Aplicaciones de la Citometría de Flujo en la práctica clínica: Leucemias agudas

Transcripción

1 Aplicaciones de la Citometría de Flujo en la práctica clínica: Leucemias agudas Buenos Aires, 9 de Septiembre de 2013

2 Temario Hematopoyesis, ontogenia. Marcadores de maduración. Leucemias agudas Clínica Clasificación Fenotipo y genotipo características de cada entidad Enfermedad Mínina Residual

3 Hematopoyesis I Proceso de producción de células sanguíneas en la MO y en los órganos linfáticos primarios. La vida ½ de las distintas células es muy variable (PMN horas y GR 120 días). La regeneración de los elementos de la sangre se halla regulada fisiológicamente generando la homeostasis del sistema. La producción de células de cada linaje se halla regulada por un complejo número de factores humorales, de contacto e interacción celular.

4 Hematopoyesis II El sistema comprende 3 compartimientos El más primitivo se halla constituído por las células pluripotenciales hematopoyéticas o Stem cells. (mínima proporción del total). En el adulto están en MO. El 2 se halla compuesto por células pluripotenciales con capacidad de diferenciación hacia los distintos linajes y con capacidad de respuesta a distintos factores como EPO, G-CSF, GM-CSF. En el 3 están las células maduras con funciones especializadas y capacidad proliferativa.

5 Hematopoyesis III El microambiente de la MO es fundamental para la hematopoyesis, pues sin el contacto célula-célula ni las citoquinas hematopoyéticas no habría diferenciación. (las células pluripotenciales no proliferan en SP). La hematopoyesis definitiva se produce en MO después de la semana 22. Hasta que no se forman la stem cell linfoide y la stem cell mieloide no hay compromiso de linaje. De la stem cell linfoide surgen los linfocitos, NK y dendríticas de estirpe linfoide. De la stem cell mieloide los GR, las plaquetas, el linaje mielomonocítico y dendríticas mieloides,

6 Ontogenia de células sanguíneas.

7 HEMATOPOYESIS NORMAL Sangre Periférica Médula Osea Linfocito B maduro CFU-T LinfocitoT maduro CFU-B IL-7 CFU-L CFU-NK IL-3 Célula NK madura CFU-CD Célula Dendritica de estirpe linfoide IL-7 CFU-M M-CSF CFU-G G-CSF CFU-GM Stem Cell IL-3 CFU-Ba IL-4 CFU-CD GM-CSF GM-CSF EPO BFU-E TPO BFU-Mk Macrófago Neutrófilo IL-5 CFU-Eo Monocito GM-CSF+ IL-4 Eosinófilo SCF CFU-GEMM Tejidos Basófilo Célula Dendritica de estirpe mielomonocítica CFU-Mast Hematies Plaquetas Mastocito

8 Ontogenia Linfoide B El linfocito B puede diferenciarse hasta CP para secretar Ig. Este proceso se divide en estadíos de acuerdo a la expresión de Ag y Rc de MB. Célula B progenitora Célula pre-preb Célula preb Célula B inmadura. Célula B en reposo. Célula B diferenciada

9 Maduración Linfoide B C TdT DR CD34 CD117 (CD22) TdT CD79 DR CD34 CD19 (CD22) TdT TdT CD79 CD79 DR (CD34) CD19 CD10 CD22 (CD20) DR (CD34) CD19 CD10 CD20 CD22 DR CD19 CD20 CD22 CD21 IgMs CD79 Célula B célula pre-preb Célula preb Célula B progenitora inmadura DR CD19 CD20 CD22 CD21 IgMs Ig Ds CD79 Célula B reposo DR CD19 CD20 CD22 IgMs Ig Gs CD79 Célula B diferenciada (DR) CD38 PCA-1 B-B4 B-B2 célula plasmática

10 Maduración Linfoide B Van Lochem, et al; Clinical Cytometry (2004)

11 Maduración Linfoide B (Médula ösea: niño de 4 años: Se seleccionó la población CD19 positiva Van Lochem, et al; Clinical Cytometry (2004)

12 Maduración Linfoide B Relación con la edad Médula ösea de adulto de 69 alños, se observa un neto predominio de la población más madura. Relación con tratamientos Médula regenerativa de un niño de 3 años post quimioterapia. Se observa un neto predominio de la población más inmadura con muy escasa población CD20 (+) Van Lochem, et al; Clinical Cytometry (2004)

13 Maduración Linfoide B Marcación de cadenas de Ig. Se observa que la célula preb (verde) presenta cadenas citoplasmáticas pero no de superficie. Las poblaciones B inmadura (amarilla) y B madura violeta presentan una distribución similar de cadenas Kappa y Lambda Van Lochem, et al; Clinical Cytometry (2004)

14 Ontogenia Linfoide B La aparición de la cadena citoplasmática define el estadío preb. Tanto el CD19 como el CD79a son considerados pan-b, por encontrarse durante toda la ontogenia. El CD23 sólo aparece cuando el linfocito B se activa. En el adulto la diferenciación desde la célula progenitora B hasta la célula B en reposo ocurre en MO y la diferenciación posterior hasta CP ocurre en SP o en tejidos linfoides. El CD22 sigue siendo un marcador específico importante para asignar linaje.

15 Ontogenia linfoide T La diferenciación de los linfocitos T ocurre parte en MO y parte en el timo. Precursor linfoide Protimocito Timocito inmaduro Timocito común Timocito maduro Célula T madura

16 Ontogenia linfoide T Timo medular SP (CD3) Extra-tímico (CD3) Timo cortical CD3 CD3 TdT TdT TdT TdT CD34 DR CD34 DR CD7 (CD2) CD7 CD2 CD5 CD7 CD2 CD5 CD1a CD4 y/o CD8 Precursor T Linfoide Protimocito Timocito inmaduro Timocito común CD7 CD2 CD5 CD3 TCR CD4 (CD7) CD2 CD5 CD3 CD4 TCR (CD3) CD7 CD2 CD5 CD8 CD3 TCR Timocito maduro CD7 CD2 CD5 CD8 CD3 TCR célula madura

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18 Ontogenia linfoide T El CD2, CD5, CD7 y el CD3c son considerados pan-t. Durante la ontogenia se produce el rearreglo del TCR. Existen 2 tipos de TCR el clásico TCR que se encuentra en la mayoria de los linfocitos T (>90.0%) y un alternativo TCR (aprox 5.0%). La maduración en los T ocurre en MO y timo y a su vez en el timo en distintos compartimientos (corteza y médula).

19 Células Dendríticas: DR+, CD19,CD20(B); CD3(T); CD56,CD16 (NK); CD14(Mo) Negativos DC mieloides CD11c+CD123BDCA-1,BDCA-3 DC Linfoides CD11c-CD123+ BDCA-2,BDCA-4

20 Cambios fenotípicos de la diferenciación de células dendríticas linfoides STAGE I STAGE II STAGE III STAGE IV CD 123 PE CD 36 FITC 103 HLA DR PERCP CD 117 APC BDCA4 PE CD 33 APC BDCA 2 PE 2 10 CD 34 APC 101 Orfao et al, Universidad de Salamanca

21 Ontogenia mieloide La serie mieloide comparte con la monocitoide ciertos Ag comunes pero a medida que va ocurriendo la maduración van apareciendo características particulares de cada grupo. Los distintos estadíos son: CFU-GM Mieloblasto Promielocito Mielocito Metamielocito Neutrófilo

22 Cambios fenotípicos diferenciación mieloide MYELOBLAST PROMYELOCYTE MYELOCYTE METAMYELOCYT BAND/ NEUTROPHIL CD13 CD13 CD CD11b CD33 CD CD65 CD64 CD CD16 CD34 HLA-DR CD117 CD54 Orfao et al, Universidad de Salamanca

23 Diferenciación mieloide CFU-GM Mieloblasto promielocito mielocito metamielocito neutrófilo CD34 CD33 CD65 CD15 CD13 CD64 MPO

24 Ontogenia mieloide Maduración normal de la serie granulocítica considerando la complejidad celular SSC, CD13, Cd16 y CD11b. Van Lochem, et al; Clinical Cytometry (2004)

25 Ontogenia mieloide: eosinófilos y Basófilos Para poder observar los granulocitos eosinófilos y basófilos se muestra la MO de un paciente con LMC en fase acelerada. Si bien los basófilos no son fáciles de separar de los lnfocitos usando FSC y SSC, si es posible al usar CD45 vs SSC y CD13 vs Cd11b. Van Lochem, et al; Clinical Cytometry (2004)

26 Ontogenia mieloide El CD 34 y el DR se pierden en el estadío promielocito. La expresión de CD33 es variable durante la maduración. El CD65 generalmente aparece en la maduración luego de la desaparición de CD34. La MPO junto con la lactoferrina son 2 útiles marcadores de diferenciación mieloide. La MPO (componente de los gránulos azurófilos o 1 ) aparece desde el estadío mieloblasto. La lactoferrina (gránulos 2 o específicos) aparece posteriormente en el estadío de mielocito.

27 Ontogenia monocitoide La serie monocitoide presenta los siguientes estadíos en su maduración: CFU-GM Monoblasto Promonocitoo Monocito

28 Cambios fenotípicos diferenciación monocitoide MONOBLAST PROMONOCYTE MONOCYTE CD14 CD45 CD11c HLA-DR CD34 CD36 CD64 CD11b CD117 Orfao et al, Universidad de Salamanca

29 Maduración monocítica CFU-GM Monoblasto Promonocito Monocito CD34 CD33 HLA-DR CD64 CD15 CD14 CD4 CD13

30 Maduración monocítica Maduración monocítica normal, Los colores corresponden a los dibujos superiores. La combinación de bajo CD45 expression y bajo SSC es usada para identificar precursores, Los mielo/monoblastos (puntos rojos), los puntos azules representan precursores B. los puntos verdes representan los promyelocytes, Tres estadios pueden diferenciarse incluyendo el myelo/monoblast stage: CD34 CD33CD14 myelo/monoblasts, CD34/CD33highCD14 pro-monocytes y CD34CD33highCD14 monocytes (F and G). Van Lochem, et al; Clinical Cytometry (2004)

31 Ontogenia monocitoide Como características distintivas respecto a la serie mieloide, tanto el HLA-DR como el CD33 se mantienen hasta la etapa final. Presenta en toda la diferenciación la presencia de CD4. Aparece en las etapas finales el CD14. El CD13 desaparece en las etapas finales de la maduración

32 Diferenciación megacariocítica La serie megacariocítica presenta características particulares, expresando un gran número de Ag en su etapa madura (CD36, CD41a, CD42b, CD61). La serie presenta los siguientes estadíos en su maduración: CFU-EM Megacarioblasto Micromegacariocito Megacariocito Plaquetas

33 Cambios fenotípicos diferenciación megacariocítica INMATURE MATURE CD36 CD41 CD42 CD61 CD117 CD34 HLA-DR CD13 CD33 CD45 Orfao et al, Universidad de Salamanca

34 Diferenciación megacariocítica CFU-EM Megacarioblasto Micromega Megacariocito cariocito Plaquetas CD34 CD33 CD41a CD61 CD42b CD36

35 Diferenciación megacariocítica Los marcadores CD41a (complejo GP IIb/IIIa), CD42b (GP Ib) y CD61 (GP IIIa) son útiles en el diagnóstico de neoplasias megacariocíticas. (LMA M7 clasificación FAB)

36 Diferenciación eritroide La serie eritoride posee un considerable número de etapas en su maduración. La característica principal es la pérdida del CD45 (pan-leucocitario) durante la etapa del normoblasto basófilo. La serie presenta los siguientes estadíos en su maduración: CFU-E Proeritroblasto Normoblasto basófilo Normoblasto policromático Normoblasto ortocromático Reticulocitos GR maduros

37 Cambios fenotípicos diferenciación eritroide INMATURE MATURE CD36 CD71 GphA CD34 CD117 HLA-DR CD45 CD13 CD33 Orfao et al, Universidad de Salamanca

38 Diferenciación eritroide CFU-E Proeritroblasto Normoblastos Reticulocito GR Basófilo Policromático Ortocromático CD34 CD45 GPA CD71 CD36

39 Diferenciación eritroide Desarrolo eritroide normal en MO. En una muestra normal sólo pueden apreciarse los eritroblastos ya que los pro eritroblastos se encuentran en muy pequeña proporción y los eritrocitos son lisados en el procedimiento Van Lochem, et al; Clinical Cytometry (2004)

40 Diferenciación eritroide Paciente con MO en regeneración donde se pueden apreciar las 3 subpoblaciones los puntos celestes son GR no lisados Van Lochem, et al; Clinical Cytometry (2004)

41 Diferenciación eritroide El CD71 esta presente en todas las etapas de maduración del GR hasta la etapa de reticulocitos. La glicoforina A (GPA) (CD235a) aparece en la etapa proeritroblasto y permanece en el GR maduro adquiriendo una gran intensidad. El CD 45 desaparece a partir de la etapa normoblasto. Los 2 primeros marcadores son importantes en el diagnóstico de neoplasias eritorides (LMA M6)

42 Marcadores de Linaje Los principales marcadores de linaje de las distintas series son: Linaje B: CD22, CD 79a (c), Ig sup, C y CD19. Linaje T: CD3 m/c, TCR m/c, CD2 y CD5. Linaje dendrítico: CD123, CD11c, BDCA 1-4 Linaje mieloide: MPO, CD13 c/m, CD33, CD65. Linaje monocitoide: CD14, CD64, CD33,DR, CD4 Linaje megacarioblastico: CD41a, CD42b y CD61. Linaje eritroide: GPA, CD71, CD36 (int)

43 Leucemias Agudas Las LA son proliferaciones clonales de células hematopoyéticas que determinan una disminución en la producción de las células normales por parte de la MO. La incidencia anual se estima en 3 a 5 por cada habitantes y existen importantes variaciones étnicas y regionales. En niños es la principal causa de muerte por neoplasias siendo las LLA las que ocurren con mayor frecuencia (más del 80.0% de los casos).

44 Presentación Clínica en LA Generalmente no hay síntomas específicos siendo los principales: Anemia, transtornos hemorragíparos, fiebre sin causa aparente, infecciones y dolor óseo. La adenopatía y la hepatoesplenomegalia son más frecuentes en niños. Lesiones en piel máculo-papulosas o nodulares por infiltración de la dermis de células neoplásicas. Puede existir compromiso de SNC, ya sea por meningiosis leucémica o por presencia de masa intracerebral.

45 Diagnóstico de la LA La confirmación diagnóstica se realiza por la clínica, la morfología tanto de SP como MO, la citoquímica, inmunofenotipo, citogenética y BM de la M.O. En general en el momento del diagnóstico la infiltración blástica en MO suele estar entre el 50 y el 100 %, variando según el subtipo de LA involucrado y la edad del paciente. En pediatría generalmente la infiltración es mayor.

46 Diagnóstico de LA Es preferible realizar el diagnóstico en MO ( 10 % de las LLA no tienen blastos en SP). Problema en la punción : Fibrosis o empaquetamiento. A veces es necesaria la biopsia medular o punciones en distintas zonas.

47 Clasificación de LA (FAB) FAB: (1976 y rev en 1985) basada en criterios morfológicos y citoquímicos de los elementos inmaduros. Clasifica las LA en linfoblásticas y no linfoblásticas. Las primeras se clasifican de acuerdo a su morfología en L1: cromatina nuclear fina, nucleólos y alta relación Núcleo/Citoplasma. L2: De mayor tamaño y con morfología variada. L3: Semejantes al linfoma de Burkitt (con vacuolas y más grandes).

48 Clasificación de LA (FAB) LA no linfoblásticas De acuerdo a morfología y citoquímica se dividen en 8 grupos: M1(mieloblástica), M2 mieloblástica con diferenciación), M3 (promielocítica), M4 (mielomonocítica), M5a (monoblástica), M5b (monocítica), M6 (eritroide) y M7 (megacarioblástica).

49 Problemas con la FAB LA con menos del 30.0 % de Blastos. Arbitraria, hay mejores criterio para diferenciar. linaje. No toda LA se puede asignar a un subtipo FAB. Categorias no fácilmente reproducibles. Ej M1 y M2. No tiene en cuenta Leucemias bifenotípicas ni indiferenciadas, Excluye información importante como IMF, BM y citogenética.

50 Clasificación EGIL (1995) EGIL (grupo europeo para la inmunotipificación de Leucemias agudas) 1995 en Holanda trato de unificar criterios en la clasificación considerando como base la inmunología. Actualmente es mucho más útil para las LLA que para las LMA.

51 Clasificación (EGIL) LLA Linaje B. 1- LLA B-I (prob), 2- B-II (común), 3- B-III (preb) y 4B-IV (madura). Linaje T. 1-LLA T-I (pro-t), 2- T-II (pret), 3- T-III (cortical), 4T-IV (madura), 5- TCR y TCR. LLA My. LLA con expresión de 1 o más Ag mieloides.

52 Clasificación (EGIL) LMA Mielomonocítica. Eritoride Megacariocítica LMA poco diferenciada (Mo) LMA Ly Leucemias bifenotípicas Leucemias indiferenciadas

53 Puntuación EGIL (1996) Puntos Linaje B Linaje T MPO, CD13c 2 m/c CD22, Ig Sup, Cu 1 CD19, CD20, CD2, CD5, mcd13,cd33 CD36, CD65, CD79a CD8 CD CD10, CD24 TdT m/c CD3 m/c TCR Mieloide MK Eritroide CD41a, CD42b CD61 GPA, CD71 CD36 (i) CD36 (i) CD7, CD1a CD11b/c CD14, CD15 CD4 CD117 Para asignar un linaje determinado a los blastos, el score debe ser >2 Una LA se define como bifenotípica si el puntaje resulta >2 para más de un linaje

54 Clasificación de LA (MIC) MIC (1990). Posteriormente MIC-M Al cobrar relevancia la inmunotipificación y la citogenética (FISH) se trato de ampliar la base de la clasificación más allá de los criterios morfológicos y citoquímicos de los elementos inmaduros, incorporando la inmunología, la citogenética y la BM. M1/t(9;22) (q34;q11)/bcr-abl Fusion M2/t (8;21) (q22;q22)/aml1-eto Fusión M3 o M3v/t(15;17)(q22;q21)/PML-Rara Fusion M7/t(1;22) (p13;q13)

55 Clasificación OMS (2008) Divide las neoplasias linfoides en neoplasias de precursores y de componentes maduros linfoides para ambos linajes B,T e incluyen las leucemias y linfomas de precursores B o T y las leucemias y linfomas de componentes maduro B o T. Además subdivide las neoplasias de precursores B según las anormalidades moleculares o citogenéticas que presentan las cuales son importantes factores pronósticos.

56 Clasificación OMS (2008) Leucemias de linaje ambiguo LA indiferenciada LA de fenotipo mixto con alteración del BCR-ABL1. LA de fenotipo mixto con alteración del MLL. LA de fenotipo mixto B-mieloide. LA de fenotipo mixto T-mieloide. LA, linfoma de células NK (entidad provisional)

57 Clasificación LMA OMS (2008) LMA con anomalías genéticas recurrentes -LMA con t(8;21)(q22;q22), (AML1/ETO) -LMA con eosinófilos anormales en médula e inv(16)(p13q22) ó t(16;16)(p13;q22), (CBFb/MYH11) -LPA con t(15;17)(q22;q12), (PML/RARa) y variantes -LMA con anomalías en el 11q23 (MLL) LMA y Sindromes Mielodisplásicos, relacionados a la terapia LMA, sin otra categorización -LMA, mínimamente diferenciada -LMA sin maduración -LMA con maduración -Leucemia Mielomonocítica Aguda -Leucemia monoblástica/leucemia monocítica aguda -Leucemia eritroide aguda (Eritroide/Mieloide y Eritroleucemia Pura) -Leucemia megacarioblástica aguda -Leucemia aguda basófila -Panmielosis aguda con mielofibrosis -Sarcoma mieloide

58 Diagnóstico de LLA Inmunofenotipo Consiste en la determinación de los antígenos de membrana o citoplasmáticos realizados mediante el uso de Ac Mo específicos.

59 Conceptos importantes en inmunotipificación de LA Infidelidad de linaje: Coexpresión en la misma célula de un Ag de linaje distinto al linaje de origen de los blastos. Ej la expresión de CD 19 o CD7 en algunas LMA Asincronismo madurativo: Coexpresión de 2 Ag que en la ontogenia normal corresponden a estadíos madurativos diferentes. Sobre o sub expresión antigénica: o en la intensidad de fluorescencia de un Ag por encima de la intensidad observada en la ontogenia normal.

60 CF: LLA Fenotipos aberrantes LLA- B Asincronía LLA-T CD34+/CD10+d CD34+ CD20+ CD7+/CD34+ (ectópico) Sobreexpresión CD10; CD58; CD34; CD11a; CD19 etc. CD7; CD99 Disminución de la expresión CD45; CD38; CD20; CD11a; CD19 etc. CD3 superf; CD45; Infidelidad de linajes LLA-My+ CD13 CD33 LLA-My+ CD13 CD33 Madurativa

61 LLA Frecuencia de alteraciones genéticas (%) C myc t (12;21) Hiperdiploidia t (1;19) t (9;22) BCR-ABL1 fusion BCR-ABL1 like IKFZ1 t (4;11) Hipodiploidía Adulto Desconocido Niños

62 LA correlación fenotipo-genotipo A medida que se ha ido adquiriendo conocimiento de las distintas alteraciones genéticas que ocurren en la LA, se ha observado que cada una de ellas presenta un inmunofenotipo característico, de tal forma que al realizar la CF nos da una idea de la posible alteración genética que presenta el paciente

63 Hrusak et al, Leukemia (2002)

64 Clasificación LLA de precursores B ccd22+, ccd79a+, CD19+, HLA-DR+ Pro B: CD10 Común: CD10+, cad - Pre B: CD10+/-, cad +, Ig Sup - B madura: CD10+/-, Ig Sup+ ( ó ) Clasificación EGIL

65 Caminos madurativos y blastos en LLA B Blastos B Blastos B CD20 Diferenciación normal Blastos B Blastos B CD10 Gentileza Dr.Jorge Rossi

66 LLA B. Características Mucho más frecuente en niños entre 2 y 6 años. Curso clínico agudo agresivo. Inmunofenotipo: CD79a+,TdT+, CD34+/-, CD45 débil o negativo, CD19+, CD22+, CD10+, CD20-/+, cad -/+, HLA-DR+, CD38+, (CD15, CD13, CD33 aparecen en alteraciones citogenéticas específicas) Frecuente la hiperdiploidía. (BP) B-III se asocia a t(1;19). (PP) B-IV (L3) se trata con protocolo de Burkitt. CD34 BP en pediatría y MP en adultos Asincronía de Ag: CD34 y CD20. (EMR) B-I puede tener asociado CD15/CD65 (no se considera LLA My) ( alteraciones del gen MLL).

67 LLA B. Características

68 Clasificación LLA de precursores T ccd3+, CD7+, TCR+/-, HLA-DRPro T: CD2 -, CD5 -, CD8 Pre T: CD2+,y/o CD5+ y/o CD8+ Intermedia: CD1a+,CD4+/CD8+,CD3+/- T madura: CD1a-, CD3+, TCR Clasificación EGIL

69 LLA T Características Se presentan en niños mayores. Alto recuento, masa mediastinal y compromiso del SNC. En general son de peor pronóstico que las B. Early T cell con ausencia de CD1a y CD8, débil expresión de CD5 y presencia de marcadores stem (CD34 o CD117) o mieloide (DR, CD13,CD33, CD11b, o CD65), se asocia a grupo de alto riesgo y PP (Coustan Smith et al 2009). CD 1a en algunos estudios se asocia a BP. CD7 sin especificidad de linaje.

70 LLA T Características Cortical tardío: CD3c+,TdT+/-, CD1a+, CD2+, CD5+, CD4+, CD8+, CD10-/+ Cortical temprano: CD3c+, TdT+, CD2+, CD5+, CD7+, CD4(-), CD8(-), CD10+/ Fenotipos más precoces: CD34+, ccd3+, CD7+, CD10+

71 LLA T cortical temprana FSC-Height -> CD7 -> CD45 -> CD3 -> CD38 -> CD4 ->

72 LLA B My Es más frecuente en adultos que en niños. Los Ag mieloides más comúnmente involucrados son CD11b (8.9% ) y CD13 (6.5 %) Los blastos son generalmente tipo L2 y son positivos para la ANAE. En adultos: presentan menor sobrevida.

73 LMA 90 % de las LA del adulto. Incidencia anual 3,5 por habitantes y se incrementa con la edad.(1 caso cada a los 30 años hasta 1 caso cada a los 60 años). Edad media de diagnóstico 67 años con 6 % de los pacientes menores de 20 años y 34 % mayores de 75 años. La clasificación FAB ha sido reemplazada por la de la OMS.

74 LMA La LMA se define por la presencia de blastos de las distintas estirpes en un porcentaje superior al 20 % en MO. Ciertas alteraciones genéticas son clasificadas como LMA independientemente del conteo de blastos.

75 LMA I-LMA CON TRANSLOCACIONES CITOGENETICAS RECURRENTES: LMA con t(8:21)(q22;q22). LMA1 (CBF )/ETO LEUCEMIA PROMIELOCITICA AGUDA (LMA con t(15;17)(q22:q11-12) y variantes. PML/RAR LMA con EOSINOFILOS MEDULARES ANORMALES (inv(16)(p13q22) ó t(16;16)(p13:q11). CBF /MYH11) LMA con ANOMALIAS 11q23 (MLL) II-LMA CON DISPLASIA MULTILINEAL con sindrome mielodisplásico previo sin sindrome mielodisplásico previo

76 LMA III-LMA Y SMD RELACIONADOS CON TERAPIA PREVIA agentes alquilantes epipodofilotoxina (algunas pueden ser linfoides) otros tipos IV- LMA SIN OTRA CARACTERIZACION (NOS) LMA mínimamente diferenciada LMA sin maduración LMA con maduración leucemia mielomonocítica aguda leucemia monocítica aguda leucemia aguda eritroide leucemia aguda megacariocítica leucemia aguda basofílica panmielosis aguda con mielofbrosis sarcoma mieloide

77 INCIDENCIA DE FENOTIPOS ABERANTES EN LMA Asincronismo en la expresión antigénica 80% Expresión de antígenos de otro linaje 26% Sobreexpresión antigénica 20% FSC/SSC anormal 17% Patrones inmunofenotípicos aberrantes 85 a 95 %

78 LMA: FENOTIPOS ABERRANTES asincronismo en la expresión antigenica 80% CD34+ HLA-DR - CD33+ 9% CD117+ CD11b+ 5.5% CD34+ CD56+ 8% CD117+ CD33- CD34- CD15+ 4% CD34+ CD11b+ 5% CD117+ HLA-DR - CD % CD34+ CD33++ 3% CD117- HLA-DR - CD15-2.3% CD34+ CD14+ 3% CD117- HLA-DR + CD33+ CD34-0.8% CD34+ CD117+ HLA-DR - 2.3% CD33++ HLA-DR - CD34- CD15- CD14-17% CD34+ CD117- CD % CD33- CD13-14% CD34+ CD33- CD13+ HLA-DR + 1.5% CD33+ CD13-7% CD34+ CD33- CD13+ HLA-DR - 0.8% CD33+ HLA-DR -+CD4+ CD45dim 0.8% CD34+ CD33- CD117+ HLA-DR + 0.8% CD33++ HLA-DR -+CD15- CD14-0.8% CD117+ CD33+ HLA-DR 11% CD33+ CD45dim CD34- CD15-0.8% CD117+ CD34- CD15-6% CD33+ HLA-DR+ CD56- CD13-0.8%

79 LMA: FENOTIPOS ABERRANTES Expresión de antígenos de otro linaje CD2 20 ± 2% CD7 8 ± 1 % CD19 2 ± 0,3 % CD ±0,1 % CD5 0.8 ±0,1 % Sobreexpresión antigénica CD % CD34 10 % CD13 3% CD117 1,% CD15 0.7% HLA-DR 0.7%

80 I-LMA CON TRANSLOCACIONES CITOGENETICAS RECURRENTES LMA con t(8:21)(q22;q22). LMA1 (CBF )/ETO. (ex M2) LEUCEMIA PROMIELOCITICA AGUDA (LPA) (ex M3) (LMA con t(15;17) (q22:q11-12) y variantes. PML/RAR LMA con EOSINOFILOS MEDULARES ANORMALES inv(16) (p13q22) ó t(16;16)(p13:q11). CBF /MYH11) (ex M4Eo) LMA con ANOMALIAS 11q23 (MLL). (ex M5a)

81 LMA con t(8:21)(q22;q22) 5-12% de las LMA, pacientes jóvenes y con pronóstico favorable. En la clasificación FAB M2 Posible presencia de tumores mieloides extramedulares (sarcomas granulocíticos) Perfil inmunofenotípico: - Antígenos mieloides (Mieloperoxidasa, CD13 y CD33 heterogéneo), CD34 - Antígenos no habituales en serie mieloide: CD19 y CD56

82 LMA con t(8:21)(q22;q22) FSC-Height -> DER CD38 FIT C -> DER CD45 FIT C -> DER CD45 FIT C -> DER CD38 FIT C -> DER M PO FIT C -> DER

83 LMA con t(8:21)(q22;q22) CD11b FIT C -> DER CD2 FIT C -> DER CD36 FIT C -> DER Anti-HLA-DR FIT C -> DER

84 LEUCEMIA PROMIELOCITICA AGUDA LMA con t(15;17) (q22:q11-12) y variantes. Entre 5 a 15% de las LMA, más frecuente en latinos. Clasificación FAB M3 conocida como LAP. Variedad hipergranular (alto FSC/SSC) y otra variante hipoganular con alto recuento celular y bajo FSC/SSC, Los promielocitos anormales liberan sustancias procoagulantes que activan la cascada de la coagulación CID siendo la principal causa de muerte en el diagnóstico agudo. La translocación t(15;17) genera la proteina de fusión PML - RAR. que bloquea el proceso de diferenciación inducido por Acido Retinoico Otras translocaciones: t(11,17)(q23,q21), t(5,17)(q32,q12); t(11,17)(q13,q21)

85 LEUCEMIA PROMIELOCITICA AGUDA LMA con t(15;17) (q22:q11-12) y variantes.pml/rar De todas la LMA es la forma más curable. Tiene un pronóstico favorable y es sensible al tratamiento con acido transretinoico. Perfil inmunofenotípico: - HLADR y CD34 negativos o positivos en una subpoblación de los blastos. - CD13 + homogéneo - CD33 + heterogéneo - CD15 -/+d (patrón CD34/CD15) - CD2-/+d - autofloresencia

86 LMA con t(15;17) (q22:q11-12) PML/RAR Forward Scatter -> DER CD34 PerCP -> DER CD45 PerCP -> DER CD38 FIT C -> DER Anti-HLA-DR FIT C -> DER CD33 PE -> DER

87 LMA con t(15;17) (q22:q11-12) PML/RAR CD64 FIT C -> DER CD15 FIT C -> DER CD11b FIT C -> DER MPO FITC -> DER

88 LMA con EOSINOFILOS MEDULARES ANORMALES inv(16) (p13q22) ó t(16;16)(p13:q11). CBF /MYH11 Presentan más del 5% de eosinófilos atípicos y monocitos anormales, representan entre el 6 y el 10 % de las LMA. Es más frecuente en adultos y en la clasificación FAB se la conocía como M4 Eo. Suelen tener compromiso del sistema nervioso central y su pronóstico es favorable Inmunofenotipo: blastos mieloides + monocitos anormales + eosinófilos anormales (MPO+ fuerte), CD2-/+ débil

89 LMA con anomalías del 11q23 (MLL) Presenta diferenciación monocítica, corresponde al 5 a 7 % de las LMA y es probable hallarlas en pediatría. Clasificación FAB M5a Pueden presentar infiltración de tejidos (gingival, piel) (sarcomas extramedulares, El gen afectado es el gen MLL Pronóstico adverso Perfil inmunofenotípico: antígenos mieloides (CD13,CD33) de stem cell (CD117,DR y a veces CD34) y de diferenciación monocítica (CD14 a veces, CD64, CD4, CD36, CD11b y lisozima). Suelen marcar CD7 y CD56. El Ac 7.1 (NG2) es un marcador de esta patología

90 LMA con ANOMALIAS 11q23 (MLL) FSC-Height -> LCV CD34 PerCP -> LCV CD34 FIT C -> LCV CD15 FIT C -> LCV CD34 FIT C -> LCV PE -> LCV

91 PATRONES INMUNOFENOTIPICOS DE LMA CON ALTERACIONES GENETICAS RECURRENTES t(15; 17) MLL 11q23 APL/M3 M4, M5 >M1, M2 FSC/SSC + cmpo + CD34 - (+subpoblación) DR CD13 heterogéno CD33 ++ homogéneo CD15 -/d CD11b -/+ CD11c CD14 CD4 CD CD56* -/+ CD19 CD7 CD2 -/+ * Pronóstico + + -/débil homogéneo / /d -/d t(8; 21) M2 Inv/del(16) M4 Eo /+ -/+ -/+ -/ /+ + -/+ -/+ Orfao et al

92 II-LMA CON DISPLASIA MULTILINEAL con sindrome mielodisplásico previo sin sindrome mielodisplásico previo III- LMA Y SMD RELACIONADOS CON TERAPIA PREVIA agentes alquilantes epipodofilotoxina (algunas pueden ser linfoides) otros tipos

93 IV-LMA SIN OTRA CARACTERIZACION LMA mínimamente diferenciada LMA sin maduración LMA con maduración leucemia mielomonocítica aguda leucemia monoblástica y monocítica aguda leucemia aguda eritroide leucemia aguda megacariocítica leucemia aguda basofílica panmielosis aguda con mielofbrosis

94 LMA mínimamente diferenciada Morfológicamente los blastos son tipo L2 de la antigua clasificación FAB, es equiparable a la FAB M0 de LMA. Es importante el diagnóstico diferencial con LLA, leucemia megacarioblástica, leucemia de linaje ambiguo. Aproximadamente el 5 % de las LMA, Es de pronóstico adverso (menos tiempo de sobrevida y recaída en corto plazo). Perfil inmunofenotípico: CD45débil, CD13, CD33, CD117, CD34, HLA-DR, CD38 y pocas evidencias de maduración. MPO generalmene negativa. Por ultracitoquímica la MPO es positiva es aprox 3 % de los blastos.

95 LMA mínimamente diferenciada FSC-Height -> DER CD2 FIT C -> DER CD45 FIT C -> DER CD38 FIT C -> DER Anti-HLA-DR FIT C -> DER

96 LMA mínimamente diferenciada T dt FIT C -> DER M PO FIT C -> DER M PO FIT C -> DER CD15 FIT C -> DER

97 LMA sin maduración Su contrapartida FAB es la M1, ocurre entre el 6 y 10 % de las LMA Al diagnóstico la mayoría de los elementos medulares no eritroides son blastos mieloides (gral más del 90 %) Pronóstico adverso. Curso agresivo especialmente en pacientes que se presentan con hiperleucocitosis. Inmunofenotipo: CD45débil, CD13, CD33, CD117, CD34, HLA-DR, MPO positiva, CD4 y CD15 positivo débil en hasta un 25% de los casos

98 LMA sin maduración Forward Scatter -> DER CD11b FIT C -> DER CD45 PerCP -> DER CD64 FIT C -> DER CD38 FIT C -> DER M PO PE -> DER

99 LMA con maduración Su contrapartida FAB es la M2, ocurre entre el 3 y 5 % de las LMA, si les adicionamos las LMA con t (8;21) también M2 de la antigua clasificación representan aproximadamente el 35 % del total de las LMA. Pronóstico variable, dependiendo de si presentan o no alteración citogenética las que tienen t(8,21) son de mejor pronóstico que el resto. Inmunofenotipo: CD45débil, CD13, CD33, CD15 positivos, con CD34, HLA-DR y CD117 variables, MPO positiva.

100 LMA con maduración CD45 PerCP -> DER FSC-Height -> DER Anti-HLA-DR FIT C -> DER CD15 FIT C -> DER CD22 FIT C -> DER M PO PE -> DER

101 Leucemia mielomonocitica aguda Su contrapartida FAB es la M4, ocurre entre el 3 y 5 % de las LMA, si les adicionamos las LMA con inv16 también M4 de la antigua clasificación representan aproximadamente el 20 % del total de las LMA. Pronóstico variable, dependiendo de si presentan o no alteración citogenética las que tienen inv16 son de mejor pronóstico que el resto. Inmunofenotipo: - Dos grupos de células unas que se diferencian a linaje neutrófilo (CD45débil, CD13, CD33, CD15, CD64) y otras que se diferencian al monocítico CD33fuerte, HLA-DR, CD11b, CD14, CD36, CD4

102 Leucemia mielomonocítica aguda Fo rward S catter -> DE R CD45 P ercp -> DE R An ti-hla-dr FIT C -> DE R CD34 P ercp -> DE R CD11 b FIT C -> DER CD38 FIT C -> DER

103 Leucemia mielomonocítica aguda CD64 FIT C -> DER M PO PE -> DER CD15 FIT C -> DER CD45 FIT C -> DER CD16 FIT C -> DER

104 Leucemia monoblástica y monocítica aguda Incluye dos entidades distintas las monoblásticas (antiguas M5a de la FAB) tienen una prevalencia del 5 al 8% del total y se observan principalmente en niños. Las monocíticas antiguas M5b de la FAB, tiene una prevalencia del 3 al 6% del total y se observan en adultos (muy raras en pediatría). Suelen tener recuento elevado de blancos, incremento de lisozima y tendencia al compromiso extramedular principalmente los cloromas en pediatría (piel, SNC), Son de mal pronóstico y presentan curso agresivo. Inmunofenotipo: Las M5a presentan más marcadores de inmadurez y las M5b más relacionado a estadios más maduros del linaje. CD14, CD64, CD36, CD13, CD11b, CD15, CD33. CD45, CD34 variables

105 Leucemia monoblástica aguda FSC-Height -> DER CD38 FIT C -> DER CD45 PerCP -> DER HLADR FIT C -> DER CD34 PerCP -> DER CD11b FITC -> DER

106 Leucemia monoblástica aguda CD1 5 FIT C -> DER CD3 6 FIT C -> DER M PO FIT C -> DER CD4 FIT C -> DER

107 Leucemia monocítica aguda FSC-Height -> DER CD45 PerCP -> DER Anti-HLA-DR FIT C -> DER CD11b FIT C -> DER CD34 PerCP -> DER CD38 FIT C -> DER

108 Leucemia monocítica aguda CD1 5 FIT C -> DER CD64 FIT C -> DE R CD4 FIT C -> DER

109 Leucemias agudas eritroides Son raras representan menos del 5% de las LMA. En adultos hay un subgrupo inducidas por terapia cancerígena Se la conoce como eritroleucemia ( antigua FAB M6) y en ella más del 50% de los elementos deben ser blastos eritroides y más del 20% de las células no eritroides deben ser blastos mieloides, Son de mal pronóstico, muy agresiva y de inicio abrupto. Inmunofenotipo: CD71, CD36, Glicoforina, HLA-DR(-), CD45(-). Blastos mieloides marcan como tales

110 Leucemia aguda megacariocítica Representan entre el 3 y 6% de las LMA de novo. Más del 20% de los componentes de la Mo deben ser megacarioblastos. Suelen tener dry tap (punciones secas) por la fibrosis que es típica de esta variedad. Son de mal pronóstico, Inmunofenotípico CD41, CD61, CD42 (tardío), HLADR y CD45 negativos, CD36+ Variedades infantiles: -t(1;22) (p13,q13): niños menores de 2 años, masa abdominal, mal pronóstico. -asociada a Sme. de Down / SMT

111 Leucemia aguda megacariocítica FSC-H -> QOM M O CD34 A PC -> QOM M O CD34 APC -> QOM M O CD4 5Pe rcp -> QOM M O CD34 A PC -> QOM M O

112 Leucemias de clasificación compleja Bifenotípica: los blastos se expresan Ag de dos linajes distintos, no pudiendo asociarse la leucemia a ninguno de ellos en particular. Existe un sistema de puntuación creado por EGIL para la determinación de este tipo de Leucemias. Biclonales: 2 poblaciones de blastos distinguibles por morfológica e inmunofenotipo. También se la llama bilineal. Indiferenciadas: son leucemias que carecen de marcadores específicos de linaje. Normalmente son CD34, CD38, DR, CD7 y TdT positivos.

113 Leucemias Bifenotípicas Blastos con Ag de dos linajes distintos, no pudiendo asociarse la leucemia a ninguno de ellos en particular, ya que los blastos coexpresan ambos Ag haciendo que el fenotipo parezca una hibridización entre ambos. Se utiliza el score de EGIL para realizar los cálculos. Pueden representar hasta el 5 % del total de las LA.

114 Leucemias Bifenotípicas 4 tipos distintos los más frecuentes: Blastos que coexpresan Ag Mieloides y B. Blastos que coexpresan Ag Mieloides y T. los más infrecuentes Blastos que coexpresan Ag B y T. Blastos que coexpresan Ag B, T y Mieloides.

115 Leucemias Bifenotípicas Hallazgos citogenéticos más importantes: Alta prevalencia de Ph t (9;22) (q34;q11) y alteraciones del 11q23. Muchos casos sin anormalidades aparentes. (hasta 35%).

116 Leucemias Biclonales En estos casos existen 2 clones leucémicos distintos. Son más infrecuentes que las Bifenotípicas. Generalmente se combina un clon mieloide con un Linfoblástico B. Si el diagnóstico original no esta bien hecho puede parecer que hubo un cambio en los blastos. Problemas con el tratamiento

117 Leucemias Indiferenciadas Son extremadamente raras en pediatría ( 1 en 1500). Carecen de Ag específicos de linajes como 19,79a,22, 3,5,13, MPO,61,41,42,33,15,65, TCR, etc. Los Ag que pueden expresar son 34,38,DR, 45, 7, 9, 71, TdT. (todos inespecíficos de linaje y Ag típicos de stem cell.

118 Factores pronósticos

119 Sobrevida libre de eventos (%) en LLA C myc t (12;21) Hiperdipliodia t (1;19) t (9;22) BCR-ABL1 fusion BCR-ABL1 like IKFZ1 t (4;11) Hipodiploidía Adulto 50 a 80 a 3 a desconocida 30 a 50 a 5 a 40 a 70 a 3 a 40 a 60 a 2 a desconocida 10 a 20 a 3 a 10 a 20 a 3 a Niños 75 a 85 a 3 a 85 a 95 a 5 a 80 a 90 a 5 a 85 a 95 a 5 a 80 a 90 a 3 a 40 a 50 a 5 a 30 a 40 a 5 a 30 a 40 a 3 a

120 LLA Factores pronósticos: Adultos Edad (a) GB (x109) IF Genotipo AF4 EMR Favorable < 35 < 30 LLA tímico -< 0,01 % Adversos > 60 > 100 LLA T early BCR-ABL1; MML> 0,01 %

121 LLA Factores pronósticos: Pediatria Edad (a) GB (x109) IF Genotipo EMR Favorable 1a9 < 50 precursor B Hiper, ETV6 < 0,01 % Adversos < 1 o > o = 10 > 50 LLA T early Hipo BCR-ABL1; MML-AF4 > 0,1 %

122 LMA Factores pronósticos Entidad clínicamente heterogénea Factores adversos edad avanzada enfermedad extramedular. enfermedad hematológica preexistente (SMD). pacientes > 60 años y especialmente > 75 años Conteo de blanco > de 50000/mm3

123 LMA Factores pronósticos las alteraciones genéticas son claves al diagnóstico 50 % tienen alguna alteración 10 a 20 % tienen cariotipos complejos. (3 o + alt) Son favorables t (15;17), t (8;21) e inv 16 son intermedias citogenético normal y otros no complejos Son desfavorables: del 5, del 7, cariotipos complejos

124 LMA Factores pronósticos Entre los que tienen citogenético normal los que presentan duplicación en tandem de FLT3-ITD, tienen peor pronóstico ( 20 a 30 % con CG normal los que presentan mutaciones de NPM1 (nucleofosmina) con fenotipo salvaje de FLT3 (40 a 60 % del total de los CG normales) tienen pronóstico más favorable.

125 CASOS CLINICOS

126 M.O. normal Linfocitos Monocitos Mieloide madura Eritroide Mieloide inmadura

127 Caso 1.

128 Caso 1. (2)

129 Caso 1 (3)

130 Otros Resultados. Caso 1 (4) PAS positivo, POX negativo. Se encontró por BM la t (12;21) expresando la oncoproteína anómala ETV6/ AML1.

131 Otros Resultados. Caso 1 (4) PAS positivo, POX negativo. Se encontró por BM la t (12;21) expresando la oncoproteína anómala ETV6/ AML1. Es una LLA estirpe B común según clasificación EGIL de buen pronóstico o LLA de precursores B.

132 Caso 2.

133 Caso 2. (2)

134 Caso 2. (2)

135 Caso 2. Otros resultados No se encontró alteración por citogenética ni por BM. PAS negativa. Pox positiva. ANAE negativa. CAE positiva.

136 Caso 2. Otros resultados No se encontró alteración por citogenética ni por BM. PAS negativa. Pox positiva. ANAE negativa. CAE positiva. Es una LMA sin maduración o LMA M1 de la clasificación FAB

137 Caso 3.

138 Caso 3 (2).

139 Otros Resultados. Caso 3 (3). Se encontró la t (8;21) por citogenética y la proteína anómala AML1/ETO por BM. PAS negativa. Pox positiva. ANAE negativa. CAE positiva.

140 Otros Resultados. Caso 3 (3). Se encontró la t (8;21) por citogenética y la proteína anómala AML1/ETO por BM. PAS negativa. Pox positiva. ANAE negativa. CAE positiva. Es una LMA M2 de la antigua clasificación FAB o LMA con t (8;21).

141 Caso 4 (1)

142 Caso 4 (2)

143 Caso 4 (3)

144 Otros Resultados. Caso 4 (4) No se encontró alteración citogenética ni por BM, PAS positiva. Pox negativa. Fac negativa. Otros marcadores positivos CD22 y CD24.

145 Otros Resultados. Caso 4 (4) No se encontró alteración citogenética ni por BM, PAS positiva. Pox negativa. Fac negativa. Otros marcadores positivos CD22 y CD24. LLA de precursores B o LLA común de EGIL

146 Caso 5 (1)

147 Caso 5 (2)

148 Caso 5 (2) Otros resultados Pas positiva, Pox negativa, Fac positiva CG y BM negativos.

149 Caso 5 (2) Otros resultados Pas positiva, Pox negativa, Fac positiva CG y BM negativos. LLA de precursores T

150 Caso 6 (1)

151 Caso 6 (2)

152 Otros Resultados. Caso 6 (2) CG convencional t (15;17). FISH positivo para (15;17). BM positivo para PML/RARα. PAS negativa. Pox negativa. ANAE negativa. Otros marcadores positivos CD65, CD117, y negativos para CD34 y DR.

153 Otros Resultados. Caso 6 (3) CG convencional t (15;17). FISH positivo para (15;17). BM positivo para PML/RARα. PAS negativa. Pox positiva. ANAE negativa. Otros marcadores positivos CD65, CD117, y negativos para CD34 y DR. Es una LPA (M3 de la clasificación FAB). (BP) o LMA con t (15;17)

154 Enfermedad mínima residual (EMR) (MRD) Enfermedad indetectable a la microscopía óptica, que puede expandirse en cualquier momento, haciéndose evidente como una recaída de la enfermedad. (Foroni et al. 2002). Consiste en la permanencia de un clon anormal, en cantidades indetectables para la microscopía óptica, durante o al finalizar el tratamiento.

155 Importancia de la EMR Actualmente es un pilar básico para: Seguimiento de la enfermedad. Diagnóstico precoz de recaída. Conducta pretransplante.

156 ALLIC BFM 2010: Clasificación DIAGNÓSTICO DIA 8 ERM Día 15 DÍA 15 DÍA 33 GRUPOS DE EDAD 1-5a GB <20 x 109/L BLASTOS D8 <1000 <0.1% >01- <10% M1/M2 >10% EDAD <1 6a GB 20 x 109/L BLASTOS D8 <1000 >01- <10% >10% M3 M1/M2 M3 M1 M2/M3 M1 M2/M3 t(9;22) t(4;11) BLASTOS D HIPODIPLOIDIA TODAS M1/M2/M3 M1/M2/M3 RE RI RA RIESGO 13% 66% 21% RECAÍDAS 5% 22% 40%

157 Muchas gracias por su atención.