Profesor Patrocinante. Dr. Daniel Calderini R. Instituto de Producción y Sanidad Vegetal. Facultad de Ciencias Agrarias.

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1 Profesor Patrocinante. Dr. Daniel Calderini R. Instituto de Producción y Sanidad Vegetal. Facultad de Ciencias Agrarias. Profesor Co-Patrocinante. Dr. Ricardo Riegel S. Instituto de Producción y Sanidad Vegetal. Facultad de Ciencias Agrarias. EXPRESIÓN DE EXPANSINAS Y CRECIMIENTO DE LAS CÉLULAS DEL PERICARPIO DURANTE EL LLENADO DE GRANOS EN TRIGO. IMPORTANCIA DE ESTOS PROCESOS PARA LA DETERMINACIÓN DEL PESO FINAL DE GRANO Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico. JAIME FELIPE HERRERA PAREDES VALDIVIA-CHILE 2011

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3 A todos los que imaginan, sueñan y desean ser mejores, para mejorar a los demás.

4 AGRADECIMIENTOS Muchas y preciosas personas me han beneficiado con su tiempo, paciencia y sus experiencias de vida personal y profesional, para guiarme en mi formación. Gracias al el Dr. Daniel Calderini R. por haberme aceptado en su proyecto de investigación, su grupo de trabajo y por sobre todo aceptar el desafió de incorporar una persona alejada de su formación profesional y área de investigación, otorgándome su paciencia y conocimientos. También debo agradecer al Dr. Ricardo Riegel S., por darme su confianza para incorporarme a su laboratorio y utilizarlo para el desarrollo del proyecto. Junto a lo anterior, agradecer al equipo de trabajo del Dr. D. Calderini, por su amabilidad y alegría, haciendo grato la estadía en el laboratorio, especialmente a Carolina Lizana, por facilitarme el entendimiento de la fisiología vegetal con la mayor amabilidad, paciencia y alegría. Doy Gracias a mi madre, María Paredes, por darme la oportunidad de decidir mi futuro, junto con su cariño y apoyo incondicional. Esta tesis fue financiada por los aportes otorgados por Fondo de Desarrollo Científico y Tecnológico (proyecto FONDECYT ) y Proyecto de Cooperación Internacional del Fondo de Desarrollo Científico y Tecnológico (proyecto FONDECYT ).

5 I ÍNDICE DE CONTENIDOS Pagina 1.0 RESUMEN SUMMARY INTRODUCCIÓN Importancia y necesidades futuras de trigo Crecimiento de la producción de trigo Factores que determinan el rendimiento del trigo Determinantes del número de granos Determinantes del peso de los granos Células del pericarpio Expansinas Estructura de la pared vegetal Extensión celular Mecanismo de acción de las expansinas Función y localización de las expansinas Extensión celular y expresión de expansinas en trigo Implicancia de las células del pericarpio y de las expansinas en el crecimiento y rendimiento de los granos de trigo Hipótesis y objetivos Hipótesis Objetivo general Objetivos específicos. 21

6 II 3.0 MATERIALES Y MÉTODOS Materiales Material biológico Reactivos Instrumentos Métodos Antecedentes de cultivo Selección de muestras Medición y análisis de los componentes fisiológicos del grano Tinción y conteo de células endospermáticas Dimensiones de las células del pericarpio externo y células cruzadas Extracción de RNA total Cuantificación de RNA total mediante espectrofotometría Síntesis de cdna total Reacción de la polimerasa en cadena (PCR) Visualización de los productos amplificados Reamplificaron y secuenciación de DNA RESULTADOS Peso de los granos de Bacanora y Kambara a cosecha Dimensiones de los granos de Bacanora y Kambara a cosecha Dinámicas de acumulación de peso de los granos de Bacanora y Kambara. 45

7 III Dinámicas de acumulación de contenido hídrico de los granos de Bacanora y Kambara Dinámicas de aumento de volumen de los granos de Bacanora y Kambara Dinámicas de crecimiento de largo, alto y ancho de los granos de Bacanora y Kambara Dinámicas de elongación de los granos de Bacanora y Kambara Dinámica de alto y ancho de los granos de Bacanora y Kambara Dinámicas del número de células del endosperma de los granos de Bacanora y Kambara Extensión de las células del pericarpio de los granos 2 y 3 de Bacanora y Kambara Extensión de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3 de Bacanora y Kambara Dinámicas de la extensión de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3 de los genotipo Bacanora y Kambara Similitud entre las dinámicas de extensión longitudinal de las células del pericarpio externo y la elongación de los granos 2 y 3 de Bacanora y Kambara Similitud entre las dinámicas de extensión del ancho de las células del pericarpio externo y el crecimiento del ancho de los granos 2 y 3 de Bacanora y Kambara. 75

8 IV Extensión de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de Bacanora y Kambara Similitud entre las dinámicas de extensión de las células cruzadas y el crecimiento del ancho de los granos 2 y 3 de Bacanora y Kambara Expresión de expansinas en los granos 2 y 3 de los genotipos Bacanora y Kambara Niveles de expresión de las 6 expansinas en los granos 2 y 3 de los genotipos Bacanora y Kambara Dinámicas de expresión de las 6 expansinas en los granos 2 y 3 de los genotipos Bacanora y Kambara Dinámicas de expresión de expansinas, de elongación y acumulación de contenido hídrico de los granos 2 y 3 de los genotipos Bacanora y Kambara DISCUSIÓN CONCLUSIONES CONSIDERACIONES BIBLIOGRAFÍA 104

9 V ÍNDICE DE FIGURAS Pagina Figura 1: Factores que determinan y asocian al rendimiento de los granos trigo. 6 Figura 2: Evolución del peso, contenido hídrico y elongación de los granos. 10 Figura 3: Modelos estructurales de la pared celular vegetal en corte frontal y lateral. 15 Figura 4: Distribución de las parcelas en el experimento. 26 Figura 5: Asociación entre el peso y largo alcanzado por los granos. 40 Figura 6: Asociación entre el peso y volumen alcanzado por los granos. 41 Figura 7: Dinámicas peso seco, contenido hídrico y volumen de los granos de Bacanora. 43 Figura 8: Dinámicas peso seco, contenido hídrico y volumen de los granos de Kambara. 44 Figura 9: Asociación entre el peso de los granos a cosecha y la tasa de acumulación de materia seca. 47 Figura 10: Asociación entre el peso y el máximo contenido hídrico. 51 Figura 11: Asociación entre el máximo contenido hídrico y la tasa de acumulación de agua. 52 Figura 12: Dinámicas de largo, alto y ancho de los granos de Bacanora. 54 Figura 13: Dinámicas de largo, alto y ancho de los granos de Kambara. 55

10 VI Figura 14: Asociación entre la máxima elongación de los granos y el máximo contenido hídrico. 58 Figura 15: Dinámicas del número de células del endosperma. 61 Figura 16: Asociación entre el peso y el número de células endospermáticas de los granos. 63 Figura 17: Asociación entre la tasa de división celular y el máximo número de células del endosperma. 64 Figura 18: Crecimiento de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3 de Bacanora. 66 Figura 19: Crecimiento de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3 de Kambara. 67 Figura 20: Dinámicas de extensión de las células del pericarpio externo. 70 Figura 21: Dinámicas de extensión celular y del largo de los granos de Bacanora. 73 Figura 22: Dinámicas de extensión celular y del largo de los granos de Kambara. 74 Figura 23: Dinámicas del ancho celular y ancho de los granos. 76 Figura 24: Crecimiento de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de Bacanora. 78 Figura 25: Crecimiento de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de Kambara. 79 Figura 26: Dinámicas del largo de las células cruzadas y ancho de los granos. 82

11 VII Figura 27: Peso molecular de las 6 expansinas, 18S y controles negativos. 84 Figura 28: Expresión de las expansinas en los granos 2 y 3 de Bacanora. 87 Figura 29: Expresión de las expansinas en los granos 2 y 3 de Kambara. 88 Figura 30: Dinámica de expresión de las expansinas de Bacanora y Kambara. 90 Figura 31: Dinámicas de expresión de expansinas, elongación de los granos y contenido hídrico de los granos. 92

12 VIII ÍNDICE DE TABLAS Pagina Tabla I: Secuencia de los oligonucleótidos y productos de PCR generados desde la amplificación de los cdna de los genes estudiados. 35 Tabla II: Peso y dimensiones alcanzadas por las 4 posiciones de grano de los genotipos Bacanora y Kambara a cosecha. 38 Tabla III: Determinantes de la acumulación de peso de las 4 posiciones de grano de los genotipos Bacanora y Kambara. 46 Tabla IV: Determinantes de la acumulación de contenido hídrico de las 4 posiciones de grano de los genotipos Bacanora y Kambara. 50 Tabla V: Determinantes de la elongación de las 4 posiciones de grano de los genotipos Bacanora y Kambara. 57 Tabla VI: Determinantes de las células endospermáticas de las 4 posiciones de grano de los genotipos Bacanora y Kambara. 62 Tabla VII: Variación de tamaño de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3 de los genotipos Bacanora y Kambara. 68 Tabla VIII: Determinantes de la extensión de las células del pericarpio de los granos 2 y 3 de los genotipo Bacanora y Kambara. 71 Tabla IX: Variación de tamaño de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de los genotipo Bacanora y Kambara. 80 Tabla X: Productos de PCR reamplificados e identidad con otras expansinas previamente descritas. 85

13 IX ÍNDICE DE ABREVIATURAS Bac : Bacanora CH : Contenido hídrico CPE : Células del pericarpio externo DDA : Días después de antesis o días desde antesis. E EXP : Expresión de expansinas EC : Extensión celular EXLA : Expansin like A EXLA : Expansin like B EXPA : expansina EXPB : expansina FAA : Fijador Fenol/Aceto/Alcohólico G2As : Group-2 pollens allergens GH 45 : Glucosido transferasa 45 Gr : Grano Kam : Kambara LG : Largo de grano PG : Peso de grano PS : Peso seco SB : Tampón Sodio/Borato TBE : Tampón Tris/Borato/EDTA VG. Volumen de grano

14 X Vol : Volumen XTHs : Xyloglucanoendotransglicosilasa/hidrolasa

15 1 1.0 RESUMEN El consumo de alimentos y biocombustibles presionaran una mayor producción de trigo. Aumentar el rendimiento en base al peso de los granos es considerado una posible solución. El peso está determinado por la tasa y tiempo de llenado de los granos, pero se han asociado otros rasgos de peso, agua y tamaño. Adicionalmente, se incorpora la expresión de expansinas (proteínas responsables de la extensión de la pared celular) y el crecimiento de las células del pericarpio. Éstas estarían vinculadas al crecimiento de la pared de las células del pericarpio, la elongación del grano y peso final. Se estudió las dinámicas asociadas al crecimiento de los granos y comparó con la expresión de expansinas, dinámicas de crecimiento de las células del pericarpio externo (CPE) y cruzadas (CC). Los granos de dos cultivares de peso contrastante (Bacanora y Kambara), fueron analizados desde antesis a madurez fisiológica en las dinámicas de peso, contenido hídrico, células endospermáticas, dimensiones (alto, ancho y largo), CPE y CC. Paralelamente se semicuantificó la expresión de 6 expansinas bajo RT-PCR en los granos 2 y 3. El largo de las CPE y CC del grano 2 de Bacanora creció en función del tiempo de 41,28 m a 155,15 m y 44,20 m a 126,56 m, en Kambara creció de 30,26 m a 170,43 m y 30,37 m a 127,71 m. Las dinámicas de largo de las CPE y CC fueron semejantes a las dinámicas de largo y ancho de los granos. La expresión de expansinas no presentó diferencias significativa entre los genotipos y posición de grano. La máxima expresión se presentó antes de 10 días desde antesis y decayó en función del tiempo. Los granos de trigo tienen la mayor expresión de expansinas en los períodos de activa acumulación de agua, elongación de las CPE y de los granos, su expresión diminuye una vez definido el tamaño de grano.

16 2 1.1 SUMMARY Food consumption and bio-fuels will pressure a higher wheat production. To increase the performance based on the weight of the grains is considered a possible solution. The weight is determined by the rate and duration of grain filling, but additional features of weight, water and size have been asociated. In adition to this, the expresión of expansins (proteins responsible for the extension of cell wall) and pericarp cell growth has been incorporated. These would be linked to pericarp cell wall growth, grain elongation and final weight. The dynamics asociated with grain growth were studied and compared with expression of expansins, dynamics of external pericarp cell (CPE) and crossed cells (CC) growth. The grains from two cultivars of contrasting weight (Bacanora y Kambara), were analized from anthesis to physiologic maturity in dynamics of weight, water content endospermatic cells, dimensions (height, width and lenght), CPE and CC. In parallel the expression of 6 expansines were quantified by RT-PCR in grains 2 and 3. The lenght of CPE and CC of grain 2 from Bacanora grew as a function of time from 41,28 m a 155,15 m and 44,20 m to 126,56 m; in Kambara it grew from 30,26 m to 170,43 m and 30,37 m to 127,71 m. The dynamics of length of CPE and CC were similar to those of lenght and width of grains. Expansins expression did not showed a significant difference between genotypes and position of grain. The maximum expression was showed before day 10 from anthesis and decreased as a function of time. The wheat grains have the higher expression of expansins in periods of active water acccumulation, and CPE and grain elongation. Their expression decreases once the grain size is defined.

17 3 2.0 INTRODUCCIÓN 2.1 Importancia y necesidades futuras de trigo. El trigo (Triticum aestivum L.) aporta un quinto del requerimiento calórico global (Reynolds et al. 2009), y su productividad es de suma importancia para satisfacer las futuras demandas. Por ello, desarrollar estrategias en su mejora genética constituye un objetivo en la investigación de trigo. Los progresos agronómicos y genéticos aumentaron la producción de trigo (Reynolds et al., 2007; Evenson y Gollin, 2003), pero una serie de factores impulsan e impulsarían una mayor demanda. La misma, no sería superada por las ganancias genéticas y productivas anuales (Rosegrant y Cline, 2003; Sherman et al., 2005; Fischer y Edmeades, 2010; Miralles y Slafer, 2007). El continuo aumento de la población (> millones de personas, 2030), el mayor desarrollo económico, longevidad y expectativas de vida, aumentarían el consumo calórico alimenticio per cápita (Rosegrant y Cline, 2003; FAO, 2002). Los factores climáticos (Neelin et al. 2006; Bate et al., 2007) y ambientales (Berman et al., 2005; Montgomery, 2007) condicionan la producción de trigo. El cambio climático afectará negativamente la producción, impactando en la duración de las etapas ontogénicas, la mayor probabilidad de déficit hídrico (Richards, 1992; Trethowan et al., 2002), aumento en la salinidad de los suelos (Isla et al., 2003), eventos de shock térmicos, reestructuración de las áreas de cultivo y otros (Reynolds et al., 1998). Adicionalmente, se requerirá utilizar territorios del cordón tropical y subtropical (FAO, 2002), considerados poco aptos para el cultivo de trigo y de alto impacto ambiental.

18 4 La utilización del trigo como fuente de biocombustibles (grano: 66 GJ ha -1 a -1 ; planta completa: 72 GJ ha -1 a -1 ; Shewry, 2009, Murphy y Power, 2008), establecerá una competencia en su uso, sea para alimentación o generación de energía. Los anteriores factores presionarán un mayor consumo de trigo, estimándose una producción superior a 882 millones de t a -1 para el año 2020 (Cassman, 1999). Considerando que se producen 605 millones de t a -1 de trigo en 214 millones de hectáreas (FAOSTAT, 2007), las mismas que han tendido a estabilizarse e incluso disminuir en los últimos 15 años, hace imperioso incrementar el rendimiento medio mundial de 2,5 a más de 4,5 t ha -1 (Byrnes y Bumb, 1998; Rajaram, 2001), para evitar los problemas de escasez alimentaria a futuro (Reynolds et al., 2009). 2.2 Crecimiento de la producción de trigo. En la primera mitad del siglo XX, la producción de trigo creció por la introducción de nuevas áreas de cultivo (Calderini y Slafer, 1998). En la segunda mitad aumentó sostenidamente por mejoras en su manejo (Cassman, 1999), factores socioeconómicos globales (Calderini et al., 1998), y en gran medida al incremento del rendimiento por la introducción de los genes del enanismo. Estos genes disminuyeron la altura de planta, aumentando el número de granos y las hicieron menos propensas a pérdidas por tendedura (Loss y Siddique, 1994; Calderini et al., 1995; Evans et al. 1999; Rajaram, 2001). Lo anterior permitió duplicar la producción de trigo, sin embargo, desde finales de los años 80 la ganancia por rendimiento anual ha sido menor (Fischer y Edmeades, 2010).

19 5 Los genotipos actuales de trigo pueden alcanzar índices de cosecha próximos al 50% (Calderini et al., 1995), cercano al índice de cosecha máximo teórico calculado del 62% (Austin et al., 1980). Esto restringe las posibilidades de continuar incrementando el rendimiento y la producción como se hizo en el pasado. Requiriendo profundizar los conocimientos fisiológicos y genéticos involucrados en la determinación del número y peso de los granos (Reynolds et al., 2009; Calderini et al., 1999a; 2001; Calderini y Reynolds, 2000; Ugarte et al., 2007), para generar nuevas estrategias que posibiliten el aumento del rendimiento del cultivo (Reynolds et al., 2001; Monneveux et al., 2003). La combinación de mejoras agronómicas y fisiológicas, junto con la aplicación de técnicas biotecnológicas, serán necesarias para resolver los desafíos actuales y futuros del cultivo de trigo (Reynolds et al., 2009; Rajaram, 2001). 2.3 Factores que determinan el rendimiento del trigo. El rendimiento del trigo, es el resultado de la interacción entre el número y peso de los granos (Figura 1), y ambos responden a determinantes fisiológicos y genéticos (Satorre et al., 2003; Evans y Fischer, 1999). La mejora genética permitió aumentar el número de granos por unidad de superficie, pero con una disminución del peso medio de los mismos, producto de los nuevos granos de menor peso potencial, ubicados en las posiciones más distales de la espiga (Miralles y Slafer, 1995). Por otro lado, la disminución del peso no sería debido a una limitación de importancia en la fuente de asimilados (Satorre et al., 2003), lo que respalda las propuestas de incrementar el rendimiento, a través del aumento del (I) número de granos (Calderini et al., 1999), (II) el peso potencial de los mismos, o (III) ambos.

20 6 Figura 1: Factores que determinan y asocian al rendimiento de los granos trigo. Componentes que determinan el número de granos de la espiga. Adicionalmente, los determinantes fisiológicos y caracteres a los cuales se les ha asociado un afecto sobre el peso de los granos (figura adaptada de Satorre et al., 2003).

21 Determinantes del número de granos. El número de granos por unidad de superficie es el componente de mayor asociación con el rendimiento del trigo (Figura 1; Demotes-Mainard y Jeuffroy, 2004; Calderini et al., 1995), siendo afectado por el número de espigas, espiguillas y granos dentro de las mismas (Reynolds et al., 2009). Este último está fuertemente condicionado por el período entre 20 días previos a antesis y antesis (Fischer, 1985), en dicho momento se establece el número de granos por espiguilla (Satorre et al., 2003). Por ello, las condiciones de crecimiento durante este período modifican el número final de granos del cultivo (Satorre et al., 2003). La radiación absorbida por la planta afecta la tasa de crecimiento y acumulación de asimilados previo a antesis (Slafer et al., 1990). Una alta producción de asimilados resulta en una mayor partición a estructuras reproductivas (espigas), favoreciendo un mayor número de flores fértiles y futuros granos (Miralles et al. 1998). La temperatura afecta negativamente el número de granos, debido a que acelera la tasa de desarrollo, reduciendo el número de flores fértiles y consecutivamente el número final de granos (Satorre et al., 2003). Entre los factores agronómicos que pueden influenciar el número de granos, está la fertilidad del suelo y la densidad de siembra (Satorre et al., 2003). Para aumentar el número de granos se ha sugerido como estrategia, extender los períodos de desarrollo de las espigas, aumentar la partición de asimilados a las estructuras reproductivas y/o la disminución o inhibición de las estructuras no reproductivas (Reynolds et al., 2009).

22 Determinantes del peso de los granos. El peso de los granos está menos asociado con el rendimiento del cultivo (Fischer, 1985), pero es el responsable de la acumulación de biomasa tras haberse establecido el número de granos (Miralles et al., 2000; Satorre et al., 2003; Calderini et al., 1999a). Los principales determinantes del peso son la tasa de llenado de grano y el tiempo de de acumulación de asimilados (Egli, 1981). Paralelamente, se han asociado una serie de caracteres que afectarían al peso de los granos, como los determinantes de la acumulación de materia seca, el peso de los carpelos florales al momento de antesis, el número de células del endosperma, el contenido hídrico máximo alcanzado por los granos (Saini y Westgate, 2000) y el largo de los mismos (Figura 1). Aun así, son poco conocidos los determinantes que controlan el peso potencial de los granos, por ello se requiere de una mayor investigación sobre las bases fisiológicas que controlan estos caracteres (Calderini et al., 1999b; Calderini et al., 2001). Los trabajos recientes demuestran que cualquier perturbación en los 15 días previos a la antesis afectan el peso de los granos (Calderini et al., 1999a, b). Dicho período coincide con el crecimiento de los carpelos florales, cuyo peso en antesis está asociado con el peso potencial de los granos (Calderini et al., 1999a; Calderini y Reynolds, 2000, Satorre et al., 2003). El desarrollo y acumulación de asimilados al interior de los granos, está vinculado teóricamente al peso potencial de los granos (fuerza de los destinos). Esta acumulación sigue una dinámica de crecimiento sigmoidea, con una etapa inicial de baja acumulación de asimilados (fase lag), seguida de una etapa de rápida acumulación

23 9 (fase lineal), y finaliza en madurez fisiológica con la estabilización del peso de grano (Figura 2; Calderini et al., 1997; Reymolds et al., 2001; Borras et al., 2004). Paralelamente, desde antesis se produce un aumento en el número de células endospermáticas, estas células son las responsables de contener los asimilados sintetizados por la planta, y a su número se le atribuye una correlación positiva con el peso final de los granos (Brocklehuerst, 1977; Gleadow et al., 1982). La dinámica de acumulación de agua en los granos se inicia de forma acelerada durante un período aproximado de 15 días, le sigue una segunda etapa sin variación del contenido hídrico (plateau hídrico) y finaliza con una pérdida rápida de agua (Figura 2). Este último período se encuentra próximo a la madurez fisiológica del grano (Stone et al., 1995; Calderini et al., 2000; Wardlaw et al., 1995). Junto a la paridad de algunos eventos entre las dinámicas de peso y acumulación de agua, se ha descrito una asociación entre el máximo contenido hídrico y el peso de los granos (Schnyder y Baum, 1992; Calderini et al., 2000). Desde antesis hasta aproximadamente los 20 días después de antesis (DDA), los granos presentan un crecimiento acelerado en sentido longitudinal, a contar de este momento los granos detiene su elongación (Figura 2). Paralelamente, el grano crece en las dimensiones de alto y ancho hasta madurez fisiológica. El resultado de la extensión de cada una de las dimensiones del grano, genera el espacio (volumen) que contendrá los asimilados. A este volumen se le ha asociado con el peso final de los granos (Millet y Pinthus, 1984).

24 Peso (mg) y C. Hídrico (mg) PS CH Largo Largo de grano (mm) 0-20 Bota DDA 0 Peso Fase I Fase II Fase III C. Hídrico Fase I Fase II Fase III Fase IV Largo Fase I Fase II Figura 2: Evolución del peso, contenido hídrico y elongación de los granos. Área superior, dinámicas de acumulación de peso seco (PS; círculos llenos), acumulación de contenido hídrico (CH; círculos vacíos) y elongación (Largo; triángulos llenos) de los granos de trigo. Parte inferior, fases de la dinámica de acumulación de peso (Fase I = F. lag; Fase II = F. lineal; Fase III = M. fisiológica), contenido hídrico (Fase I = acumulación de agua; Fase II = plateau hídrico; Fase III = perdida de agua; Fase IV = contenido hídrico a cosecha) y elongación de los granos (Fase I = elongación del grano; Fase II = largo estable; figura adaptada de Satorre et al., 2003).

25 Células del pericarpio. El grano de trigo está envuelto por el pericarpio, esta estructura está formada por una serie de capas celulares estructuralmente diferenciadas. La epidermis e hipodermis (pericarpio externo), presenta células alargadas en sentido longitudinal al grano. La capa intermedia presenta las células cruzadas, que se alargan en sentido transversal al grano (Carole et al., 2003). Las referencias actuales, solo indican que el tamaño de las células del pericarpio no son afectadas por los alelos de enanismo, encontrándose diferencias en el número de las mismas (Miralles et al., 1998). La orientación y crecimiento de las células del pericarpio externo (CPE) y las células cruzadas (CC), podrían jugar un rol clave en el largo y ancho de los granos, determinado el volumen, forma (Yang et al., 2009; Gegas et al., 2010) y peso de los mismos. A la vez, el tamaño de estas puede ser afectado por unas proteínas capaces de modular la extensión de la pared celular llamadas Expansinas.

26 Expansinas. A comienzos de los años 90, se aisló una proteína desde el tejido vegetal en crecimiento, capaz de restaurar el crecimiento ácido de la pared celular de las plantas, atribuyéndole una naturaleza bioquímica a la extensión de la pared celular. Esta proteína y posterior familia proteica se les denominaron Expansinas (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995; Cosgrove, 1989). Se han identificado cuatro familias de expansinas (Kende et al., 2004), las y expansinas (EXPA y EXPB) con actividad experimental (Cosgrove, 1997, McQueen- Mason et al., 1992), y las expansin like (EXLA y EXLB) por homología de secuencia (Sampedro y Cosgrove, 2005). Las y expansinas presenta una similitud en tamaño (~25-28 kda) y secuencia (20 y 40%), diferenciándose en que las EXPA presentan un motivo de N-glicosilación, y las EXPB presentan una larga inserción y una deleción vecina al dominio 1 (Sampedro y Cosgrove, 2005). Los análisis de secuencia muestran 2 dominios altamente conservados, el dominio 1 presenta homología con glucósido transferasa (GH 45 ), pero sin actividad (McQueen-Mason et al., 1995; Cosgrove, 1997; 2000), y el dominio 2 no presenta homología con otras proteínas. La alta cantidad de residuos aromáticos y polares hace presumir que este dominio es capaz de formar puentes con los polisacáridos de la pared (Cosgrove 1997; Barre y Rougé, 2002). Paralelamente, se ha descubierto homología parcial con el grupo 2 de los polen alérgenos de las gramíneas-g2as y expansinas de otras especies como bacterias, nematodos y moluscos (Sampedro y Cosgrove, 2005).

27 Estructura de la pared vegetal. La pared primaria es la responsable de los cambios fisicoquímicos del desarrollo celular (McCann et al., 1990; Cosgrove, 1999), está compuesta por una red de polisacáridos de alto peso molecular de celulosa (30%), hemicelulosa (30%) y pectinas (35%; Fujino et al., 2000), embebidos en una matriz hidratada de otros polisacáridos, glicoproteínas (1-5%) y otras sustancias como ligninas, suberina y cutina (Carpita, 1996, Somerville et al., 2004), cuya relación varía dentro de la misma pared, entre tejidos y etapas del desarrollo (Sampedro y Cosgrove, 2005). La pared presenta entre 75 a 80% de agua, formando un hidrogel relativamente denso y variable, que permite la extensión celular (Lin et al., 1991). Esto la hace sensible a los fenómenos de deshidratación (Edelmann, 1995), y jugar un rol determinante en la inhibición del crecimiento en períodos de estrés hídrico (Chaze y Neumann, 1994). La celulosa se organiza en paquetes lineales de 3 a 10 nm de diámetro y sobre 7 m de extensión, estabilizadas por puentes hidrogeno inter e intra-cadena (Saxena y Brown, 2005). Las hemicelulosas (xiloglucanos y xilanos) se encuentran asociadas con las microfibras de celulosa y están compuestas por largas fibras de celulosa o xilosa, con ramificaciones menores de mucosa, galactosa o arabinosa (Rose, 2003). Las pectinas se encuentran hidratadas y unidas a la superficie de la celulosa, y su gelificación permite controlar la flexibilidad, porosidad (Vincken et al., 2003) o limitar la extensión de la pared mediante la interacción con iones de calcio (Fry, 2004). Según los modelos estructurales, las microfibras de celulosa y la matriz están organizadas como dos redes independientes. Una red de pectinas de carácter funcional y una red de celulosa-hemicelulosa de carácter estructural, determinando la forma,

28 14 dimension y expansión celular (Rose, 2003). El modelo Tethered network (Figura 3a), propone que las microfibras de celulosa estarían ligadas en forma no covalente, mediante largas cadenas de xiloglucanos, mientras que las pectinas y proteínas constituirían una malla independiente y coexistente con la red de celulosa-xiloglucano (Carpita y Gibeaut, 1993; Cosgrove et al., 1997; 2001; McCann et al., 1990; Nishitani, 1998). El modelo Multicoat propone que las microfibras de celulosa están inmersas y recubiertas por capas de polisacáridos de la matriz, las pectinas rellenarían los espacios y las uniones entre las redes, a través de enlaces no covalentes entre los diferentes polisacáridos (Figura 3b). Ambos modelos de organización de la pared celular están lejos de ser ratificados, ya que existen organizaciones dentro de las paredes aún más complejas (Cosgrove, 1999; 2001). La síntesis de la pared se realiza a través de 2 vías paralelas, la primera sintetiza celulosa mediante un complejo enzimático transmembrana (Rosetta), la cual deposita las fibras directamente sobre la pared (Schrick et al., 2004; Doblin et al., 2002). La segunda vía sintetiza la mayoría de los componentes de la matriz, ellos son sintetizados en el aparato de Golgi y transportados a la pared celular (Fry, 2004; Scheible y Pauly, 2004; Lerouxel et al., 2006), dicha matriz es posiblemente unida por una serie de glicoproteínas (Rose, 2003).

29 15 Figura 3: Modelos estructurales de la pared celular vegetal en corte frontal y lateral. Constitución y organización estructural de los diferentes componentes de la pared vegetal de los modelos de Multicoat y Tethered network (figura adaptada de Cosgrove, 2001).

30 Extensión celular. La capacidad de extensión y reorganización de la pared celular de las plantas está influenciada por estímulos ambientales como la luz, la gravedad, la anoxia, el estrés hídrico u hormonas. Para ello, la pared transita de un estado rígido a uno viscoelástico o relajado (Cosgrove, 2005), mediante una acidificación de la pared por las ATPasa H + de la membrana (Bibikova et al., 1998) y modificaciones bioquímicas de sus componentes. Todo ello produce una relajación (stress relaxation) y posterior ablandamiento de la pared (wall loosening). Paralelamente, desde el interior celular se genera una presión de turgencia que impulsa a las paredes y desliza sus polímeros (cell wall creep), provocando la extensión celular. Una vez finalizada la extensión de la pared, ésta sufre un proceso de reconstrucción de las fibras de celulosa, junto a la incorporación de una nueva matriz de polisacáridos (Sampedro y Cosgrove, 2005; Marga et al., 2005). Los avances bioquímicos y bioinformáticos han identificado 4 agentes putativos responsables del ablandamiento de la pared. Las expansinas son consideradas como agente primario por su capacidad de ablandar y extender la pared. Los xyloglucanoendotransglicosilasa/hidrolasa (XTHs), los radicales hidroxilos y las endo- (1,4)- -glucanasas son considerados agentes secundarios, porque solo modifican los componentes de la pared, sin generar extensión (Rose, 2003; Sanpedro y Cosgrove, 2005). Los radicales hidroxilos y peroxidasas de pared, hipotéticamente cortarían y removerían los átomos de hidrógenos de las cadenas de polisacáridos (Fry, 2004; Liszkay et al., 2003). Las endoglucanasas son visualizadas en las regiones no

31 17 cristalinas de celulosa, y tienen la capacidad de hidrolizar las uniones internas de las cadenas glucosídicas, necesaria para la reorganización y síntesis de glucanos (Inouhe y Nevins, 1998; Cosgrove, 1999; Ohmiya et al., 2000). Finalmente las XTHs, presentan alta expresión en regiones de formación, elongación, post-elongación y remodelación de pared (cortar y unir xiloglucanos), permitiendo la reestructuración o biosíntesis de la misma (Fry, 2004; Antosiewicz et al., 1997; Chanliaud et al., 2004; McQueen-Mason et al., 1993; Cosgrove, 1997; 1999; Darley et al., 2001; Saladié et al., 2006) Mecanismo de acción de las expansinas. Se desconoce el mecanismo como las expansinas ablandan y extienden la pared, sin embargo, los primeros trabajos han sugerido que las expansinas debilitarían los enlaces entre los polímeros de la matriz y de la superficie de la celulosa (Cosgrove, 2000a; 2000b; Darley et al., 2001). Las expansinas no generan un debilitamiento progresivo de la pared, ni siquiera modifican la mecánica y la estructura de la misma, a diferencia de las enzimas hidrolíticas o transglicosilasa (McQueen-Mason et al., 1993; 1995; Cosgrove, 1997). Se presume que pueden debilitar las uniones no covalentes entre los glucanos, ya que pueden debilitar el papel de celulosa pura (red de glucanos unidos por enlaces puente hidrogeno) o membranas artificiales de celulosa-xiloglucano, sin mostrar acción hidrolítica (McQueen-Mason y Cosgrove, 1994). Los resultados sugieren que las expansinas actuarían sobre los microfibras de celulosa y secundariamente sobre los puentes de xiloglucanos, pero son insensibles a otros polisacáridos.

32 18 A pesar de la homología de las expansinas con algunas endoglucanasas (Tatusova y Madden, 1999), éstas actúan de forma diferente, ya que las primeras lo realizan en forma inmediata, generando una relajación de la pared sin afectar su mecánica, mientras que las endoglucanasas requieren de un tiempo mínimo de acción (Yuan et al., 2001). Lo anterior ha sugerido que las expansinas abrirían la red celulosaxiloglucanos, generando la extensión inmediata de la pared, para una posterior acción de las endoglucanasas (Cosgrove et al., 2002) Función y localización de las expansinas. La activación y expresión de los genes de expansinas se les ha asociado al crecimiento y extensión celular (Vreegurg et al., 2005). Además se le ha descrito en maduración de frutos, formación de xilemas (Gray-Mitsumune et al., 2004), germinación de semillas (Chen y Bradford, 2000), emergencia de hojas (Belfield et al., 2005), penetración de polen (Pezzotti et al., 2002) y especialmente en tejidos en crecimiento (Rienhardt et al., 1998). A nivel celular, se mantienen acumuladas en el citoplasma, pero principalmente distribuidas en la pared, acentuándose en estratos y puntos específicos (Belestrini et al., 2005; Cosgrove et al., 2002). La sobreexpresión de expansinas, genera un crecimiento precoz de primordios foliares, modifica la filotaxis del meristema apical, provocando un crecimiento mayor y anormal de los tejidos vegetales (Pien et al., 2001, Cosgrove et al., 2002; Cho y Cosgrove, 2000). La supresión génica mediante sondas antisentido, ha podido reducir e inhibir el crecimiento de algunos vegetales, mientras que en otros les ha otorgar una mayor resistencia mecánica de los mismos (Cho y Cosgrove, 2000).

33 Extensión celular y expresión de expansinas en trigo. La pared celular de trigo y otras monocotiledóneas es de tipo II, baja en pectinas y xiloglucanos (< 2%), pero altas en xilanos (Carpita et al., 2001; Rose, 2003; Sanpedro y Cosgrove, 2005). Según el modelo propuesto, los -glucanos y glucuronoarabinoxilano cumplirían el rol de porosidad y de unión de las microfibras de celulosa, ya que su presencia es dependiente del estado de desarrollo celular (Kim et al., 2000) y sufren de degradación post-elongación celular (Carpita et al., 2001). En trigo se han aislado expansinas desde el coleoptilo, con una máxima actividad de elongación celular entre ph 4,0 y 4,5. Dicha actividad se ha visto inducida por ditioteitrol (DTT), iones de magnesio y potasio, pero inhibida por iones de aluminio, zinc y calcio 10 mm, al cual se le atribuye estimular la rigidez de la pared celular (Hepler, 2005; Gao et al., 2008). Los estudios de la expresión génica de expansinas en trigo han permitido aislar y caracterizar una serie de 18 y expansinas (Lin et al., 2005), las que han aumentado en estudios posteriores. Paralelamente se ha demostrado que las expansinas poseen distintos niveles de expresión génica y proteica en diferentes tejidos, órganos, etapas del desarrollo y tratamientos (Gao et al., 2008, Lizana et al., 2010). En el caso de las 18 expansinas estudiadas en los granos de trigo, éstas mostraron una variación en la expresión génica según el crecimiento del grano, donde algunas se expresaron en forma constitutiva y otras sufrieron aumento o disminución de su expresión (Lin et al., 2005).

34 Implicancia de las células del pericarpio y de las expansinas en el crecimiento y rendimiento de los granos de trigo. La urgencia de encontrar una posible solución a los problemas de escasez alimenticia de hoy y a futuro, hace necesario conocer más íntimamente las diferentes componentes fisiológicas envueltas en el desarrollo y crecimiento de los granos de trigo. Por ello, conocer los caracteres implicados en la acumulación de materia seca y de agua al interior de los granos, el crecimiento de los mismos, el número de células endospermáticas, la extensión de las células del pericarpio y la expresión de expansinas, resultan clave para comprender los determinantes del peso final de los granos, y poder contribuir a su incremento en los programas de mejora genética del cultivo, a través de herramientas para su manipulación. De acuerdo a los antecedentes entregados, esta tesis plantea que existe una relación entre las dinámicas de agua, el crecimiento de las células del pericarpio y la expresión de 6 expansinas. Para ello, se estudiarán las variables que intervienen en el crecimiento de los granos de 2 cultivares (Bacanora y Kambara) contrastante en su peso de grano, y se les relacionará con las dinámicas de crecimiento de las células del pericarpio, y la expresión de expansinas en diferentes períodos del llenado de los mismos.

35 Hipótesis y objetivos Hipótesis. El peso final de los granos de trigo está asociado con el tamaño de las células del pericarpio, y las dinámicas de elongación de los mismos se relacionan en el tiempo con la expresión de expansinas Objetivo general. Estudiar las dinámicas de crecimiento de grano de trigo, junto con la extensión de las células del pericarpio y expresión de expansinas, para mejorar el entendimiento de las bases fisiológicas, celulares y moleculares involucradas en la determinación del peso potencial de los granos Objetivos específicos. Analizar las dinámicas de la materia seca y contenido hídrico de granos en crecimiento de 2 cultivares de trigo con diferente peso potencial de los granos. Evaluar las relaciones entre las distintas variables a explorar, para identificar los caracteres más asociados con el peso final de los granos. Analizar el efecto genotípico y de posición de grano dentro de la espiga sobre las variables del grano a estudiar. Estudiar las dinámicas dimensionales de los granos 2 y 3 de los mismos cultivos y relacionarlas con las dinámicas de extensión de las células del pericarpio y los niveles de expresión de mrna de 6 expansinas. Identificar la secuencia génica de las 6 expansinas estudiadas.

36 MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Materiales Material biológico. El estudio utilizo el material biológico de dos cultivares de trigo primaveral (Bacanora = Bac y Kambara = Kam) de alto contraste en el peso final de los granos. Ambos cultivares han sido liberados por Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT) Reactivos. MWG-Biotech: Síntesis de partidores. Invitrogen: Set de desoxinucleótidos trifosfato (dntps, 100 mm), inhibidor de ribonucleasas (RNaseOUT, 40 U/μl), transcriptasa reversa M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus, 200 U/ l), DTT (0,1 M), reactivo de extracción de RNA de plantas (PureLink Plant RNA Reagent), partidores óligo dt [Oligo(dT) 20 Primer], agarosa (Ultrapure). Sigma-Aldrich Co.: enzima celulasa (Cellulase from Aspergillus Níger), alfaamilasa (α-amylase from Bacillus licheniformis Type XII-A, saline solution, 500-1,000 units/mg protein (biuret) y Verde de metilo ~ 85%. Merck & Co. Inc.: Acetato de calcio, ácido cítrico, fosfato de sodio dibasico, acetato de sodio, fucsina básica, isopropanol, meta-bisulfito, carbón activo. Fermentas: Taq DNA Polymerase (recombinant), marcador de peso molecular (Gene Ruler 50 pb DNA Ladder).

37 23 Winkler: Etanol, ácido acético glacial, formaldehído, agua RNasa Free. Vetec: Cloroformo, ácido bórico, hidróxido de sodio. J.T. Baker: Cloruro de sodio, etanol. Life Technology: Bromuro de etidio (GibcoBRL).

38 Instrumentos. Agitador magnético, Glassco. Cámara de Neubauer, Brand. Balanza Analítica Excelente plus, Mettler Toledo. Espectrofotómetro NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific. Freezer -70ºC MRF 401/86, Electrolux Medical Refrigeration. Centrífuga Heraeus Christ, Heraeus Instrument. Centrífuga refrigerada Biofuge Fresco, Heraeus Instrument. Microondas, LG MS2047C. Microscópio Axiolab, Carl Zeiss. Pie de metro. Block termoregulado Accu Block, Labnet International Inc. Cámara digital L700, Samsung. phmetro, Extech Instruments. Refrigerador y congelador ElectroCool, LG. Congelador -20ºC FE 26, Electron. Set de Micropipetas, Rainin. Termociclador PTC-100TM, JM Research inc. Termociclador PX2 Thermal Cycler, Thermo Electron Corporation. Transiluminador, Vilber Lourmat. Cámara de electroforesis y fuente de poder Mupid EX, Intelligent Power Supply. Estufa termoregulada, Binder.

39 Métodos Antecedentes de cultivo. El experimento se realizó en condiciones de campo en el fundo Santa Rosa (39º 47' 18"S, 73º 14' 5"O) de la Universidad Austral de Chile. La siembra fue el 1 de Septiembre del 2006 y las parcelas se dispusieron bajo un diseño en bloque completamente aleatorizado con 3 repeticiones (Figura 4), orientadas Norte-Sur. Cada parcela presentó una densidad de siembra de 350 plantas m -2, distribuidas en 7 hileras de 2 m de largo y espaciadas cada 15 cm. La acidez del suelo fue controlada mediante la aplicación de cal, previo a la siembra (4,0 t ha -1 ). Las parcelas se fertilizaron con N, P y K (350 Kg ha -1 KNO 3, 300 Kg ha -1 P 2 O 5 y 120 Kg ha -1 KO 2 ). Éstas se mantuvieron libres de enfermedades y plagas mediante la aplicación de fungicida a las semillas (Priori: Azoxystrobin 25% p/v, 1,5 L ha -1 ) e insecticida (Karate: Lambdacihalotrina 5% p/v, 150 ml ha -1 ) en caso de ataque de pulgones. Las malezas se controlaron mediante remoción manual. Paralelamente, las precipitaciones se complementaron con riego periódico para evitar posibles deficiencias hídricas.

40 7,0 m 26 0,9 m 2,0 m Kam R3 Bac R3 Bac R2 1,0 m N Kam R1 Bac R1 Kam R2 1,0 m 7,0 m Figura 4: Distribución de las parcelas en el experimento. Diseño, orientación y distribución de las parcelas. Donde Kam = Genotipo Kambara; Bac = Genotipo Bacanora; R1-R2-R3 = Repeticiones; N = Norte.

41 Selección de muestras. El ciclo de cultivo y sus etapas fisiológicas fueron registrados mediante la escala propuestas por Zadoks et al., (1974). El muestreo de los granos se realizó cada 2 o 3 días, entre los estados de bota-madurez fisiológica y antesis-madurez fisiológica. Las muestras para expansinas se extrajeron desde bota a madurez fisiológica, para ello se seleccionaron los granos 2 y 3 de las 4 espiguillas centrales de 4 espigas de cada una de las parcelas, se congelaron con nitrógeno líquido y conservaron en un congelador a -70 ºC. Las muestras para el análisis de dimensiones de grano, células del pericarpio y conteo de células del endosperma, se colectaron desde antesis hasta madurez fisiológica. Se seleccionaron 6 espigas por parcela, 2 para el análisis de dimensiones, y 4 se conservaron en fijador FAA (etanol: ác. acético: agua destilada: formaldehído, 10:1:7:2) para análisis de células del pericarpio y del endosperma. Alcanzada la madurez fisiológica del cultivo (cosecha), se colectaron 10 espigas de cada una de las parcelas y se registraron las dimensiones físicas Medición y análisis de los componentes fisiológicos del grano. A las 4 posiciones de granos presentes en las 2 espiguillas centrales de 2 espigas seleccionadas, se le registro el largo, alto y ancho mediante pie de metro. Se registró el peso fresco de cada una de las posiciones de grano con una balanza analítica de precisión y posteriormente se registró el peso seco de los mismo, tras 48 h a 65 ºC en una estufa termoregulada. Este proceso se repitió con las muestras de cosecha.

42 28 La variación del peso y las dimensiones fueron analizados bajos el programa TBL (Table curve 2D v2.0.3 release note) respecto a los DDA. Posteriormente sus resultantes fueron analizados estadísticamente bajo un análisis de varianza de múltiples factores (p < 0,05; Fischer) con el programa STADISTICA 8.0. Las dinámicas de peso, de elongación de los granos y extensión de las células del pericarpio se adaptaron a un modelo hiperbólico. Los máximos valores, tiempos y tasas de crecimiento se estimaron mediante un modelo lineal sujeto a 2 ecuaciones (1 y 2) con un punto de quiebre, descrito por Calderini et al., 1999b. 1. PG, LG, EC = a + bx si (x c) 2. PG, LG, EC = a + bx + bc si (x > c) PG = LG = EC = Peso de grano (mg). Largo de grano (mm). Extensión celular ( m). a = Intercepto con eje x (mg, mm y m). b = Tasa de llenado de grano (mg d -1 ). b = Tasa de elongación del grano (mm d -1 ). b = Tasa de extensión celular ( m d -1 ). c = Duración del llenado de grano o madurez fisiología (d). c = Duración de la elongación de grano (d). c = Duración de la extensión celular (d).

43 29 El contenido hídrico de los granos describe una curva parabólica, representada como un modelo trilineal (ecuaciones 3, 4 y 5), semejante al modelo de Pepler et al., (2005). Éste fue adaptado y optimizado para TBL (Jandell, 1991), para describir los datos de máximo contenido hídrico, la tasa acumulación de agua, duración de la acumulación de agua, duración del contenido hídrico estable (plateau hídrico), máxima duración del contenido hídrico estable y tasa de perdida de contenido hídrico. Este modelo se adaptó para describir la tasa de división de las células endospermáticas y número de células endospermáticas. 3. CH = d + ex si (x f) 4. CH = d + ef si (x > f) 5. CH = d + g(x h) si (x h CH = Contenido hídrico (mg). d = Origen en eje x. e = Tasa de acumulación de agua (mg d -1 ). f = Duración de la acumulación de agua (d). h = Máxima duración del plateau hídrico (d). g = Tasa de perdida de agua (mm d -1 ). x = Tiempo final después de antesis (d).

44 30 Para el cálculo del volumen del grano del grano, se consideró similar a un elipsoide, y se determinó mediante la ecuación 6 (Miralles et al. 1998). 6. VG = 4/3 πabc VG = Volumen de Grano π = 3,1416 a = Largo b = Ancho c = Alto Tinción y conteo de células endospermáticas. La tinción de las células del endosperma del grano de trigo se realizó mediante una modificación del método de Rijven y Wardlaw, (1966). Desde antesis, 2 granos de cada una de las posiciones de las 2 espiguillas centrales de las espigas conservadas en FAA, se fijaron con una solución de etanol-ácido acético (3:1) durante la noche. Se separó y pesó el endosperma con balanza analítica. La muestra se depositó en microtubos de 1,5 ml, se suspendió con 1,0 ml de agua destilada e incubó durante 10 minutos a 60 ºC. El endosperma tratado se tiñó con una solución de 0,3 ml de reactivo de SCHIFF (Fucsina básica 1g, HCl 1N, Na 2 S 2 O 5 1g) durante 1 hora en oscuridad. Se lavó con agua destilada hasta eliminar totalmente el reactivo de tinción. El endosperma lavado se digirió con 0,5 ml de tampon citrato-fosfato ph 5,0 y celulosina al 1% durante 2 horas a 40 ºC. Se maceró y centrifugó a x g durante 20 minutos, se resuspendió

45 31 e incubó por 3 horas a 25 ºC con 1,75 ml de acetato de calcio 12,6 mm, 0,25 ml de acetato de sodio 0,5 mm (ph 4,8) y U/ml de -amilasa. La muestra teñida se observó bajo microscopio, y contaron sus núcleos mediante cámara de neubauer Dimensiones de las células del pericarpio externo y células cruzadas. La dimensión del largo y ancho de las CPE y células cruzadas se realizó bajo microscopio, mediante tinción con verde de metilo (verde de metilo 1% p/v; etano- ác. acético 99:1). Desde antesis, 2 granos de la posición 2 y 3 de las espiguillas centrales de las espigas conservadas en FAA, se les realizó un corte en la región dorsal del grano, se separó la capa de CPE y la capa de células cruzadas. Ambas capas fueron bañadas con una gota de verde de metilo durante 1 minuto y lavadas con agua destilada. Las capas teñidas se emplazaron en un portaobjeto graduado y se visualizaron bajo microscopio a un aumento de 10X. Se capturó su imagen mediante cámara fotográfica digital, se procesaron mediante el programa AxioVision (AxioVs40 V ), y analizaron mediante el programa Excel 2003 y Stadistica 8.0. Las muestras utilizadas para la medición del largo de las CPE fueron desde 5 a 29 DDA, con intervalos de 2 a 3 días, mientras que las mediciones para ancho de las CPE y células cruzadas se realizaron a 5, 7, 13 y 29 DDA en Bacanora, y a los 3, 5, 13 y 27 DDA en Kambara Extracción de RNA total. El RNA total se extrajo mediante el método descrito por el kit de extracción PureLink Plant Reagent (Invitrogen). Para ello, los 4 granos seleccionados desde las