West Nile Virus IgG DxSelect (Español)

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1 West Nile Virus IgG DxSelect (Español) Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) Código del producto EL0300G Rev. K Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas indirecto para la detección cualitativa de anticuerpos IgG séricos humanos contra el virus del Nilo Occidental Para diagnóstico in vitro INDICACIONES DE USO El ELISA de IgG para el virus del Nilo Occidental de Focus Diagnostics está indicado para la detección cualitativa de anticuerpos de clase IgG contra el virus del Nilo Occidental en el suero humano. Junto con el ELISA de captura de IgM para el virus del Nilo Occidental, el análisis está indicado para la evaluación de personas con síntomas de meningoencefalitis, como una ayuda en el diagnóstico de laboratorio presuntivo de infección por el virus del Nilo Occidental. Los resultados positivos deben ser confirmados mediante una prueba de neutralización, o siguiendo las pautas vigentes de los CDC (sigla en inglés de Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades) para el diagnóstico de la encefalitis del Nilo Occidental. 1 Esta prueba no está indicada para la autoevaluación ni está aprobada por la FDA para el análisis de donantes de sangre o plasma. No se han determinado las características de rendimiento de la prueba en instrumentos automáticos. Precaución: se ha observado reactividad cruzada con algunas muestras que contienen anticuerpos contra el citomegalovirus (CMV). En el informe de los resultados de la reacción debe incluirse una nota de advertencia sobre la posible reactividad cruzada con el CMV y los bunyavirus, p. ej. el virus de LaCrosse. RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA La mayoría de las personas infectadas con el virus del Nilo Occidental (WNV, West Nile Virus) no presentan ningún tipo de manifestación clínica. Los especialistas estiman que un 20% de las personas que contraen la infección desarrollarán fiebre del Nilo Occidental: síntomas leves que comprenden fiebre, dolor de cabeza y del cuerpo, ocasionalmente acompañados de un exantema en el tronco del cuerpo e inflamación de los ganglios linfáticos. 2 Los síntomas de una afección leve generalmente duran unos pocos días. Aproximadamente 1 de cada 150 infecciones por el virus del Nilo Occidental (<1%) causan una meningitis o una encefalitis. 2 Las tasas de casos mortales en los pacientes hospitalizados durante brotes recientes han variado entre un 4 y un 14%. 3 El factor de riesgo de muerte más importante es la edad avanzada; los pacientes mayores de 70 años se encuentran en riesgo particularmente alto. La tasa de mortalidad del WNV es similar a la del virus de la encefalitis de St. Louis (SLE, St. Louis encephalitis virus) y a la del virus de la encefalitis equina del oeste (WEE, Western equine encephalitis) (5-15%) pero mucho menor que la de la del virus de la encefalitis equina del este (EEE, Eastern equine encephalitis) (30-70%) y mayor que la del virus de LaCrosse (LAC) (<1%). 4,5 El WNV es un arbovirus. Los arbovirus son zoonóticos y su transmisión se produce mediante ciclos vitales complejos que comprenden un vertebrado (p. ej. pájaros) y un artrópodo (p. ej. mosquitos). 3 Los humanos y los animales domésticos pueden desarrollar la enfermedad clínica pero generalmente constituyen huéspedes tipo "callejón sin salida" porque en ellos no se produce una viremia importante. En la mayoría de los casos no hay transmisión de la infección de persona a persona. Hay dos maneras principales de prevenir las infecciones por arbovirus: medidas de protección personal para reducir el contacto con mosquitos y medidas de salud pública para reducir la población de mosquitos infectados en el ambiente. 2 El WNV puede detectarse mediante su cultivo, o mediante la detección de antígeno viral o de ácidos nucleicos virales en el líquido cefalorraquídeo, tejidos, sangre u otros líquidos corporales. Si bien los resultados positivos de un cultivo o de las pruebas de detección de ácidos nucleicos son altamente específicos, los especialistas no recomiendan su uso para cribado (screening) debido a su baja sensibilidad. 2 Los CDC notifican que a pesar de que la respuesta de anticuerpos frente a la infección por WNV en humanos no ha sido estudiada a fondo o sistemáticamente, las siguientes aseveraciones son suposiciones razonables, de acuerdo con la amplia experiencia con otros flavivirus y con las conclusiones preliminares basadas en las observaciones empíricas realizadas durante las epidemias de 1999 y 2000: Anticuerpos IgG séricos: a las tres semanas de la infección (y frecuentemente antes), en prácticamente todas las personas infectadas deberían detectarse anticuerpos IgG séricos contra el WNV mediante inmunoensayo enzimático (EIA, enzymatic immunoassay) durante 500 días o más. 6 Anticuerpos IgM séricos: al octavo día de la infección, en una gran mayoría de las personas infectadas se detectarán anticuerpos IgM séricos contra el WNV; en la mayoría de los casos los anticuerpos serán detectables durante al menos 1 a 2 meses tras el inicio de la enfermedad; en algunos casos serán detectables durante 500 días o más. 6 Se han observado resultados positivos en personas que recibieron vacunas para flavivirus (p. ej., fiebre amarilla, encefalitis japonesa, dengue), en personas infectadas con otros flavivirus y en personas previamente infectadas por WNV. Debido a que los arbovirus estrechamente relacionados producen reacciones serológicas cruzadas, a veces puede ser importante desde el punto de vista epidemiológico identificar el virus causante de la infección mediante pruebas de neutralización por reducción de placas utilizando una batería apropiada de flavivirus muy relacionados. FUNDAMENTO DE LA PRUEBA En el ELISA de IgG para el virus del Nilo Occidental de Focus Diagnostics los micropocillos de poliestireno están recubiertos con antígeno del virus del Nilo Occidental recombinante. En los micropocillos se incuban muestras de suero diluidas y controles para permitir la reacción del anticuerpo de clase IgG contra el WNV (si está presente en la muestra) con el antígeno. Los componentes no específicos de la reacción se eliminan mediante lavado, y se añade IgG antihumana conjugada con peroxidasa, que reacciona con la IgG humana unida al antígeno. El exceso de conjugado se elimina mediante lavado. Se agregan el sustrato enzimático y el cromógeno, y se permite que se desarrolle la reacción de color. Después de agregar el reactivo de parada, el cambio de color obtenido se cuantifica mediante lectura espectrofotométrica de la densidad óptica (OD, optical density). Las lecturas de la densidad óptica de la muestra se comparan con las lecturas de OD de referencia para el nivel de corte para así determinar los resultados.

2 FOCUS Diagnostics West Nile Virus IgG DxSelect Página 2 MATERIALES SUMINISTRADOS Pocillos con antígeno para IgG (96 pocillos) REF EL0351 Ag IgG Antigen Wells, 96 wells Doce tiras con ocho pocillos de poliestireno cada una en un armazón. Cada pocillo está recubierto con antígeno del virus del Nilo Occidental recombinante. Cada tira puede ser divida en pocillos individuales para un uso ahorrativo. Para evitar la condensación, permítase que las tiras de antígeno alcancen la temperatura ambiente antes de abrir el paquete sellado. Conjugado para IgG, 16 ml REF EL0304 CONJ IgG IgG Conjugate, 16 ml Un vial de anticuerpos IgG de cabra contra inmunoglobulinas humanas (específicos para el fragmento Fc) purificados por afinidad y conjugados con peroxidasa. Contiene proteína, tampón y conservantes. Control positivo, 0,3 ml REF EL0311 CONTROL Positive Control, 0.3 ml Un vial de suero humano. Contiene azida sódica al 0,1% como agente conservante. Debe diluirse antes del uso (ver más adelante Preparación de las muestras, controles y calibrador ). Control negativo, 0,3 ml REF EL0312 CONTROL Negative Control, 0.3 ml Un vial de suero humano. Contiene azida sódica al 0,1% como agente conservante. Debe diluirse antes del uso (ver más adelante Preparación de las muestras, controles y calibrador ). Calibrador de nivel de corte 0,3 ml REF EL0306 CONTROL CAL Cut-Off Calibrator, 0.3 ml Un vial de suero humano. Contiene azida sódica al 0,1% como agente conservante. Debe diluirse antes del uso (ver más adelante Preparación de las muestras, controles y calibrador ). Diluyente de muestras, 100 ml REF EL1608 DIL SPE Sample Diluent, 100 ml Un vial de PBS con proteína, surfactante y conservantes. Tampón de lavado 10X, 100 ml REF EL0405 BUF WASH 10X Wash Buffer, 100 ml Un vial de surfactante en PBS con conservantes. Antes del uso, prepare una solución tampón 1X. Para preparar la solución tamponada de lavado 1X, mezcle 100 ml de tampón de lavado 10X con 900 ml de agua destilada (o desionizada) y elimine mediante lavado cualquier cristal presente. Utilice solamente agua purificada de alto grado para la reconstitución del tampón de lavado. Se ha observado que algunas fuentes de agua desionizada contienen materiales que pueden alterar el ensayo. Agite suavemente hasta mezclar bien y hasta que todos los cristales se disuelvan. Reactivo sustrato, 16 ml REF EL0009 SUBS TMB Substrate Reagent, 16 ml Un vial de tetrametilbenzidina (TMB) y peróxido de hidrógeno en tampón. El reactivo sustrato puede adquirir una coloración ligeramente azul mientras se conserva en frío. Sin embargo, debe recuperar un color ligeramente ámbar después de alcanzar la temperatura ambiente. Un color azul oscuro indica contaminación con peroxidasa; si esto ocurre, utilice un frasco nuevo. Reactivo de parada, 16 ml REF EL0105 SOLN STOP Stop Reagent, 16 ml Un vial de ácido sulfúrico 1 M. Cinta selladora Dos láminas de cinta selladora. MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Agua destilada o desionizada 2. Frasco de lavado de 250 o 500 ml o lavador automatizado de placas para EIA 3. 1 cilindro graduado de 1 litro 4. Tubos de ensayo de vidrio de borosilicato de 12 x 75 mm o equivalentes 5. Pipeteadores de 10 l y 100 l con puntas desechables 6. Pipeta o dispensador de 1 ml 7. Pipeta de 5 ml 8. Cronómetro 9. Toallas de papel o papel absorbente 10. Fregadero/recipiente de desechos 11. Mezclador vórtex o equivalente 12. Espectrofotómetro para placas de ELISA. Longitud de onda = 450 nm PERÍODO DE VALIDEZ Y MANIPULACIÓN 1. Los kits y sus reactivos son estables hasta el fin del mes indicado en la fecha de caducidad de la etiqueta cuando se conservan a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C. 2. No use los kits de pruebas o sus reactivos después de la fecha de caducidad. 3. No exponga los reactivos a luz intensa durante su conservación o incubación.

3 FOCUS Diagnostics West Nile Virus IgG DxSelect Página 3 4. Permita que los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de su uso. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Este kit debe utilizarse únicamente para diagnóstico in vitro. 2. Todos los productos derivados de la sangre deben ser tratados como material potencialmente infeccioso. Las materias primas para la elaboración de este producto (incluidos los controles) han sido analizadas con resultados negativos, mediante métodos aprobados por la FDA, para el antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno de la hepatitis C y anticuerpos frente al VIH-1/2. No obstante, puesto que ningún método de análisis puede proporcionar un 100% de seguridad de que los productos derivados de sangre humana no transmitirán estos u otros agentes infecciosos, todo el material que entre en contacto con estos reactivos, ya sean controles, muestras de suero o equipamiento, deben considerarse como potencialmente infeccioso y descontaminarse o desecharse tomando las precauciones de bioseguridad adecuadas. Los CDC y los Institutos Nacionales de la Salud recomiendan manipular los agentes potencialmente infecciosos en conformidad con el nivel de bioseguridad Los pocillos con antígeno se fabrican con antígenos de virus del Nilo Occidental recombinantes. Después de añadir la muestra del paciente o el control, las tiras deben considerarse potencialmente infecciosas y manipuladas como tales. 4. Se ha añadido azida sódica al 0,1% a algunos de los reactivos en calidad de agente antibacteriano. Para prevenir la acumulación de azidas metálicas explosivas en cañerías de plomo y cobre, estos reactivos (véase sección MATERIALES SUMINISTRADOS ) deben desecharse al alcantarillado únicamente si se han diluido previamente y se eliminan junto con abundante agua. Utilice siempre que sea posible sistemas de desagüe sin cobre o plomo. Descontamine periódicamente los tubos de desagüe con hidróxido de sodio al 10% (PRECAUCIÓN: cáustico), permita que permanezca durante 10 minutos y luego aclare con abundante agua. 5. No sustituya los reactivos ni los mezcle con reactivos de procedentes de kits de otros lotes o de otros fabricantes. 6. Use únicamente los protocolos descritos en este prospecto. Tiempos de incubación o temperaturas diferentes a las especificadas pueden dar lugar a resultados erróneos. 7. La contaminación cruzada de muestras del paciente puede dar lugar a resultados erróneos. Añada las muestras del paciente y manipule las tiras cuidadosamente para evitar que los sueros de los pocillos de las bandejas de incubación adyacentes se mezclen. Decante con cuidado. 8. La contaminación bacteriana de las muestras de suero o de los reactivos puede dar lugar a resultados erróneos. Use técnicas asépticas para evitar la contaminación bacteriana. 9. Realice el ensayo a temperatura ambiente (entre 20 y 25 C aproximadamente). 10. Utilice técnicas de pipeteo correctas, y mantenga la misma modalidad de pipeteo durante todo el procedimiento para asegurar resultados óptimos y reproducibles. 11. El reactivo de parada contiene ácido sulfúrico. Evite el contacto con la piel o los ojos. Si hubiera contacto, lave con abundante cantidad de agua. 12. Esta prueba debe utilizarse sólo con suero. No se ha determinado su uso con sangre entera, plasma u otros especímenes. 13. La azida sódica inhibe la actividad del conjugado. Deben utilizarse puntas de pipeta limpias para añadir el conjugado a fin de evitar transferir azida sódica de unos reactivos a otros. 14. No deben analizarse sueros hiperlipidémicos, inactivados por calor, hemolizados, ictéricos o contaminados. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS El suero es la fuente de obtención de muestras. No se realizó ninguna evaluación de la compatibilidad del ensayo con otro tipo de muestras. No se han establecido las características de rendimiento del ensayo en sueros hiperlipidémicos, inactivados por calor, hemolizados, ictéricos o contaminados. Se desconoce si dichos especímenes producirán resultados erróneos. Recolección y manipulación de las muestras Obtenga muestras de sangre asépticamente mediante técnicas de venopunción aprobadas y efectuadas por personal capacitado. Permita que las muestras de sangre se coagulen a temperatura ambiente antes de su centrifugación. Transfiera asépticamente el suero a un recipiente estéril bien cerrado para su almacenamiento. El suero separado no debe permanecer más de 8 horas a 22 C. Si el ensayo no se va a efectuar en las siguientes 8 horas, refrigere la muestra a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C. Si el ensayo no se va a efectuar en las siguientes 48 horas, o en el caso de envío de muestras, congele a 20ºC o temperaturas más bajas. 8 Descongele y mezcle bien las muestras antes de su uso. Preparación de las muestras, controles y calibrador Diluya en una proporción 1:101 cada muestra, control y calibrador. Por ejemplo, etiquete los tubos y dispense 1 ml de diluyente de muestras en cada tubo etiquetado. Añada 10 l de muestra, de control o de calibrador al tubo que corresponda y que contiene 1 ml del diluyente de muestras; mezcle bien con el vórtex. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA No se han establecido las características de rendimiento para procedimientos que difieran del procedimiento descrito a continuación. Procedimientos distintos, como p. ej., con diferencias en cuanto a tiempos, volúmenes, temperatura u otros parámetros, pueden dar lugar a resultados inválidos. 1. Permita que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de su uso. Retire el paquete de pocillos con antígeno de su lugar de conservación en frío. Para evitar la condensación, no abra el paquete de aluminio que contiene las tiras con pocillos hasta que haya alcanzado la temperatura ambiente. Si va a usar menos de una placa completa, vuelva a guardar las tiras sin usar en el paquete de aluminio, que contiene un absorbente, y séllelo de nuevo completamente. Conserve los pocillos de antígeno sin usar a una temperatura de entre 2 y 8ºC (Nota: al final del ensayo, conserve el soporte para usarlo con las tiras restantes). 2. Llene los pocillos con solución tamponada de lavado 1X (véase MATERIALES SUMINISTRADOS ) y deje la solución en los pocillos durante 5 minutos para que éstos se remojen bien. Decante (o aspire) los pocillos de antígeno y sacúdalos vigorosamente para eliminar el tampón de lavado. Seque los pocillos de antígeno vacíos colocándolos boca abajo sobre toallas de papel limpias o papel absorbente para eliminar el tampón de lavado residual. 3. Dispense 100 µl del diluyente de muestras en los pocillos destinados al "blanco" y 100 µl de muestra diluida, de control o de calibrador en sus pocillos correspondientes (véase Preparación de las muestras, controles y calibrador ). (Nota: Para series de más de 48 pocillos, se recomienda que primero se añadan 250 µl de cada muestra diluida a una placa de microtitulación limpia en la posición correspondiente a la de los pocillos de ELISA. Las muestras podrán entonces transferirse de forma eficiente a los pocillos con antígeno con un pipeteador de 100 µl de 8 o 12 canales.) 4. Cubra las placas con cinta selladora (o colóquelas en una cámara húmeda) e incube durante 60 1 minutos a temperatura ambiente (20 a 25ºC). 5. Quite la cinta selladora (o retire los pocillos de la cámara húmeda), y vacíe el contenido de los pocillos en el fregadero o recipiente de desechos. 6. Llene delicadamente cada pocillo con solución tamponada de lavado 1X de un frasco de lavado y a continuación vacíe el contenido en un fregadero o en un recipiente de desechos. 7. Repita el lavado (paso 6) otras dos veces. 8. Sacuda vigorosamente los pocillos con antígeno para retirar el tampón de lavado 1X. Seque los pocillos de antígeno vacíos colocándolos boca abajo sobre toallas de papel limpias o papel absorbente para quitar el tampón de lavado 1X residual. 9. Dispense 100 µl de conjugado en todos los pocillos utilizando un pipeteador de 100 µl de 8 o 12 canales. 10. Cubra las placas con cinta selladora (o colóquelas en una cámara húmeda) e incube durante 30 1 minutos a temperatura ambiente (20 a 25ºC). 11. Repita los pasos 5 a 8 de lavado. 12. Pipetee 100 µl de reactivo sustrato en todos los pocillos utilizando un pipeteador de 100 µl de 8 o 12 canales. Comience a medir el tiempo de incubación en el momento en que añada el reactivo sustrato al primer pocillo. (Nota: nunca añada el reactivo sustrato utilizando el mismo canal que usó para el conjugado.)

4 FOCUS Diagnostics West Nile Virus IgG DxSelect Página Incube durante 10 1 minutos a temperatura ambiente (20 a 25ºC). 14. Detenga la reacción añadiendo 100 µl de reactivo de parada a todos los pocillos utilizando un pipeteador de 100 µl de 8 o 12 canales. Añada el reactivo de parada con la misma secuencia y al mismo ritmo con los que añadió el sustrato. En los pocillos positivos para el anticuerpo, el color debe cambiar de azul a amarillo. 15. Seque delicadamente la superficie externa de la base de los pocillos con una toalla de papel para eliminar las gotas ya que éstas pueden afectar a la lectura del espectrofotómetro. No frote los pocillos con la toalla de papel ya que podría rayar la superficie óptica del pocillo. (Nota: las burbujas grandes en la superficie del líquido pueden afectar a las lecturas de OD.) 16. Mida la absorbancia de cada pocillo dentro del lapso de 1 hora tras haber detenido la reacción. Ajuste la longitud de onda del espectrofotómetro de micropocillos a 450 nm. Ajuste el cero del instrumento utilizando los pocillos para el blanco, o corrija todas las OD mediante sustracción manual de la OD correspondiente a los pocillos para el blanco. Procedimiento ELISA de IgG (versión abreviada) 1. Diluya las muestras 1:101 en el diluyente de muestras (p. ej., 10 µl µl). 2. Remoje los pocillos durante 5 minutos con solución de lavado 1X, decante µl de muestra durante 60 minutos, decante. 4. Lave 3 veces µl de conjugado durante 30 minutos, decante. 6. Lave 3 veces µl de reactivo sustrato durante 10 minutos µl de reactivo de parada, lea a = 450 nm. Consulte la sección PROCEDIMIENTO para información importante. CONTROL DE CALIDAD El procesamiento de cada serie de placas (o tiras o pocillos de una placa individual) debe incluir el calibrador de nivel de corte y los dos controles. Si se usan varias placas, incluya el calibrador de nivel de corte y ambos controles en cada una de las placas. Se recomienda procesar por duplicado todas las muestras, los controles y el calibrador de nivel de corte, utilizando este último dos veces en un total de cuatro pocillos, hasta tanto el usuario se haya familiarizado con las características del kit. Si se usan pocillos individuales, el calibrador de nivel de corte debe analizarse por triplicado. Incluya como mínimo 1 pocillo para determinación del blanco (que sólo contenga diluyente de muestras) a fin de calibrar el instrumento. El calibrador de nivel de corte ha sido formulado para distinguir de forma óptima entre sueros negativos y positivos. Aunque el valor de absorbancia puede variar de un análisis a otro y entre laboratorios, el valor promedio de los pocillos de calibrador de nivel de corte debe estar comprendido en el intervalo de 0,100-0,700 unidades de OD. Ninguna de las repeticiones de lecturas de OD del calibrador de nivel de corte debe diferir en más de 0,1 unidades de absorbancia del valor promedio. Informe los resultados como valores índice relativos al calibrador de nivel de corte. Para calcular estos índices, divida el valor de densidad óptica (OD) de la muestra y del control por el valor promedio de OD del calibrador de nivel de corte. 1. Los valores índice del control positivo deben encontrarse entre 1,5 y 3,5. 2. Los valores índice del control negativo deben ser menores de 0,8. Si los valores del calibrador o de los controles están fuera de estos parámetros, los resultados del análisis de las muestras del paciente deben considerarse inválidos y el ensayo deberá repetirse. Los controles positivos y negativos tienen la función de controlar si hay fallos importantes en los reactivos. El control positivo no deberá utilizarse como un indicador de la precisión del calibrador de nivel de corte; su único propósito es comprobar el buen funcionamiento de los reactivos. Los requisitos de control de calidad deben cumplirse en conformidad con las regulaciones locales, estatales y/o federales, o con los requisitos de acreditación y procedimientos estándar de control de calidad de su laboratorio. En EE.UU., las autoridades reguladoras recomiendan que el usuario consulte los documentos NCCLS C24-A y 42 CFR para obtener información sobre pautas de control de calidad apropiadas. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Para calcular los valores índice, divida los valores de densidad óptica (OD) de las muestras por el valor de absorbancia promedio del calibrador de nivel de corte. La magnitud del valor índice por encima del calibrador de nivel de corte no indica la cantidad total de anticuerpo presente. Desarrollo del calibrador de nivel de corte. En el diseño del ensayo, el valor de corte (umbral de positividad) se estableció para favorecer ligeramente la especificidad sobre la sensibilidad utilizando 217 sueros que comprendían 3 paneles de suero diferentes: 1) 136 sueros analizados para el virus del Nilo Occidental con resultados positivos con un método ELISA interno de IgG para WNV (un ELISA de IgG con antígeno del virus del Nilo Occidental nativo 8,9 ); 2) 61 sueros analizados para virus del Nilo Occidental con resultados negativos con un método ELISA interno de IgG para WNV; y 3) 20 donantes de sangre. Los resultados del ELISA de IgG para virus del Nilo Occidental de Focus fueron positivos en el 90,4% (122/135) de las muestras positivas según el ELISA de IgG de WNV interno, negativos en el 100% (61/61) de las muestras negativas según el ELISA de IgG de WNV interno, y negativos en el 100% (20/20) de las muestras de donantes de sangre. Índice Interpretación (resultados IgG solamente) IgG 1,50 IgG positivo. Un valor índice 1,50 indica que se han detectado anticuerpos IgG contra el virus del Nilo Occidental. La presencia de anticuerpos IgG es una indicación presuntiva de que el paciente estuvo o está actualmente infectado por el (o expuesto al) virus del Nilo Occidental u otro flavivirus. Un paciente puede ser IgG positivo debido a reactividad cruzada con CMV y/o bunyavirus, p. ej. LAC. Los resultados positivos deben informarse junto con una nota de advertencia sobre la posible reactividad cruzada con CMV y bunyavirus. Deben descartarse estas enfermedades antes de confirmar el diagnóstico. Los resultados positivos deben ser confirmados en una prueba de neutralización por reducción de placas o utilizando las pautas recientes de los CDC para el diagnóstico de encefalitis del Nilo Occidental. < 1,50 y IgG equívoco. Un valor índice 1,30 y < 1,50 se considera un resultado equívoco. Se recomienda que las muestras con resultados equívocos se evalúen con 1,30 un método diferente; o puede obtenerse otra muestra del paciente dos o más semanas más tarde para reevaluación con esta misma prueba. < 1,30 IgG negativo. Un valor índice < 1,30 indica que no se detectaron anticuerpos IgG contra el virus del Nilo Occidental. La ausencia de anticuerpos IgG es una indicación presuntiva de que el paciente no ha sido infectado por el virus del Nilo Occidental ni otro flavivirus. Sin embargo, puede haber ocurrido que la muestra se obtuviera antes de que los anticuerpos se hicieran detectables, o que el paciente pueda estar inmunodeprimido. Si se sospecha una infección, debería obtenerse otra muestra entre 7 y 14 días más tarde para su análisis. Consulte las guías de los CDC para el diagnóstico de encefalitis del Nilo Occidental. Si también se dispone de los resultados de la prueba ELISA de IgM para el virus del Nilo Occidental de Focus para la misma muestra, use la interpretación que se indica a continuación: Resultado IgM Resultado IgG Interpretación combinada (con los resultados de IgM y de IgG)

5 FOCUS Diagnostics West Nile Virus IgG DxSelect Página 5 Resultado IgM Pos Neg Resultado IgG Pos Neg Pos Neg Interpretación combinada (con los resultados de IgM y de IgG) Presunta infección actual o reciente del paciente. La presencia de anticuerpos IgM es una indicación presuntiva de que el paciente estuvo recientemente o está actualmente infectado por el virus del Nilo Occidental u otro flavivirus. Sin embargo, se demostró que la IgM contra el WNV persiste durante 500 días. Véanse los resultados precedentes para resultados positivos de IgM contra el WNV. Presunta infección previa (o exposición) del paciente por WNV. La presencia de anticuerpos IgG y ausencia de anticuerpos IgM es una indicación presuntiva de que el paciente fue infectado por el (o expuesto al) virus del Nilo Occidental u otro flavivirus en el pasado. Presunta ausencia de infección (o exposición) del paciente por WNV. La ausencia de anticuerpos IgM e IgG es una indicación presuntiva de que el paciente no ha sido recientemente infectado por (o expuesto al) virus del Nilo Occidental u otro flavivirus. LIMITACIONES 1. No se ha determinado el rendimiento de este ensayo para la evaluación de cribado (screening) de la población general. La prueba debe utilizarse únicamente en pacientes con síntomas clínicos de meningoencefalitis. 2. No se ha determinado el rendimiento de este ensayo para descartar enfermedades con síntomas similares, p. ej. encefalitis por el virus del herpes simplex, encefalitis por enterovirus, meningitis bacteriana, encefalitis causadas por enfermedades no infecciosas o encefalitis posinfecciosa. 3. No se ha determinado el rendimiento de este ensayo en matrices que no sean suero, o para la evaluación visual de los resultados, o para el control del tratamiento para el virus del Nilo Occidental. 4. Todos los resultados de esta prueba o de cualquier otra prueba serológica deben correlacionarse con la historia clínica, con los datos epidemiológicos y con otros datos a disposición del médico a cargo cuando se evalúa al paciente. Los resultados positivos deben ser confirmados por una prueba de neutralización o siguiendo las pautas vigentes de los CDC para el diagnóstico de encefalitis del Nilo Occidental La prevalencia de la infección influirá sobre el valor predictivo del ensayo. 6. Esta prueba puede dar resultados positivos en personas sin infección actual por el virus del Nilo Occidental. Debido a la reactividad cruzada entre distintos flavivirus, pueden obtenerse resultados positivos en las personas vacunadas contra otros flavivirus (p. ej. virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla) o infectadas con otros flavivirus. Deben descartarse estas enfermedades y/o vacunaciones antes de confirmar el diagnóstico. 7. Esta prueba puede dar resultados negativos en personas que están actualmente infectadas por el virus del Nilo Occidental. Las muestras obtenidas en una etapa muy temprana de la infección pueden no tener anticuerpos detectables. 8. Se observó reactividad cruzada con algunas muestras que contenían anticuerpos contra el citomegalovirus (CMV) y bunyavirus, p. ej. LAC. Los resultados positivos deben acompañarse de una nota de advertencia acerca de la posible reactividad cruzada con el CMV y los bunyavirus, p. ej. El virus de LaCrosse. VALORES ESPERADOS La prevalencia de los anticuerpos contra el virus del Nilo Occidental depende de la edad, ubicación geográfica, método de análisis empleado y de otros factores. En un estudio realizado en Nueva York en el año 2000 en el que se llevó a cabo una evaluación serológica del virus del Nilo Occidental en varias comunidades se encontró que el 0,2% (5/2433) del total de las personas evaluadas tenían anticuerpos indicativos de infección por el virus del Nilo Occidental reciente, y que el 1,1% (2/176) de las personas que recientemente habían experimentado cefalea y fiebre tenían anticuerpos indicativos de infección por el virus del Nilo Occidental reciente. 11 Dos evaluaciones serológicas realizadas en la ciudad de Nueva York (NY) en 1999 y 2000 mostraron que aproximadamente 1 de cada 150 infecciones (<1%) causaron meningitis o encefalitis. Los resultados de NY concuerdan con una evaluación serológica realizada en Rumania que indicó que entre 1 de 140 a 1 de 320 infecciones produjeron meningitis o encefalitis. 2 Prevalencia en muestras remitidas para análisis de virus distintos a flavivirus (n=476) Focus evaluó la reactividad en 476 muestras obtenidas prospectivamente en Norteamérica durante agosto de Las muestras habían sido remitidas a un laboratorio clínico situado en el sur de California para pruebas de detección de virus distintos a flavivirus (p. ej. pruebas para otras enfermedades infecciosas). Las muestras provenían de mujeres (63,7%, varones (34,9%) y personas de sexo no especificado (1,4%). CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO Prevalencia de IgG en muestras remitidas para detección de virus distintos de flavivirus (n=476) Edad Neg Eqv Pos % Positivos IC del 95% 0 a ,7% (4/24) 4,7-37,4% 10 a ,9% (2/29) 0,9-22,8% 20 a ,3% (3/70) 0,9-12,0% 30 a ,1% (5/82) 2,0-13,7% 40 a ,3% (8/78) 4,5-19,2% 50 a ,9% (3/51) 1,2-16,2% 60 a ,4% (6/39) 5,9-30,5% 70 a ,7% (5/34) 5,0-31,1% ,1% (2/18) 1,4-34,7% Desconocida ,7% (8/51) 7,0-28,6% Total ,7% (46/476) 7,2-12,7% Centro de estudio 1: reactividad de Focus en pacientes con encefalitis/meningitis (n = 300) Un laboratorio de un departamento estatal de salud situado en el nordeste de EE.UU. evaluó la reactividad del dispositivo en pacientes con encefalitis/meningitis (n=300). Se sospechaba que los pacientes tenían encefalitis viral o meningitis viral. Los criterios para encefalitis viral fueron: 1) fiebre; 2) alteración del estado mental y/o otra prueba de afección cortical; y 3) pleocitosis en el LCR con predominio de linfocitos y/o proteínas elevadas y tinción gram y cultivo negativos. 12 Los criterios de meningitis viral fueron: 1) fiebre; 2) cefalea, rigidez en el cuello y/u otros signos meníngeos; y 3) pleocitosis en el LCR con predominio de linfocitos y/o proteínas elevadas y tinción gram y cultivo negativos). 12 Los sueros se enviaron al laboratorio en forma secuencial, donde fueron archivados y enmascarados. Los métodos de referencia fueron: ELISA de IgG para WNV de los CDC y prueba de neutralización por reducción de placas (PRNT) para el virus del Nilo Occidental. De los 300 pacientes con encefalitis/meningitis, 37 pacientes se clasificaron como positivos confirmados para encefalitis del Nilo Occidental (síntomas de meningoencefalitis, resultados positivos en el ELISA CDC de IgG para WNV y en la PRNT), 210 pacientes presentaron un resultado positivo presuntivo (ELISA CDC de IgG para WNV) y 53 pacientes quedaron sin clasificar debido a que los resultados de ELISA CDC de IgG para WNV fueron indefinidos o equívocos. El ELISA de IgG de Focus dio resultados positivos en el 97,3% (36/37) de los casos positivos confirmados de encefalitis por el WNV (se incluye 1 caso Focus equívoco categorizado como negativo). De los 210 pacientes con resultados positivos presuntivos en el ensayo, 4 fueron clasificados como casos presuntamente positivos de encefalitis por

6 FOCUS Diagnostics West Nile Virus IgG DxSelect Página 6 flavivirus (positivos en el CDC IgG WNV, negativos en PRNT), uno se clasificó como positivo confirmado para dengue (ELISA CDC de IgG para WNV positivo, PRNT para dengue positiva) y 205 fueron clasificados como casos presuntamente negativos (negativos en ELISA CDC de IgG para WNV). El ELISA de IgG de Focus fue positivo en el 100% (4/4) de los casos presuntamente positivos para encefalitis por WNV, y positivo en el paciente positivo para dengue. El ELISA de IgG de Focus dio resultados negativos en el 99,0% (203/205) de los casos presuntamente negativos (se incluye 1 caso Focus equívoco categorizado como positivo). Los 53 pacientes no clasificados no se incluyeron en los cálculos. Centro de estudio 1: reactividad de Focus en pacientes con encefalitis/meningitis (n = 300)* Muestras caracterizadas en ensayos Resultados de ELISA de IgG para WNV de Focus de referencia Neg Eqv Pos Total % Sensibilidad clínica (encefalitis o síntomas de meningitis, positivo con ELISA CDC de IgG, y positivo con PRNT para WNV) ,3% (36/37) IC del 95% 85,8-99,9% Concordancia con los resultados presuntivos de ELISA CDC de IgG Positivo 100% (5/5) IC del 95% 47,8-100% Negativo 99,0% (203/205) IC del 95% 96,5-99,9% * Excluidos los resultados de 53 casos con ELISA CDC de IgG (49 muestras indefinidas y 4 muestras equívocas). Una de las muestras presuntamente positivas fue positiva para dengue en el análisis mediante PRNT y las otras 4 muestras presuntamente positivas fueron negativas en el análisis mediante PRNT para WNV, dengue y SLE. Centro de estudio 2: reactividad de Focus en casos de análisis mediante PRNT positivos para WNV (n = 75) Un laboratorio clínico situado en el medio oeste de EE.UU. evaluó la reactividad del dispositivo retrospectivamente en 75 sueros positivos según el análisis de cribado (screening) previo (por Focus) con ELISA y antígeno viral nativo, con confirmación de positividad mediante prueba de neutralización por reducción de placas (PRNT). Los sueros se enviaron al laboratorio en forma secuencial, donde fueron archivados y enmascarados. El ELISA de IgG de Focus dio resultados positivos en el 36,0% (27/75) de los 75 casos positivos en el análisis mediante PRNT (4 casos equívocos calculados como negativos) y resultados negativos en 44 muestras. Centro de estudio 2: reactividad de Focus en casos de análisis mediante PRNT positivos para WNV (n = 75) Muestras caracterizadas en ensayos Resultados de ELISA de IgG para WNV de Focus de referencia Neg Eqv Pos Total % Sensibilidad serológica (positivo con PRNT para WNV) ,0% (27/75) IC del 95% 25,2-92,3% Centro de estudio 3: reactividad de Focus en casos de IFA (inmunoensayo de anticuerpos fluorescentes indirecto) negativos para virus del Nilo Occidental (n = 157) Un laboratorio clínico situado en el sudoeste de EE.UU. evaluó la reactividad retrospectivamente en 157 muestras negativas por IFA para el virus del Nilo Occidental. 13 El ELISA de IgG de Focus dio resultados negativos en el 96,8% de los casos (152/157) de muestras que habían sido negativas con IFA de IgG para WNV (incluidos dos casos equívocos calculados como positivos), y dio resultados positivos en tres muestras. Centro de estudio 3: reactividad de Focus en casos de IFA (inmunoensayo de anticuerpos fluorescentes indirecto) negativos para virus del Nilo Occidental (n = 157) Muestras caracterizadas en ensayos Resultados de ELISA de IgG para WNV de Focus de referencia Neg Eqv Pos Total % Concordancia de negatividad con muestras presuntamente negativas según IFA para WNV ,6% (152/157) IC del 95% 91,1-98,2% Centro de estudio 4: reactividad de Focus en pacientes con sospecha de encefalitis/meningitis (n = 50) Focus evaluó la reactividad del dispositivo con 50 sueros de pacientes con sospecha de encefalitis/meningitis. Un laboratorio del gobierno federal de EE.UU. proporcionó los sueros retrospectivos y enmascarados. Una de las muestras fue confirmada como positiva mediante PRNT para virus del Nilo Occidental, y las otras 49 fueron presuntamente negativas (ELISA CDC) para arbovirus presentes en Norteamérica (LAC, EEE, SLE y WNV). El ELISA de Focus dio resultados negativos en el 95,9% (47/49) de las muestras negativas para WNV, y resultados positivos en la muestra cuyo resultado positivo fue confirmado mediante PRNT para el virus del Nilo Occidental. Centro de estudio 4: reactividad en pacientes con sospecha de encefalitis/meningitis (n = 50) Muestras caracterizadas en Resultados de ELISA de IgG para WNV de Focus ensayos de referencia Neg Eqv Pos Total % Sensibilidad serológica (positivos con ELISA CDC de IgG y PRNT para WNV) Concordancia con los resultados presuntamente negativos con ELISA CDC de IgG % (1/1) IC del 95% ND ,9% (47/49) IC del 95% 86,0-99,5% Centro de estudio 4: reactividad de Focus con muestras de prueba de virus diferentes a flavivirus (n = 476) Focus evaluó la reactividad del dispositivo con 476 muestras obtenidas prospectivamente en Norteamérica durante agosto de Las muestras habían sido remitidas a un laboratorio clínico situado en el sur de California para pruebas de detección de virus distintos a flavivirus (p. ej. pruebas para otras enfermedades infecciosas). Las muestras positivas se analizaron con ELISA de IgF CDC para virus del Nilo Occidental. El ELISA de IgG para virus del Nilo Occidental de Focus dio resultados negativos en el 96,8% (426/440) de las muestras negativas en el ELISA CDC (incluidos 14 casos equívocos de Focus calculados como positivos), y dio resultados

7 FOCUS Diagnostics West Nile Virus IgG DxSelect Página 7 positivos en el 100% (21/21) de las muestras positivas en el ELISA CDC. Quince muestras con resultados indefinidos en el ELISA CDC de IgG fueron excluidas de los cálculos de rendimiento. Centro de estudio 4: reactividad de Focus con muestras de prueba de virus diferentes a flavivirus (n = 476)* Muestras caracterizadas en Resultados de ELISA de IgG para WNV de Focus ensayos de referencia Neg Eqv Pos Total % Concordancia con los resultados presuntamente positivos con ELISA CDC de IgG Concordancia con los resultados presuntamente negativos con ELISA CDC de IgG % (21/21) IC del 95% 83,9-100% ,8% (426/440) IC del 95% 94,7-98,3% * Se excluyen 15 muestras con resultados indefinidos en ELISA CDC de IgG. Reactividad cruzada Focus (centro de estudio 4) y un laboratorio estatal de un departamento de salud situado en el nordeste de EE.UU. (DOH) (centro de estudio 1) evaluaron la reactividad cruzada del dispositivo con sueros que fueron positivos para otros agentes patógenos que potencialmente pueden dar reactividad cruzada (n = 75). El DOH evaluó los casos positivos para SLE y Focus evaluó los otros sueros. Los sueros se archivaron y enmascararon. Los resultados de los estudios se resumen en la tabla a continuación: Reactividad cruzada de Focus Muestras caracterizadas en Resultados de ELISA de IgG para WNV de Focus ensayos de referencia Centro Neg Eqv Pos Total % de positivos Virus del dengue (infecciones secundarias) ,0% (19/20) IC del 95% 75,1-99,9% Virus de la encefalitis japonesa ,0% (6/20) IC del 95% 11,9-54,3% Virus de la encefalitis de St. Louis ,1% (12/21) IC del 95% 34,0-78,2% Virus de la fiebre amarilla ,0% (9/20) IC del 95% 23,1-68,5% Alfavirus (virus Sindbis y equino oriental) ,8% (2/17) IC del 95% 0,1-36,4% Bunyavirus (Jamestown Canyon y La Crosse) ,0% (3/15) IC del 95% 4,3-48,1% Virus del herpes simplex ,3% (5/60) IC del 95% 2,8-18,4% Virus de Epstein-Barr ,3% (1/12) IC del 95 % 0,2-38,5% Citomegalovirus ,0% (4/20) IC del 95% 5,7-43,7% Ecovirus/Poliovirus ,0% (2/20) IC del 95% 1,2-31,7% Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme) ,0% (3/20) IC del 95% 3,2-37,9% Reproducibilidad Los estudios de reproducibilidad comprendieron reproducibilidad interlote, reproducibilidad inter/intraensayo y reproducibilidad interlaboratorio. En cada estudio, se utilizaron dos conjuntos de muestras como duplicados enmascarados. Focus (centro de estudio 4) evaluó la reproducibilidad interlote del dispositivo analizando cinco muestras en tres días distintos en tres lotes separados. En uno de los lotes, las muestras se procesaron por triplicado, y en los otros dos por duplicado. Cada uno de los tres lotes tenía un lote diferente de antígeno y pocillos de captura. Focus (centro de estudio 4) evaluó la reproducibilidad inter/intraensayo del dispositivo analizando siete muestras por triplicado, una por día, durante tres días, hasta obtener un total de 63 puntos de datos. Un laboratorio de un departamento estatal de salud situado en el nordeste de EE.UU. (centro de estudio 1) y un laboratorio clínico situado en el medio oeste de EE.UU. (centro de estudio 2) y Focus (centro de estudio 4) evaluaron la reproducibilidad interlaboratorio del dispositivo. Cada uno de los tres laboratorios analizó siete muestras por triplicado en tres días diferentes. Muestra Íncide promedio Reproducibilidad Inter e intraensayo Interlote Interlab Intraensayo Interensayo Índice Índice Índice % CV % CV promedio % CV promedio Índice % CV G6* 0,23 12,2 18,2 0,30 13,1 0,32 11,6 G2* 0,29 21,2 17,3 0,34 7,5 0,35 22,5 G5 0,65 7,9 21,3 0,73 7,2 0,69 19,0 G7* 1,14 3,5 18,2 1,30 5,7 1,21 14,1 G1* 1,22 3,2 17,1 1,36 7,0 1,25 16,4 G4 2,44 1,0 16,2 2,79 4,1 2,47 12,8 G3 2,98 3,9 17,3 3,37 4,1 3,10 12,6 * Hubo dos conjuntos de pares enmascarados (misma muestra, identificación con etiquetas diferentes): G2 y G6 pertenecen a un par enmascarado, y G1 y G7 pertenecen al segundo par enmascarado. REFERENCIAS 1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Epidemic/Epizootic West Nile Virus in the United States: Guidelines for Surveillance, Prevention and Control. 3rd Ed p Petersen LR, Marfin AA.West Nile virus: a primer for the clinician. Ann Intern Med Aug 6;137(3):173-9.

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