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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl.: G01N 33/68 ( ) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Diagnosis de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. 30 Prioridad: GB Titular/es: GLAXO GROUP LIMITED Glaxo Wellcome House, Berkeley Avenue Greenford, Middlesex UB6 0NN, GB 45 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: West, Michael, Robert 45 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Elzaburu Márquez, Alberto ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Diagnosis de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica Esta invención se refiere a un método nuevo para el pronóstico de un paciente con una enfermedad respiratoria, específicamente enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) es una enfermedad caracterizada por inflamación crónica y obstrucción irreversible del flujo de aire con una disminución de la función del parámetro pulmonar FEV1 que es más rápido de lo normal. La enfermedad tiene dos aspectos patológicos principales, concretamente bronquitis crónica, caracterizada por hipersecreción de mucosidad por las vías aéreas conductoras, y enfisema, caracterizado por cambios destructivos en los alveolos. Actualmente varias sustancias farmacéuticas están indicadas para o se ha visto que son útiles para tratar los síntomas de COPD, incluyendo xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona y bromuro de ipratropio. El (2R,3R,4S, 5R)-2-[6-amino-2-(1S-hidroximetil-2-feniletilamino)purin-9-il]-5-(2-etil-2H-tetrazol-5-il)tetrahidrofuran-3,4-diol también presenta un interés creciente en el tratamiento de COPD, al igual que tiotropio, 4-hidroxi-7-[2-[[2-[[3-(2- feniletioxi)propil]sulfonil]etil]amino]etil-2(3h)-benzotiazolona y ácido cis-4-ciano-4-[3-(ciclopentiloxi)-4-metoxifenil]-ciclohexanocarboxílico. Sin embargo, existe un interés considerable en evaluar la magnitud, si existe, de que estos medicamentos modifiquen la enfermedad, es decir, que afecten la progresión global de la enfermedad bien en términos de la gravedad de los síntomas o de la exacerbación de la gravedad. Además, muchos de los síntomas de COPD son comunes a otras enfermedades respiratorias tales como asma, bronquitis, fibrosis pulmonar y tuberculosis. De acuerdo con esto, COPD se considera una enfermedad poco diagnosticada y, debido a este hecho, un gran número de pacientes no reciben los medicamentos que podrían beneficiarles. Además, existe una necesidad de nuevos medicamentos que serán más eficaces que los medicamentos actuales. A la vista del impacto económico de COPD existe un incentivo considerable para el descubrimiento de fármacos en este área. Los síntomas que presenta COPD son dificultad respiratoria acompañada de una disminución de FEV1. La bronquitis crónica puede diagnosticarse preguntando al paciente si tiene una tos productiva es decir si produce esputo. Los pacientes se tratan tradicionalmente con broncodilatadores o esteroides y se examinan mediante espirometría para detectar la reversibilidad de la obstrucción del flujo de aire. Si la reversibilidad es menor del 15% y, particularmente, si tienen una larga historia de tabaquismo, podrían clasificarse como pacientes COPD. Los criterios de la ATS (American Thoracic Society) para diagnosticar COPD son los siguientes: Proporción FEV1/FVC <0,7 40 FEV1<70% predicho, <15% de reversibilidad a agonista B2 inhalado MÁS: Ensayo de 2 semanas con prednisolona oral- menos del 15% de reversibilidad de FEV1 45 Historia de tabaquismo Excluyendo deficiencia de AT alfa-1 (mediante análisis de sangre) No-atópico (ensayos dermatológicos) y sin historia de atopía 50 Estable: sin exacerbación durante al menos 6 semanas Sin historia de asma infantil Existe una necesidad en la técnica de identificar un indicador fiable y directo del estado patológico COPD (por ejemplo, un marcador suplente) tanto con el fin de distinguir de manera fiable los síntomas de COPD de los de las enfermedades respiratorias mencionadas anteriormente como para predecir cambios en la gravedad y progresión de la enfermedad y respuesta a los medicamentos, antes de que estos cambios se manifiesten clínicamente. Se han detectado niveles elevados de fragmentos de citoqueratina 19 en el fluido de lavado broncoalveolar de pacientes con enfermedad pulmonar inflamatoria crónica y esta observación se sugirió como un marcador del daño del epitelio bronquial (Nakamura, H. et al., 1997: Am. J. Resp. Crit. Care Med. 155, ). Sin embargo, no se intentaron correlacionar los niveles de este marcador con la función pulmonar (por ejemplo, FEV1). Los inventores de la presente invención han identificado sorprendentemente una correlación no apreciada hasta ahora entre la concentración de E-cadherina soluble en el suero sanguíneo y orina en un paciente y la gravedad de COPD determinada como una reducción de FEV1 en el paciente. 2

3 FEV1 es el volumen de aire expulsado de los pulmones en un segundo, empezando desde una posición de máxima inspiración y con un máximo esfuerzo por parte del sujeto. FEV1% es FEV1 expresado como porcentaje de la capacidad vital forzada (FVC). FVC es el volumen total de aire expulsado de los pulmones desde una posición de máxima inspiración y con un máximo esfuerzo por parte del sujeto. FEV1 puede determinarse utilizando un espirómetro para medir el volumen de aire expulsado en el primer segundo de inhalación. La E-cadherina es un miembro de la superfamilia de moléculas de adhesión dependientes de calcio y se expresa en los epitelios, incluyendo los de los pulmones, intestino y piel. Tiene un papel importante en el control de la adhesión intercelular en el epitelio ya que influye en la formación de todas las uniones intercelulares epiteliales. La adhesión está mediada por la interacción entre los dominios extracelulares de dímeros de E-cadherina en células adyacentes. En la unión adherente, los dímeros de cadherina se unen de una manera semejante a una cremallera incrementando la fuerza de la adhesión. En determinadas condiciones hiperproliferativas del epitelio, existe alguna liberación de los dominios extracelulares de E-cadherina como fragmentos solubles, (se-cadherina). Se ha visto que la concentración de se-cadherina en la circulación está incrementada en pacientes con determinados tumores y también que se correlaciona con la clasificación PASI (determinación de la gravedad de la enfermedad) en pacientes con psoriasis (Matsuyoshi, N. et al. (1995) Brit. J. Dermatol. 132, ). La concentración de E-cadherina en el suero sanguíneo u orina puede determinarse utilizando un ELISA específico. Utilizando este ensayo, los inventores han mostrado una correlación lineal directa e inversa entre FEV1 real en pacientes con COPD (como porcentaje del valor predicho de FEV1) y los niveles de se-cadherina en el suero y orina respectivamente. Los resultados de un ensayo que demuestra estas correlaciones están descritos en el Ejemplo 1 y se muestran en las Figuras 1 y 2. Por lo tanto, la concentración de E-cadherina soluble en suero sanguíneo y orina es un indicador molecular para COPD que es capaz de mostrar su gravedad sin recurrir a la evaluación de ningún síntoma excepto la reducción de FEV1 en un paciente. El FEV1 predicho (normal) de un paciente puede calcularse mediante los métodos determinados por Morris JF et al 1971: Am Rev Resp Dis 103, basados en una altura y edad dadas. En los valores influyen la edad, sexo y altura. Un paciente al que ya se ha diagnosticado COPD puede ensayarse para determinar la gravedad de la enfermedad en un momento determinado comparando su concentración de E-cadherina soluble en suero sanguíneo u orina en ese momento con el indicador de gravedad mostrado en las Figuras 1 y 2. La progresión de la enfermedad COPD puede evaluarse haciendo un seguimiento de la concentración de E-cadherina soluble en suero sanguíneo u orina en el tiempo. Se apreciará que la concentración de E-cadherina soluble en suero sanguíneo u orina puede determinarse para el pronóstico, sin embargo el registro de ambas determinaciones confirmará el pronóstico. La firmeza de la confirmación se enfatiza por la correlación inversa entre las dos determinaciones como se muestra en las Figuras 1 y 2. Se apreciará que un beneficio particular y único de la invención es la facilidad de pronóstico que puede realizarse sólo con una simple muestra de sangre u orina. Por lo tanto, según la invención, proporcionamos un método para determinar la gravedad de COPD en un paciente que comprende determinar la concentración de E-cadherina soluble en una muestra de la orina del paciente y determinar la magnitud de la gravedad por referencia a un gráfico de correlación tal como uno que correlaciona FEV1 (como porcentaje del valor predicho) con la concentración de E-cadherina soluble, por ejemplo, como se muestra en la Figura 2. También proporcionamos un método para determinar la gravedad de COPD en un paciente que comprende determinar la concentración de E-cadherina soluble en una muestra de suero sanguíneo del paciente y determinar la magnitud de la gravedad por referencia a un gráfico de correlación tal como uno que correlaciona FEV1 (como porcentaje del valor predicho) con la concentración de E-cadherina soluble, por ejemplo, como se muestra en la Figura 1. Para una mayor confianza, el método puede comprender la determinación de la concentración de E-cadherina soluble en una muestra del suero sanguíneo y orina del paciente y determinar la magnitud de la gravedad por referencia a un gráfico de correlación para cada una tal como uno que correlaciona FEV1 (como porcentaje del valor predicho) con la concentración de E-cadherina soluble, por ejemplo, como se muestra en las Figuras 1 y 2. Como un aspecto adicional de la presente invención proporcionamos un método para tratar un paciente que padece COPD que comprende determinar la magnitud de la enfermedad mediante la identificación de los niveles de E- cadherina soluble en una muestra del suero sanguíneo del paciente seguido de la administración de un compuesto que mejora los síntomas de la enfermedad. 3

4 También proporcionamos un método para tratar un paciente que padece COPD que comprende determinar la magnitud de la enfermedad mediante la identificación de los niveles de E-cadherina soluble en una muestra de orina del paciente seguido de la administración de un compuesto que mejora los síntomas de la enfermedad También proporcionamos un método para tratar un paciente que padece COPD que comprende determinar la magnitud de la enfermedad mediante la identificación de los niveles de E-cadherina soluble en una muestra de suero sanguíneo y orina del paciente seguido de la administración de un compuesto que mejora los síntomas de la enfermedad. Como un aspecto adicional de la invención proporcionamos un método para determinar la respuesta de un paciente con COPD a terapia que comprende hacer un seguimiento de la concentración de E-cadherina soluble en muestras del suero sanguíneo del paciente en el tiempo y determinar la proporción del cambio de la magnitud de la progresión de la enfermedad por referencia a un gráfico de correlación tal como uno que correlaciona FEV1 (como porcentaje del valor predicho) con la concentración de E-cadherina soluble, por ejemplo, como se muestra en la Figura 1. También proporcionamos un método para determinar la respuesta de un paciente con COPD a terapia que comprende hacer un seguimiento de la concentración de E-cadherina soluble en muestras de orina del paciente en el tiempo y determinar la proporción del cambio de la magnitud de la progresión de la enfermedad por referencia a un gráfico de correlación tal como uno que correlaciona FEV1 (como porcentaje del valor predicho) con la concentración de E- cadherina soluble, por ejemplo, como se muestra en la Figura 2. Para una mayor confianza, el método puede comprender evaluar la concentración de E-cadherina soluble en muestras de orina y suero sanguíneo del paciente en el tiempo y determinar la proporción del cambio de la magnitud de la progresión de la enfermedad por referencia a un gráfico de correlación para cada una tal como uno que correlaciona FEV1 (como porcentaje del valor predicho) con la concentración de E-cadherina soluble, por ejemplo, como se muestra en las Figuras 1 y 2. Como un aspecto adicional de la invención proporcionamos un producto para el pronóstico de la gravedad de COPD en un paciente que comprende medios para mostrar la concentración de E-cadherina soluble en una muestra de suero sanguíneo tomada del paciente. También proporcionamos un producto para el pronóstico de la gravedad de COPD en un paciente que comprende medios para mostrar la concentración de E-cadherina soluble en una muestra de orina tomada del paciente También proporcionamos la utilización de medios para mostrar la concentración de E-cadherina soluble en una muestra de orina de un paciente en la fabricación de un producto de pronóstico para la determinación de la gravedad de la enfermedad COPD en un paciente. También proporcionamos la utilización de medios para mostrar la concentración de E-cadherina soluble en una muestra de suero sanguíneo de un paciente en la fabricación de un producto de pronóstico para la determinación de la gravedad de la enfermedad COPD en un paciente. Para los análisis de suero sanguíneo, será adecuado un volumen de µl de sangre tomado de un pinchazo y para el análisis de orina será adecuada una muestra de aproximadamente 1ml tomada a media micción. Los medios para mostrar la concentración de E-cadherina soluble en una muestra de suero sanguíneo u orina comprenden preferiblemente un anticuerpo anti-e-cadherina soluble. Por ejemplo, la concentración de se-cadherina puede determinarse utilizando un kit disponible comercialmente de Takara. Este kit permite la determinación de se-cadherina, utilizando tecnología ELISA estándar y la curva estándar proporcionada, que permite la interpretación de la determinación en términos de una concentración. Ejemplo Se tomaron muestras de suero sanguíneo, orina y esputo inducido de 4 grupos de pacientes (no fumadores sanos, fumadores sanos, asmáticos y pacientes con COPD) y se determinó la concentración de E-cadherina soluble en cada fluido corporal. FEV1 se determinó utilizando el método proporcionado anteriormente. El FEV1 predicho (normal) se calculó para cada paciente según el algoritmo proporcionado en la publicación mencionada anteriormente de Morris et al (1971) y el FEV1 real proporcionado como porcentaje del predicho. La Tabla 1 contiene información respecto a todos los pacientes utilizados en este ejemplo. 65 Cajetilla años se refiere al nivel de exposición al humo. Una cajetilla año es igual a 20 cigarrillos fumados por día durante 1 año. Los medicamentos utilizados en la tabla se refieren a salb : salbutamol y atro : Atrovent (bromuro de ipratropio). 4

5 Los resultados se muestran en las Figuras siguientes: ES T Figura 1 - FEV1 (como porcentaje del valor predicho) como función de la concentración de E-cadherina soluble en suero sanguíneo. Figura 2 - FEV1 (como porcentaje del valor predicho) como función de la concentración de E-cadherina soluble en orina. El valor predicho de FEV1 se determinó según Morris JF et al 1971: Am Rev Resp Dis 103, Los resultados presentados en la Figura 1 muestran que FEV1 (como porcentaje del valor predicho) (y) se correlaciona con la concentración de E-cadherina soluble en suero sanguíneo (x) en pacientes con COPD según el análisis de correlación de rangos de Spearman. El coeficiente de correlación y los valores p para los 4 grupos de pacientes a partir de estos datos son los siguientes: Los resultados presentados en la Figura 2 muestran que FEV1 (como porcentaje del valor predicho) (y) se correlaciona con la concentración de E-cadherina soluble en orina (x) en pacientes con COPD según el análisis de correlación de rangos de Spearman. El coeficiente de correlación y los valores p para los 4 grupos de pacientes a partir de estos datos son los siguientes: Las dos Figuras 1 y 2 muestran que no existe correlación entre FEV1 y la concentración de E-cadherina soluble en orina ni suero sanguíneo de asmáticos

6 REIVINDICACIONES Un método para determinar la gravedad de la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (COPD) en un paciente que comprende medir la concentración de E-cadherina soluble en una muestra de la orina y/o suero sanguíneo del paciente y determinar la magnitud de la gravedad por referencia a un gráfico de correlación que correlaciona el Volumen Espiratorio Forzado en el primer segundo de espiración (FEV1) con la concentración de E-cadherina soluble. 2. Un método según la reivindicación 1, que comprende medir la concentración de E-cadherina soluble en una muestra del suero sanguíneo del paciente. 3. Un método según la reivindicación 1, que comprende medir la concentración de E-cadherina soluble en una muestra de orina del paciente. 4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende medir la concentración de E-cadherina soluble en una muestra del suero sanguíneo y orina del paciente. 5. Un método para determinar la respuesta de un paciente con COPD a terapia que comprende hacer un seguimiento de la concentración de E-cadherina soluble en una muestra del suero sanguíneo y/o orina del paciente en el tiempo y determinar la proporción del cambio de la magnitud de la progresión de la enfermedad por referencia a un gráfico de correlación que correlaciona FEV1 con la concentración de E-cadherina soluble. 6. Un método según la reivindicación 5, que comprende hacer un seguimiento de la concentración de E-cadherina soluble en una muestra de orina del paciente. 7. Un método según la reivindicación 5, que comprende hacer un seguimiento de la concentración de E-cadherina soluble en una muestra del suero sanguíneo del paciente. 8. Un método según la reivindicación 5, que comprende hacer un seguimiento de la concentración de E-cadherina soluble en muestras de orina y suero sanguíneo del paciente en el tiempo. 9. Un producto para el pronóstico de la gravedad de COPD en un paciente que comprende medios para mostrar la concentración de E-cadherina soluble en una muestra de suero sanguíneo y/o una muestra de orina tomada del paciente y un gráfico de correlación que correlaciona FEV1 con la concentración de E-cadherina soluble. 10. Un producto según la reivindicación 9, en el que el medio para mostrar la concentración de E-cadherina soluble comprende un anticuerpo anti-e-cadherina soluble. 11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el gráfico de correlación correlaciona FEV1 (como porcentaje del valor predicho) con la concentración de E-cadherina soluble

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