterol libre, la muestra se disuelve en isopropanol y se extrae con isopropanol. Los compuestos no disueltos se remueven por filtración. Los ácidos grasos se pueden remover por acidificación de la muestra en frío. Si esto no es suficiente (la solución de muestra sigue siendo turbia), IUPAC recomienda el uso de un pequeño volumen de muestra (ver Ref. 2.1). Los colorantes en los aceites vegetales como por ej. en aceite de palma crudo, pueden removerse con carbón activado: 5% del peso de la muestra (ver Ref. 2.1). En muestras con baja concentración de colesterol, se somete a la muestra a hervido bajo reflujo con hidróxido de potasio y luego extracción con éter/éter de petróleo (1:1) a 20-25ºC. Luego la fase orgánica se evapora y el residuo se disuelve en isopropanol (Ref. 3.8). 12. Ejemplos de aplicación Determinación de colesterol en fideos Pesar exactamente 2 g de fideos que puedan molerse a polvo en un molinillo y pasar cuantitativamente a través de una saranda (tamaño maíz: max. 0.2 mm) dentro de un recipiente de 50 ml con fondo redondo. Agregar 1 g de arena marina y calentar por 25 min con solución fresca de hidróxido de potasio metanólica (1.0 M, ver pto. 8) bajo condensador de reflujo con agitación (agitador magnético). Transferir la solución sobrenadante a un recipiente volumétrico de 25 ml con pipeta. Hervir el residuo dos veces con porciones de isopropanol de 6 ml cada una, bajo condensador de reflujo por 5 min. Colectar las soluciones en el recipiente volumétrico, dejar enfriar a C, llevar a volumen con isopropanol y mezclar. Filtrar las soluciones turbias por papel de filtro. Usar la solución clara para el ensayo.. Contenido de esterol, calculado como colesterol en 100g de fideos en [mg/100 g] 100 x 25 = contenido de esterol de la sol. de muestra en [g/l] x donde = peso de la muestra en gramos. Se puede utilizar un recipiente Potterat-Eschmann en reemplazo del de 50 ml con fondo Redondo. Cuando se utiliza el procedimiento simplificado (ver Determinación de colesterol en huevo líquido, yema de huevo y huevo deshidratado ) pesar aprox. 4 g de la muestra molida. Cuando se calcula el contenido de huevo en fideos a partir del contenido de esteroles de la muestra, es necesario tomar en consideración el promedio del contenido de fitoesteroles del material libre de huevo. Los resultados obtenidos de acuerdo al presente método se corresponden bien con los resultados del método de Acker and Greve (Ref. 3.1) recomendado por el Bundesgesundheitsamt (Federal Health Department), Berlin (Ref. 3.2). En el caso de pretratamiento ácido (AOAC método no , Ref. 3.4) el contenido de esteroles que se obtiene es mas alto, aprox 10 mg mas de esterol (calculado como colesterol) por 100 g de peso seco de fideos, como fue hallado por Dresselhaus and Acker, (Ref. 3.5, 3.6). Esto es causado por la hidrólisis de los glicósidos de fitoesteroles. Se ha reportado que el contenido promedio de contenido de huevo, determinado con el método de la digitonina es menor que el encontrado anteriormente [en vez de 2.93%, se encontró sólo 2.55% (Ref. 3.5, 3.6) ó 2.45%, respectivamente (Ref. 3.7) en yema de huevo deshidratada, que corresponde a alrededor de mg de colesterol/16g de yema de huevo]. Si se utiliza la tabla de las referencias 3.5 y 3.6 en el cálculo del contenido de huevo en fideos durum, se deben agregar 10 mg esterol/100 mg de peso seco de fideos durum al valor obtenido por método enzimático debido al diferente método de pretratamiento. Contenido de huevo: huevos/kg harina, semolín Contenido total de esteroles en mg/100g peso seco de fideos hechos con harina "durum" Procedimiento Digitonina luego de hidrólisis ácida (Ref. 3.5, 3.6) Determinación enzimática luego de hidrólisis alcalina El contenido de huevo de los fideos se puede calcular con alta precisión cuando la harina/semolín que se utilizó para la preparación de los fideos se analiza enzimáticamente en paralelo con la muestra de fideos. En este caso, el contenido de fitoesteroles de la harina/semolín puede tomarse en cuenta. Nota importante: El procedimiento (preparación de muestra por hidrólisis alcalina) no puede utilizarse en el análisis de fideos precocidos ( spätzle ). Determinación de colesterol en mayonesa y remoulade Pesar aprox. 1 g de mayonesa ó remoulade con 1 g de arena de mar en un recipiente de 50 ml con fondo redondo. Agregar 10 ml de solución metanólica de hidróxido de potasio (1.0 M) preparada fresca y calentar bajo condensador de reflujo por 25 min con agitación (agitador magnético). Transferir el sobrenadante a un recipiente de 25 ml con pipeta. Hervir el residuo dos veces con porciones de isopropanol de 6 ml cada una bajo condensador de reflujo por 5 min. Colectar las soluciones en el frasco volumétrico, permitir que enfríe. Llevar a volumen con isopropanol y mezclar. Filtrar las soluciones turbias a través de un filtro. La solución clara se utiliza en el ensayo. Contenido de esterol de mayonesa en [mg/100 g], calculado como colesterol /5

4 100 x 25 = contenido de esterol de la sol. de muestra en [g/l] x donde = peso de la muestra en gramos. Para determinar el contenido de yema de huevo en mayonesa (remoulade) del contenido de esteroles de la muestra, es necesario considerar el promedio de fitoesteroles de la grasa vegetal contenida (Ref. 3.3) % esteroles % esteroles Aceite ó grasa total libre Aceite ó grasa total libre Aceites vegetales Aceite de castor Aceite de maní Manteca de cacao Aceite de maní partido Aceite de coco Aceite de calabaza Aceite de algodón Aceite de nabo Aceite de linaza Aceite de azafrán Aceite de maíz Aceite de sésamo Aceite de oliva Aceite de soja Aceite de palma Aceite de soja partida Aceite de núcleo de palma Aceite de girasol Cuando se utiliza el procedimiento simplificado (ver Determinación de colesterol en huevo líquido, yema de huevo y huevo deshidratado ), pesar exactamente 2 g de muestra. Determinación de colesterol en licor de huevo Pesar aprox. 1 g de licor de huevo en un recipiente de 50 ml con fondo redondo. Agregar 1 g de arena de mar y calentar por 25 min con 10 ml de solución metanólica de hidróxido de potasio (1.0 M) preparada fresca bajo condensador de reflujo con agitación (agitador magnético). Transferir el sobrenadante a un recipiente de 25 ml con pipeta. Hervir el residuo dos veces con porciones de isopropanol de 6 ml cada una bajo condensador de reflujo por 5 min. Colectar las soluciones en el frasco volumétrico, permitir que enfríe, diluir hasta la marca con isopropanol y mezclar. Filtrar las soluciones turbias a través de un filtro. La solución clara se utiliza en el ensayo. Para calcular el contenido de huevo del contenido de esteroles de la solución de muestra, el promedio de la concentración de colesterol de aprox 200 mg colesterol/yema de huevo (16 g) se tiene que tomar como base (Ref ). Con este valor se obtiene: Huevos (yema de huevo)/l licor de huevo 1000 x 25 x D = contenido de esterol de la sol de muestra x x 200 donde = peso de la muestra en gramos D = gravedad específica del licor de huevo. Cuando se utiliza el procedimiento simplificado (ver Determinación de colesterol en huevo líquido, yema de huevo y huevo deshidratado ), pesar exactamente 2 g de muestra. Determinación de colesterol el manteca de cerdo (colesterol total) Pesar exactamente 2 g de muestra en un recipiente de 50 ml de fondo Redondo. Agregar 10 ml de solución metanólico de hidróxido de potasio (1.0 M) y calentar bajo condensador de reflujo por 25 min. Dejar enfriar, transferir el contenido con pipeta a un recipiente de 25 ml. Enjuagar el frasco de fondo redondo con isopropanol y transferir dichos enjuagues también al recipiente. Agregar 1 ml de HCL (8 M) y llevar a volumen con isopropanol. Colocar en baño de agua por 10 min. Los ácidos grasos precipitan. Filtrar la solución turbia rápidamente a través de un filtro. El filtrado se utiliza inmediatamente para el ensayo. Luego de mezclar la solución 4 con la solución de muestra aparece una ligera turbidez. Para remover la turbidez, colocar el tubo de ensayo por 10 min en baño de agua a 37 ºC ó agregar 5 ml de KOH (1 M), mezclar y continuar con el análisis. La alteración del volumen debe tenerse en cuenta para el cálculo. b) Colesterol libre: Homogeneizar aproximadamente 10 g de salchicha. Pesar exactamente 1 g y extraer 3 veces a C por agitación con isopropanol, porciones de 5 ml cada una. Filtrar a un recipiente de 25 ml. Agregar 5 ml de HCL (8 M), llevar a volumen con isopropanol y llevar a refrigerador por 20 min para separar la grasa. Filtrar y utilizar la solución clara para el ensayo. Determinación de colesterol en huevo líquido, yema de huevo y huevo deshidratado (procedimiento simplificado) Pesar exactamente 1 g de huevo líquido, 0.5 g de yema de huevo ó 0.25 g de huevo deshidratado respectivamente en un recipiente de 50 ml y agregar 1 g de arena de mar (el desplazamiento del volumen de ml debe tomarse en cuenta en el cálculo de la fórmula), calentar bajo condensador de reflujo por 30 min con 20 ml de solución metanólica de hidróxido de potasio (1.0 M) preparada fresca y 10 ml de isopropanol mientras se agita (con agitador magnético). Dejar enfriar la solución turbia, y llevar a volumen con isopropanol a C luego de remover la varilla magnética (enjuagar con isopropanol); mezclar, filtrar a través de un filtro y usar la solución clara para el ensayo. Cálculos: Contenido de esteroles de huevo en [mg/100 g], calculado como colesterol 100 x 49.6 = contenido de esteroles en la sol. de muestra [g/l] x donde = peso de la muestra en gramos. Determinación de colesterol en crema de leche Ref. 3.8) Pesar exactamente 5 g de crema de leche en un recipiente de 250 ml de fondo redondo, calentar por 30 min bajo condensador de reflujo con 50 ml de solución metanólica de hidróxido de potasio (2.0 M) preparada fresca mientras se agita (con agitador magnético). Transferir la solución todavía tibia con 100 ml de agua bidestilada en un embudo de separación de 1000 ml. Luego de enfriar a 20-25ºC, agitar con 100 ml de éter/éter de petróleo (1+1). Luego de 20 a 30 min pasar la capa inferior claramente separada a un recipiente de saponificación y transferir la fase orgánica en un recipiente de 500 ml con fondo redondo. Esta extracción debe repetirse dos veces. Las fases de éter/éter de petróleo colectadas son luego evaporadas en evaporador rotatorio a 35ºC y el residuo se transfiere con isopropanol a un recipiente de 50 ml. Se lleva a volumen con isopropanol a 20-25ºC y se filtra. Usar la solución clara para el ensayo. El contenido de esterol de la grasa de leche (crema) en [mg/100 g], calculado como colesterol 100 x 50 = contenido de esterol de la sol de muestra [g/l] x donde = peso de la muestra en gramos. 13. Otras aplicaciones El método también puede utilizarse para el análisis de cosméticos. Para la determinación de colesterol en champú de huevo ver König, H. & Walldorf, E. (1979) Fresenius Z. Anal. Chem. 299, 1-18; para la determinación de colesterol en productos cosméticos, que se preparan con cera de lanas y alcoholes de cera de lanas, ver Orlick, B. & Montag, A. (1982) Mitt. Lebensm. Chemie u. gerichtl. Chemie 36, Determinación de colesterol en salchicha de hígado a) Colesterol total: Pesar exactamente 2.5 g de salchicha en un recipiente de 50 ml de fondo redondo. Agregar 1 g de arena de mar y 10 ml de solución metanólica de hidróxido de potasio (1.0 M) preparada fresca. Calentar bajo condensador de reflujo por 25 min mientras se agita (Agitador magnético) Transferir la solución a un recipiente de 25 ml con pipeta. Hervir el residuo dos veces con porciones de isopropanol de 6 ml cada una, bajo condensador de reflujo por 5 min. Colectar las soluciones en el recipiente y dejar enfriar. Llevar a volumen con isopropanol y mezclar. Filtrar por filtro y usar la solución clara para el ensayo /5

5 Referencias 1.1 Röschlau, P., Bernt, E. & Gruber, W. (1974) Enzymatische Bestimmung des Gesamt- Cholesterins im Serum, Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. 12, Kageyama, N. (1971), Clinica Chimica Acta 31, Beutler, H.-O., Michal, G. (1976) Eine Eigehaltsbestimmung für die Routineanalytik: Enzymatische Bestimmung von Cholesterin, Getreide Mehl Brot 30, Wortberg, B. (1975) Zur Spezifität der Cholesterinoxidase für die enzymatische Cholesterinbestimmung, Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 157, International Union of Pure and Applied Chemistry, Applied Chemistry Division, Commission on Oils, Fats and Derivatives: Standard Methods for the Analysis of Oils, Fats, and Derivatives, 7th Revised and Enlarged Edition (1987) Determination of the total sterols content, prepared for publication by Paquot, C. & Hautfenne, A., pp ; Blackell Scientific Publications Oxford London Edinburgh Boston Palo Alto Melbourne 2.2 Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 35 LMBG; Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung des Cholesteringehaltes in Eiern und Eiprodukten, (Dezember 1992) 2.3 Scheizer. Lebensmittelbuch, Kapitel 32 (Spirituosen)/11: Bestimmung des Eigehaltes, enzymatisch; Kapitel 22 (Diätetische Lebensmittel und Speziallebensmittel), Provisorische Methode der Subkommission 5 (1990) 3.1 Acker, L., Greve, H. (1964) Untersuchungen über Sterine in Eierteigaren und ihre quantitative Bestimmung (I. Die gravimetrische Bestimmung der Sterine), Z. Lebensm. Unters. Forsch. 124, Bundesgesundheitsblatt (1962) 5, Pardun, H. (1969) Analyse der Fette und Fettbegleitstoffe im Handbuch der Lebensmittelchemie IV, S. 777, Springer Verlag Berlin Heidelberg Ne York 3.4 Official Methods of Analysis of AOAC, 11th ed. Washington (1970) pp Dresselhaus, M., Acker, L. (1974) Zur Bestimmung des Eigehaltes in Eierteigaren -Überprüfung der Methodik, Getreide Mehl Brot 28, Dresselhaus, M., Acker, L. (1974) Zur Methodik der Bestimmung des Eigehaltes in Eierteigaren, Mitteilungsblatt GDCh-Fachgruppe Lebensmittelchemie u. gerichtl. Chemie 28, Wenker, K., Herrmann, H. (1975) Zusammensetzung von Hühnereiern des Handels, Mitteilungsblatt GDCh-Fachgruppe Lebensmittelchemie u. gerichtl. Chemie 12, Grossmann, A., Timmen, H., Klostermeyer, H. (1976) Die enzymatische Bestimmung von Cholesterin in Milchfett - eine Alternative zu den bisher gebräuchlichen Methoden, Milchissenschaft 31, Shen, Ch.S.J., Chen, I.S. & Sheppard, A.J. (1982) Enzymatic determination of cholesterol in egg yolk, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 65, Karkalas, J., Donald, A.E. & Clegg, K.M. (1982) Cholesterol content of poultry meat and cheese determined by enzymatic and gas-liquid chromatography methods, J. Food Technol. 17, Belitz, H.-D. & Grosch, W. (1992) Lehrbuch der Lebensmittelchemie, 4. Auflage, Seite 210, Springer-Verlag Berlin Heidelberg Ne York London Paris Tokyo Hong Kong Barcelona Budapest 3.12 Littmann-Nienstedt, S. (1993) Ausertung des Ringversuches der 35- Arbeitsgruppe Ei-Analytik" zur Bestimmung von Cholesterin in Eiprodukten, Deutsche Lebensmittel-Rundschau 89, Lücker, E. & Bülte, M. (1997) Verfahren zum Nacheis von im Hinblick auf die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) unerünschten Zutaten in Fleisch- Erzeugnissen, 1. Enzymatische Cholesterinbestimmung als Schnellverfahren zur Erfassung von Hirngeebe, Fleischirtschaft 77, Solución control de colesterol del ensayo (Botella 5) Concentración: 1.00 mg colesterol/ml La solución control de colesterol es una solución de colesterol en isopropanol. Sirve como solución de control del ensayo para la determinación enzimática de colesterol en alimentos y otros materiales. Aplicación: 1. Adición de la solución control de colesterol a la mezcla de reacción: En lugar de la solución de muestra, pipetear en el tubo de ensayo: Solución control del ensayo: ml Isopropanol: ml. Esto corresponde a una solución control del ensayo diluida de 0.25 mg de colesterol/ml; la mezcla de reacción contiene 100 μg de colesterol de la solución control del ensayo. 2. Adición de solución control de colesterol al ensayo antes de la saponificación de los ésteres: Antes de la saponificación de los ésteres de colesterol, agregar 5.0 ml de solución control de colesterol a la mezcla de reacción con solución de hidróxido de potasio metanólica (1 M) preparada fresca. Saponificar la muestra de manera usual por calentamiento bajo condensador de reflujo como se menciona bajo Instrucciones para la preparación de la muestra. Luego de la saponificación, llevar la solución hasta 25 ml y usar ml para el ensayo. De esta forma, la mezcla de reacción contiene 80 μg de colesterol de la solución control del ensayo agregada. Calidad del estándar El colesterol utilizado en la solución control del ensayo es controlado contra el Material Estándar de Referencia 911b (Standard Reference Material 911b) del the National Bureau of Standards, Washington D.C., USA /5