Dra. Adriana Limansky Profesora Adjunta Área Bacteriología, Facultad Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR

Transcripción

1 Enterobacteriaceae Salmonella typhi Escherichia coli O157:H7 Manual of Clinical Microbiology (ASM, Edition 11th, 2015) 37. Escherichia, Shigella, and Salmonella 38. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Cronobacter, Serratia, Plesiomonas, and Other Enterobacteriaceae 39. Yersinia Dra. Adriana Limansky Profesora Adjunta Área Bacteriología, Facultad Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR

2 Enterobacteriaceae y familias relacionadas -Diferenciación- Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, 2005 Familias de bacilos Gram-negativos fermentadores de glucosa -Enterobaceriaceae- Bacilos Gram-negativos (rectos), Oxidasa negativos (excepto género Plesiomonas) Flagelación peritrica (excepto géneros Plesiomonas y Tatumella)

3 Enterobacteriaceae y familias relacionadas -Diferenciación- Relación basada en hibridización ADN-ADN Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, La mayoría de los géneros de la familia Enterobacteriaceae tienen >20% relación ADN-ADN con E. coli (especie tipo). Sin embargo, hay varias excepciones como Proteus, Providencia, Yersinia, Plesiomonas, etc. -Algunos géneros de enterobacterias tienen menor relación aún (con E. coli) que especies de Aeromonas. Importante: taxonomía polifásica (relación ADN-ADN, filogenia basada en RNAr 16S y consistencia fenotípica)

4 Filogenia basada en RNAr 16S Shigella y Escherichia tienen origen monofilético (identidad > 99%) Diferentes especies de Escherichia y Shigella: elevada homología Lukjanenko et al, Microb Ecol. 2010

5 Filogenia basada en los genes variables Genoma bacteriano: dos componentes -core y pool de genes flexibles- Este análisis: - Separa Shigella spp y S. Typhimurium de Escherichia spp. - Dentro de Escherichia separa E. coli de las otras especies. Lukjanenko et al, Microb Ecol. 2010

6 Familia Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae se originaría del género Enterobacter Escherichia coli se adopta como bacteria tipo Familia Enterobacteriaceae: 12 géneros y 36 especies (8th ed Bergey s Manual of Determinative Bacteriology) Familia Enterobacteriaceae: 20 géneros y 76 especies (1st ed Bergey s Manual of Systematic Bacteriology) Familia Enterobacteriaceae: 30 géneros y 107 especies (9th ed Bergey s Manual of Determinative Bacteriology) Familia Enterobacteriaceae: 44 géneros y 176 especies (2nd ed Bergey s Manual of Systematic Bacteriology-Vol. 2 Proteobacteria). Proyección para próximo Manual. Familia Enterobacteriaceae: 60 géneros y 225 especies.

7 Enterobacteriaceae. Habitat. Las enterobacterias forman parte de la microbiota ambiental (suelo, agua, plantas y animales). Las enterobacterias son un componente importante de la flora intestinal normal humana y de animales. Algunas enterobacterias tienen nichos ecológicos limitados. Ej: Salmonella typhi, en humanos. Otros serovares de Salmonella están específicamente adaptados a una (o algunas) especie/s animal/es. Algunas especies están ampliamente distribuidas. Ej: Klebsiella pneumoniae (contribuye en procesos bioquímicos y geoquímicos, y puede además causar patologías en el hombre)

8 Enterobacteriaceae. Significado clínico. Las enterobacterias son un componente poco común en un sitio diferente al intestino. Sin embargo, pueden colonizar región perianal y perigenital. Causan infecciones en animales y plantas (Ejs. Erwinia en frutas y verduras, salmonelosis en pollo). Vehículos para las enfermedades humanas. Las enterobacterias son responsables del 50% de aislamientos clínicos significativos en los laboratorios de bacteriología. Y del 80% de los bacilos Gram-negativos. Las enterobacterias normalmente patógenas son Salmonella, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Yersinia pestis, Y. enterocolítica y varios serotipos de Escherichia coli (patotipos). Hay otras que son patógenas oportunistas (Proteus, Citrobacter, Serratia, Escherichia coli no enteropatógenas, etc). Causan infecciones intestinales y extra-intestinales: Infecciones intestinales: cuatro géneros (Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia). Otras enterobacterias han sido asociadas a infecciones intestinales: Citrobacter, Edwarsiella, Hafnia, Morganella, Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Serratia. Rol controvertido. Infecciones extra-intestinales (tracto urinario, tracto respiratorio, heridas, sangre y SNC). Ej: Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae; K. oxytoca; Proteus mirabilis; Enterobacter aerogenes; E. cloacae; Serratia marcescens, etc. Excepción: Shigella. Causan infecciones nosocomiales (especies patógenas oportunistas, ej: K. pneumoniae, Enterobacter spp, K. oxytoca, Serratia marcescens).

9 Características de la familia Bacilos gram negativos. Son móviles (por flagelos laterales o peritricos), excepto Tatumella (polar, subpolar o lateral) y Plesiomonas (lateral polar). Algunos géneros no móviles (Shigella y Klebsiella). Son anaerobios facultativos: crecen aeróbica y anaeróbicamente. En ausencia de O 2 : fermentadores de glucosa (vía Embden Meyerhoff o glucolítica-glucosa a piruvato-; y luego fermentación-a partir de piruvato-). Son catalasa positivos (porque expresan peróxido dismutasa), excepto Shigella dysenteriae O grupo 1 y Xenorhabdus. Son oxidasa negativos (porque no poseen citocromo c oxidasa en su cadena respiratoria). Excepto Plesiomonas. No son exigentes nutricionalmente.

10 Estructura antigénica Antígeno somático O (por ohne hauch ). Es la estructura externa del LPS. Constituido por una cadena de 1 a 60 oligosacáridos repetidos. Identifica el serogrupo. Termoestable Ej: existen 174 antígenos somáticos O para E. coli (1-181, con algunos números omitidos). Antígeno flagelar H (por hauch ) Está dado por las subunidades proteicas de la flagelina. Identifica el serotipo. Termolábil. Ejs: existen 54 antígenos flagelares H para E. coli. Salmonella puede expresar ags flagelares de fases 1 y fase 2. Antígeno capsular K Antígeno polisacarídico de superficie de algunas enterobacterias (ej: Escherichia coli y Klebsiella). Antígeno capsular Vi - Antígeno polisacarídico de superficie de algunos serovares de Salmonella, como Typhi y Paratyphi. - Suele enmascarar a los ags somáticos. El calentamiento a 100ºC lo solubiliza y luego se aglutina para O.

11 Escherichia coli - Patotipos o patovariedades-

12 Escherichia coli -Patotipos de Escherichia coli- Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC); E. coli enteropatogénica (EPEC); E. coli enterohemorrágica (EHEC); E. coli enteroinvasiva (EIEC); E. coli difusamente adherente (DAEC); E. coli enteroagregativa (EAEC). LT: toxina lábil; ST: toxina termoestable; bfp: pili formador de haces; A/E: lesión attachment/effacement con acumulación de actina; Stx: toxina tipo-shiga. Foodborne Microbial Pathogen. Cap 10. Ed. Springer. 2008

13 Toxinas bacterianas

14 E. coli enterotoxigénica (ETEC) Significado clínico y epidemiología - ETEC es una causa importante de diarrea de adultos que viajan a países en vías de desarrollo, e infantes de países en desarrollo. La diarrea es acuosa, sin fiebre (o leve) y sin (o leve) inflamación intestinal. Se autolimita en 3-4 días. La tasa de mortalidad asociada es baja. Sin embargo, puede resultar severa, similar a infecciones graves por Vibrio cholerae. - ETEC es adquirida por agua o alimento contaminado, y los adultos de zonas endémicas desarrollan inmunidad. Patogenia y marcadores de virulencia - Coloniza intestino delgado mediante adhesinas fimbriadas específicas de especie. Por ej, CFA I, CFA II, CFA III, CFA IV ( colonization factor antigens ), en cepas de humanos; antígeno fimbrial K-88 en cepas de cerdos. Se describen numerosos factores de colonización (CF), por ej. TibA, es afimbrial y colabora en agregación bacteriana y formación de biofilm. - Produce enterotoxina lábil (LT), que es similar en tamaño, secuencia (82% homología AA), antigenicidad y función a la de Vibrio cholerae (Ctx). Es de tipo A-B, con la subunidad enzimáticamente activa (A) rodeada de 5 subunidades idénticas (B). B se une a receptores gangliósidos, los mismos que reconoce Ctx (GM1), y la actividad enzimática de A es igual a la de Ctx. Causa ADP-ribosilación de la proteína G (transductor de señales), y activa adenilato ciclasa que resulta en un incremento de AMPc en citoplasma. AMPc activa una protein-kinasa, que causa fosforilación de los canales de cloruro, CFTR (Ver figura). Resulta una estimulación de secreción de cloruro e inhibición de adsorción de NaCl. Esto provoca por ósmosis un aumento de agua en el lumen (diarrea ssecretora). - ETEC puede producir también enterotoxina estable al calor (ST). ST causa un aumento en el GMPc de citoplasma de la célula hospedadora, provocando similares efectos que un aumento en el AMPc. ST es homóloga a las halladas en Yersinia enterocolítica, Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae.

15 Mecanismo de acción de ETEC Foodborne Microbial Pathogens: Mechanisms and Pathogenesis. Capítulo 10 - Unión a células epiteliales mediante factores de colonización fimbriados o no (CF y TibA). - Produce toxinas (LT-I, LT-II, Sta, STb, EAST1 y ClyA). - LT aumenta niveles AMPc, y ST aumenta GMPc. Ambos median la fosforilación del regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), transportador de cloruro que aumenta la secreción de Cl - en céls secretoras crípticas e inhibe la adsorción de Na + y Cl - en células adsortivas.

16 E. coli enteropatogénica (EPEC) Significado clínico y epidemiología - Es la causa más importante de diarrea infantil (algunas veces sanguinolenta). - EPEC causa importante respuesta inflamatoria y es potencialmente fatal en niños e infantes. - La transimisión generalmente es de persona a persona. Se han reportado brotes asociados a consumo de agua o carne contaminados. - El patotipo se divide en tepec (típico) y aepec (atípico) basado en la presencia/ausencia del factor de adherencia EAF. Patogenia y marcadores de virulencia - Adherencia a células intestinales mediada por: factor de adherencia de EPEC, proteína EAF o fimbria denominada BFP ( bundle-forming pili ) codificada en plásmido peaf; adhesina no fimbriada intimina (eae en el LEE), proteína de membrana externa que media la adherencia; y por un filamento asociado a superficie (EspA). - Fenómeno de adherencia y barrido ("attachment and effacing ), por pérdida o borrado de la estructura de vellosidades. El sistema de secreción tipo III (TTSS) inyecta el receptor de intimina (TIR), y varias moléculas efectoras (invasinas). TIR luego es fosforilado e inserto en la mb para facilitar la unión con la intimina. Resulta en rearreglos de la actina por polimerización y despolimerización de actina y conduce a alteración de estructura del citoesqueleto. - No producen toxinas. - Son "moderadamente invasivas" (no tan invasivas como Shigella o EIEC). Sin embargo, a diferencia de ETEC o EAEC, causan respuesta inflamatoria. La diarrea y otros síntomas de las infecciones por EPEC son causadas por invasión bacteriana de las células hospedadoras e interferencia con la transducción normal de señales celular.

17 Mecanismo de acción de EPEC Estadíos del attachment and effacement (A/E) : 1. Adherencia a las microvellosidades de las células epiteliales intestinales (mediado por BFP e intimina); 2. Adherencia localizada inicial: el sistema de secreción tipo III (TTSS) inyecta proteínas efectoras, responsables de activar vías de transducción de señales, provocando polimerización y despolimerización de la actina y alteración citoesqueletal. También activan al receptor Tir que resulta fosforilado y así se inserta en la membrana. TIR: receptor de intimina traslocado. Moléculas efectoras (invasinas): ESPB/D, ESPF, ESPB (E. coli secreted proteins ). 3. Contacto íntimo mediado por intimina (codificada por eaea, dentro del locus LEE- «Locus of Enterocyte Effacement») y transducción de señales. Luego de su unión al receptor TIR, por transducción de señales se amplifica el rearreglo citoesqueletal con formación de pedestales por acumulación de filamentos de actina (lesión A/E). IP3: inositol trifosfato y Ca; moléculas señales. 4. Rearreglo citoesqueletal. Lesión A/E y pérdida de la estructura de vellosidades por despolimerización de la actina. EspF afecta la tight junction (TJ) aumentando la permeabilidad de membrana. Como consecuencia, hay mala absorción de nutrientes y iones, muerte celular y diarrea osmótica. Fenómeno A/E: causa activación del canal de cloruro, diarrea (que resulta de la inhibición de la absorción de Cl - y Na + ), respuesta inflamatoria y producción de citoquinas.

18 E. coli enterohemorrágica (EHEC) Significado clínico y epidemiología - EHEC causa colitis hemorrágica (CH) caracterizada por inflamación y sangrado de la mucosa del colon. - Puede progresar a síndrome urémico hemolítico (SUH), caracterizado por falla renal, anemia hemolítica y trombocitopenia. La acción de la toxina sobre el riñón ocurre en el 5-10% de los pacientes infectados con EHEC. - Puede ser fatal en niños menores de 5 años, y en ancianos. - Hay varios serotipos de E. coli productores de Stx (STEC), pero sólo aquellas clínicamente asociadas con CH son designadas como EHEC. - O157:H7 es el serotipo más frecuentemente aislado en Argentina (seguido del O145:NM-no móvil) y constituye el prototipo de más de 150 serotipos que comparten el mismo potencial patogénico. Es común su asociación a brotes epidémicos. - El ganado vacuno es el principal reservorio de STEC. - Vías de transmisión: alimentos crudos (o mal cocidos) o agua, contaminados (por ej hamburguesas, morcilla, leche no pasteurizada, quesos, mayonesa, brotes de soja y alfalfa, jugos de manzana no pasteurizado, etc). Es una enfermedad transmitida por alimentos. Otras vías: contacto directo del hombre con animales, contaminación cruzada durante la preparación de alimentos, transmisión persona-persona por ruta fecal-oral, y contaminación fecal de aguas de recreación o de pozos. - En Argentina, constituyen un grave problema de Salud Pública. Los casos de SUH se notifican obligatoriamente al Sistema Nacional de Vigilancia de la Salud.

19 E. coli enterohemorrágica (EHEC) Patogenia y marcadores de virulencia - Coloniza mediante adhesinas fimbriadas y no fimbriadas. - Presenta una isla de patogenicidad LEE ( locus enterocyte effacement ), que media la actividad attaching and effacing (A/E). Lesión similar a la EPEC, aunque su ausencia (en algunas cepas carentes de LEE) permitió ver que no es esencial para la patogénesis - Es considerada moderadamente invasiva. No invade células de la mucosa (como Shigella). - Produce verotoxina o toxina Shiga (Stx), y por esto también se la llama STEC. La toxina juega un rol esencial en la intensa respuesta inflamatoria producida, y explicaría la habilidad de las cepas en causar SUH. La toxina es codificada en fagos, y su producción aumentada por deficiencia en hierro. - STEC producen STx1 y STx2. Son toxinas con 2 subunidades (A, monómero y efectora; y B, pentámero y es la subunidad que se une al receptor glicolípido Gb3). A es transportada al retículo endoplásmico, es activada luego del clivaje del péptido C terminal, y la porción activa presenta actividad N-glicosidasa. Cliva un residuo purina en el RNAr 28S, alterando la función del ribosoma, que así no podrá interactuar con los factores de elongación EF-1 y EF-2, inhibiendo la síntesis proteica (muerte celular). STx tienen actividad nefrotóxica (falla renal), citotóxica, enterotóxica (causan diarrea) y neurotóxica. El daño en células endoteliales de vasos sanguíneos provoca diarrea sanguinolenta. STx entra en circulación sanguínea y es transportada a órganos blanco cuyas células endoteliales tienen receptor Gb3, como región cortical del riñón, que es donde se observan las principales lesiones histopatológicas. La interacción de STx con las células endoteliales de vasos sanguíneos las desprenden a nivel del glomérulo. Además, el depósito de fibrina y plaquetas en la microvasculatura renal reduce el flujo sanguíneo y provoca insuficiencia renal y ruptura de GR. STx1 exhibe alta similitud de secuencia a STx de S. dysenteriae tipo 1. STx2 tiene alta toxicidad y más asociación a SUH.

20 Significado clínico y epidemiología -EIEC provoca diarrea acuosa o disentería (diarrea con sangre y moco). Semeja a Shigella en su mecanismo de patogenicidad y patología. Factores de patogenicidad E. coli enteroinvasiva (EIEC) - Coloniza mediante adhesina no fimbriada, que es una proteína de membrana externa. - Invasión de células epiteliales del colon. Ingresan mediante endocitosis, lisan vesículas endocíticas y se multiplican en citoplasma, causando destrucción celular y diseminación a células adyacentes. Los genes responsables se hallan en plásmido (pinv) que codifican para proteínas (Ipa, etc) que participan en la patogénesis. Esto provoca fuerte respuesta inflamatoria y diarrea mucosa sanguinolenta (similar a la disentería). - Produce toxina (gen sen) codificada en plásmido, responsable de diarrea acuosa. A diferencia de E. coli, EIEC son no móviles, no presentan lisina descarboxilasa, y no fermentan lactosa. EIEC está relacionado genética y bioquímicamente con Shigella. La dificultad radica en diferenciar EIEC de Shigella. Se proponen ciertas PB, serotipificación y/o identificación de genes específicos.

21 E. coli enteroagregativa (EAEC) Significado clínico y epidemiología -EAEC provoca diarrea acuosa persistente en niños y adultos (similar a ETEC). Ocasionalmente causa diarrea muy mucoide. - Identificada en niños y adultos de países en desarrollo, y en viajeros que regresan de estos países (19-33% de casos de diarrea del viajero). - Principal fuente de infección: alimentos contaminados. Patogenia y marcadores de virulencia - Adherencia mediada por fimbrias (AAF, fimbria de adherencia agregativa, codificada en plásmido). La adherencia y colonización persistente media el proceso de formación de agregados de bacterias autoglutinadas en el moco secretado ( stacked-brick /ladrillos apilados) y biofilm. El biofilm colabora en colonización persistente, en la evasión del sistema inmune y en prevenir el transporte de sustancias antibacterianas incluyendo a los ATBs. - Produce varias toxinas causales de la diarrea secretora: enterotoxina tipo ST, denominada EAST ( enteroaggregative ST, codificada en plásmido), y tipo ShET (identificada en Shigella) y numerosas citotoxinas (SPATEs, autotransportadores de serino-proteasas). - No invade células epiteliales, pero su citotoxina es responsable de efectos histopatológicos y respuesta inflamatoria (e.g. ccs elevadas de citoquinas proinflamatorias como IL-8 que recluta neutrófilos en la mucosa intestinal).

22 Patogénesis de EAEC Estadíos: (1) Aglutinación de las bacterias planctónicas; (2) Adherencia al epitelio intestinal y colonización; (3) Formación del biofilm; (4) Liberación de toxinas bacterianas que inducen daño al epitelio y mayor secreción de mucus; (5) Establecimiento de biofilm adicional. Hebbelstrup Jensen B et al. Clin. Microbiol. Rev. 2014, 27:

23 E. coli en infecciones extraintestinales -Epidemiológica y filogenéticamente diferentes de las cepas comensales e intestinales- Infecciones urinarias (virotipo UPEC, uropathogenic E. coli ) 1. Infecciones de tracto urinario adquiridas en la comunidad: Son generalmente infecciones ascendentes. E. coli es prevalente entre las enterobacterias. Luego siguenklebsiella y Proteus. - UPEC causan diferentes cuadros clínicos, con diferente grado de severidad: uretritis no complicada, cistitis, o pielonefritis (hasta sepsis). 2. Infecciones de tracto urinario adquiridas en hospitales: Pueden ser ascendentes o por vía hematógena. E. coli, Klebsiella y Proteus son prevalentes. Pero, no siempre se asocian enterobacterias. Factores de patogenicidad en IU - Adhesinas o fimbrias (factores que promueven la colonización) - Tipo 1. Une residuos de manosa de glicoproteínas de vejiga (y de PMN). Están presentes en cepas que provocan cistitis. - Tipo P. P se denomina por unirse de forma específica a antígenos P del grupo sanguíneo. Además se une a células uroepiteliales (vejiga, uréteres y especialmente en túbulos renales por lo que se ve facilitada la ascensión a pelvis renal). Hay varios tipos antigénicos de fimbria tipo P, pero todas reconocen el mismo receptor: glucolípidos de la serie globo que contienen al disacárido a-d-galactopiranosil-(1,4)-b-d-galactopiranosa (Gal-Gal). - Lipopolisacárido (endotoxina) - Hemolisinas (citotoxina) - Cápsula (resistencia a la fagocitosis-importante en cepas que causan pielonefritis e infecciones sistémicas) - Sideróforos (promueven la multiplicación bacteriana) Otras infecciones 1. Meningitis neonatal (MNEC): cepas capsuladas, con adhesina S y factor necrotizante citotóxico. NMEC: número limitado de serotipos con ag O, y el 80% con ag K1. 2. Septicemia: cepas capsuladas y con adhesina S (receptor: residuo de sialil-galactósido).

24 Contribución de THG a la evolución de patotipos de E. coli «LEE, locus of enterocyte effacement; PAI, pathogenicity island; peaf, enteropathogenic E. coli adhesion-factor plasmid; pent, enterotoxin-encoding plasmids; Stx, Shiga-toxin-encoding bacteriophage» (Ahmed et al. Nature Reviews Microbiology, 2008). El 16% del genoma de E. coli O:157:H7 (cepa Sakai) corresponde a fagos, los cuales llevan genes de virulencia, entre ellos genes para toxina ST. Algunos de los fagos pueden ser inducidos, recombinar, y transferir genes a otras cepas.

25 Taxonomía Género Salmonella El bacilo tifoideo fue observado en nódulos mesentéricos de pacientes con fiebre tifoidea Se propone el género Salmonella, en honor al anatomopatólogo Salmon, que fue el primero en aislar Salmonella chorelasuis de intestino de porcino La taxonomía se basaba en pruebas bioquímicas convencionales y reacciones serológicas. Kauffmann y White describen serovares en base a antígenos O y H. Cada serovar era considerado una especie. Los serovares no podían diferenciarse mediante pruebas bioquímicas Estudios de hibridización mostraron que todos los serovares formaban parte de 1 grupo de hibridización con 7 subgrupos, que se diferenciaba bioquímicamente La especie Salmonella cholerasuis está formada por 7 subespecies: cholerasuis (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV), bongori (V) e indica (VI) Se cambia el nombre de la especie cholerasuis por enterica, y está constituida por 6 subespecies. Y la subespecie bongori por estudios de hibridización de ADN se eleva a especie (S. bongori). La cepa tipo es S. enterica subespecie enterica.

26 Taxonomía (continuación) Especies, subespecies y serovares: 1. Salmonella enterica Salmonella enterica subesp enterica Salmonella enterica subesp enterica serovar Cholerasuis Salmonella enterica subesp enterica serovar Enteritidis Salmonella enterica subesp enterica serovar Gallinarum Salmonella enterica subesp enterica serovar Paratyphi A Salmonella enterica subesp enterica serovar Paratyphi B Salmonella enterica subesp enterica serovar Paratyphi C Salmonella enterica subesp enterica serovar Typhi Salmonella enterica subesp enterica serovar Typhimurium Salmonella enterica subesp arizonae Salmonella enterica subesp diarizonae Salmonella enterica subesp houtenae Salmonella enterica subesp indica Salmonella enterica subesp salamae 2. Salmonella bongori -Constituyen más de serovariedades en función de ag somáticos (O) y flagelares (H). -S. enterica subesp enterica constituye más del 99,5% de los aislamientos del hombre y animales. Taxonomía y estructura antigénica Esquema de Kauffmann-White: Fórmula antigénica de los serovares de Salmonella Ej: serovar Cholerasuis: fórmula antigénica: 6,7, [Vi]:c:1,5; donde 6 y 7 son ags somáticos O; Vi es el ag capsular, que puede o no estar presente; c es el ag flagelar H de fase 1 (específico de especie); 1 y 5 son ags flagelares de fase 2 (compartidos por varias especies).

27 Significado clínico y epidemiología - Causa el cuadro clínico de «salmonelosis», caracterizado por diarrea aguda. La sintomatología es desde leve, hasta septicemia por la invasión sistémica. - Generalmente se produce en < de 10 años (son más susceptibles, y los síntomas más severos). - La salmonelosis es una zoonosis de distribución mundial. Es una enfermedad de origen alimentario, transmitida mayoritariamente por productos de origen animal contaminados (ej: cáscara de huevos o el interior por infección intraovárica previa a la formación de cáscara, leche cruda, futas y hortalizas crudas), o directo de animales, o de productos farmacéuticos de origen animal no esterilizados (ej: hormonas pancreáticas). Hay portadores sanos, que son transmisores de persona a persona (vía fecal-oral). Salmonella serovar Typhimurium Patogenia y marcadores de virulencia - Adherencia a células M (enterocitos especializados en captación de antígenos) mediada por fimbria. - Invasión del enterocito. La interacción bacteria/hospedador promueve rearreglos citoesqueletales que dan lugar al ruffling de la membrana. Estos rearreglos de la superficie celular envuelven a la bacteria y la internalizan (macropinocitosis). Numerosos efectores son liberados al hospedador a través del SSTT, que provocan rearreglos de la actina, producción de citoquinas inflamatorias y apoptosis de macrófagos. La bacteria se multiplica en vacuolas, y luego son liberadas. En una segunda etapa de patogénesis, llega a nódulos linfáticos, sangre e infecta hígado y bazo. Extensa reacción inflamatoria que puede terminar en shock endotóxico (LPS). Islas de patogenicidad de virulencia (SPI-1, SPI-2, etc). - Sobrevida en macrófagos (más de 200 genes involucrados: sobrevida a formas reactivas del oxígeno, al bajo ph, etc). Plásmido de virulencia (svp). - LPS (principal factor de virulencia en infecciones sistémicas). - Ag polisacarídico O-cadena larga (resistencia al suero). - No produce enterotoxina.

28 Salmonella serovar Typhimurium Mecanismos de patogenicidad Mecanismos moleculares de patogenicidad de Salmonella sp. Figueroa Ochoa I, y Verdugo Rodriguez A, Revista Latinoamericana de Microbiología, 2005

29 Salmonella serovar Typhi Significado clínico y epidemiología - Causa «fiebre entérica» (también denominada tifoidea), sin diarrea. Es un cuadro febril prolongado con signos de septicemia, cefalea, malestar general. Puede llegar a ser grave, y con complicaciones como hemorragia y perforación intestinal, estado tóxico confusional y miocarditis. - La bacteria penetra la pared intestinal y pasa a folículos linfáticos y al interior de macrófagos, donde se multiplica. Desde allí, alcanza la circulación general (1era bacteriemia asintomática). El sistema mononuclear fagocítico es incapaz de eliminar los microorganismos, que siguen multiplicándose, vuelven a sangre (2da bacteriemia sintomática y prolongada). Patología grave, por la infección sistémica. Además, se afecta la vía biliar de forma subclínica. La diseminación sistémica en el sistema retículoendotelial requiere el antígeno Vi. Este ag estaría asociado a resistencia: al efecto bactericida del suero, a la activación del complemento por vía alternativa, y a la opsonisación por inhibición de la unión de C3b a la bacteria. - El hombre es el único reservorio y hay portadores sanos. - Se transmite por agua o alimentos contaminados con MF u orina de enfermos o portadores. Salmonella serovares Paratyphi A, B, C Significado clínico - Causan fiebre entérica, denominado también fiebre paratifoidea. - Paratyphi A y C son exclusivos del hombre, y el B puede encontrarse también en animales.

30 Taxonomía Género Shigella - Elevada relación genética y filogenética con Escherichia coli (> 70% DNA, > 99 % RNAr). Las especies de Shigella serían patovariedades de E. coli. 2000: Propuesta: E. coli clon Dysenteriae; E. coli clon Boydii; E. coli clon Flexneri; E. coli clon Sonnei. - Cuatro especies (cada una con múltiples serotipos antigénicos basados en la variabilidad del ag O): - Shigella dysenteriae (o serogrupo A). Presenta 15 serotipos. - Shigella flexneri (o serogrupo B). Presenta 14 serotipos - Shigella boydii (o serogrupo C). Presenta 20 serotipos. - Shigella sonnei (o serogrupo D). Presenta 1 serotipo. En rojo: los más frecuentes en nuestro medio. Significado clínico y epidemiología - Causa disentería (colitis inflamatoria aguda y diarrea sanguinolenta). - La enfermedad empieza con una diarrea acuosa. Luego, ocurren los síntomas característicos de la disentería. Las lesiones y ulceración característica de la disentería (en colon y recto) causan aguda inflamación, y se observan PMN en la materia fecal. severos. - El 70% de los episodios se produce en < de 5 años, con síntomas más - Es transmitida por transmisión directa fecal-oral o por contaminación de alimentos durante su manipulación, o por agua contaminada.

31 Género Shigella Patogenia y marcadores de virulencia - Invasión y sobrevida intracelular (mayoritariamente las funciones codificadas en plásmido de virulencia). Penetra inicialmente hasta submucosa colónica a través de células M, y luego macrófagos. Evade la degradación en macrófagos. Las bacterias libres invaden células epiteliales (CE), y en el citoplasma provocan rearreglos de los filamentos de actina de la célula hospedadora que polimerizan en un extremo de la bacteria, formando una cola de cometa ( actin tail ) que le provee movilidad, y diseminación entre células (proteínas Ics, por Intercellular spread ). SSTT permite traslocar ~ 25 proteínas desde su citoplasma a células hospedero. - Respuesta inflamatoria. La invasión a macrófagos induce muerte celular programada en macrófagos, que disparan el fenómeno inflamatorio, y las CE infectadas inducen también intensa respuesta inflamatoria. El influjo de PMN desintegra el epitelio (destrucción de tejido y sangrado). Luego, los PMN fagocitan bacterias y contribuyen a la resolución de la infección. - S. dysenteriae serotipo 1 puede producir toxina Shiga, tipo A-B, que inhibe la síntesis de proteínas de células eucariotas, y provoca la forma más severa de disentería, con alta tasa de mortalidad. Puede causar sindrome urémico hemolítico. Schroeder et al. Clin Microbiol Rev

32 Género Yersinia Comprende 17 especies. De importancia clínica: Yersinia pesti Yersinia pseudotuberculosis Yersinia enterocolítica Y. pesti - Causan infección en el hombre por picadura de pulga infectada o por inhalación de aerosoles. - Reservorio principal: roedores. Tras la muerte de los roedores, buscan otros hospedadores. - Localización de la infección: sistémica. Los bubones son ganglios linfáticos inflamados en la zona inguinal, femoral y axilar. - Siglo XIV: pandemia de peste negra devastadora, causó 25 millones de muertes en Europa (tercera parte de la población). Hubo 3 pandemias históricas. Siglo XX: alta mortalidad en India y Sudeste Asiático. Es endémica en 26 países del mundo. En 1899 entró a Argentina por el puerto de Rosario. Desde Rosario se propagó a Bs. As. Desde 1960 no se registran casos en nuestro país. Y. pseudotuberculosis y Y. enterocolítica - Causan infección en el hombre por ingestión de comida o agua contaminados. - Localización de la infección: mucosa intestino delgado, y nódulos linfáticos mesentéricos. Raramente sistémica. Peste bubónica, neumónica, o septicémica. Infecciones intestinales y respiratorias. Infecciones intestinales-septicemia. Rutas de ingreso y localización en el cuerpo humano de las tres especies.

33 Vías de transmisión Mandell, Douglas y Bennet. Enfermedades infecciosas. Principios y Práctica. 7ma. ed

34 Patogenia y marcadores de virulencia Environmental Regulation of Yersinia Pathophysiology Shiyun Chen et al. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2016

35 Patogenia y marcadores de virulencia Plásmido de virulencia de 68- a 75-kb en especies patogénicas: pcd1 en Y. pestis y pyv in Y. enterocolitica y Y. pseudotuberculosis: Codifica el SSTT, el ag V, y efectores del SSTT (Yersinia outer membrane proteins o Yops). El SSTT posee una estructura de jeringa en la superficie de la bacteria e interactúa con células blanco (macrófagos, células dendríticas, neutrófilos), inyectando los Yops, los cuales interfieren con la fagocitosis y otras respuestas celulares innatas del hospedador tal como la cascada inflamatoria adaptativa, y finalmente causan apoptosis. pyv codifica también adhesinas como Inv, YadA, y Ail. Inv es una PME requerida para la traslocación de la bacteria a través del epitelio intestinal; Ail codifica otra PME que contribuye a la adhesión, invasión y resistencia a la lisis mediada por complemento, y YadA es proteína de adhesión que facilita la unión a células M de la mucosa intestintal, internalización y traslocación a placas de Peyer y nódulos linfáticos mesentéricos. Sabina et al, Journal of Pathogens Plásmido de 110-kb (pmt1) en Y. pestis, codifica la toxima murina (Ymt), fosfolipasa cuya actividad es necesaria para la sobrevida del patógeno dentro del tracto digestivo de la pulga y se expresa sólo a temperaturas por debajo de los sistemas de mamíferos. La proteína capsular antifagocítica llamada fracción antigénica 1 (F1), es expresada a altas temperaturas (>33 C) y durante la infección al mamífero. F1 forma una estructura tipo cápsula que tiene actividad antifagocítica y permite la diseminación y replicación de la bacteria. Plásmido de 10-kb en Y. pestis codifica un activador de plasminógeno (Pla), que es una proteasa de superficie que activa el plasminógeno mamífero y degrada complemento. Es esencial para la diseminación después de inoculación subcutánea o intradérmica (en modelo de ratón de enfermedad bubónica).

36 Otras enterobacterias de importancia clínica Género Klebsiella 2001 (Brisse y Verhoef). Grupo I K. pneumoniae subsp pneumoniae K. pneumoniae subsp ozaenae K. pneumoniae subsp rhinoscleromatis Grupo II K. granulomatis K. planticola K. ornithinolytica K. terrigena K. oxytoca K. mobilis 2001 (Drancourt et al). Propuestas como género Raoultella (en azul). Patogenicidad Es un género ubicuo (agua, suelo, plantas, mucosas humanas y animales). K. pneumoniae forma parte de microbiota de tracto gastrointestinal humano y de cavidad oral. K. pneumoniae Pneumonía adquirida en hospitales, infecciones de tracto urinario, de tejidos blandos, de heridas, abscesos hepáticos, peritonitis, y sepsis. K. pneumoniae subsp rhinoscleromatis Rhinoscleroma (infección crónica asociada a cavidad nasal y vías aéreas superiores). K. pneumoniae subsp ozaenae Asociada a rinitis atrófica crónica. K. granulomatis Agente causal de granuloma inguinal o donovanosis (úlceras genitales) K. oxytoca Asociado a patología intestinal (segunda en frecuencia de aislamientos)

37 Otras enterobacterias de importancia clínica Patogenia y marcadores de virulencia de Klebsiella pneumoniae - Fimbria tipo 1 (adherencia a células uroepiteliales y traqueales) - Fimbria manosa resistentes (adherencia a diferentes células) - LPS - Cápsula polisacarídica (protege de opsonofagocitosis). 78 tipos capsulares. Entre ellos, K1, K2, K5, K20, K54, K57 asociados a enfermedad invasiva. - Sideróforos (aerobactina y salmoquelina) hvkp: K. pneumoniae hipervirulenta (hipermucoviscosa). - Plásmido de virulencia de kb que codifica factores de virulencia, incluyendo el regulador de fenotipo mucoide (RmpA) que participaría en la expresión aumentada de cápsula, y sideróforos que le dan mayor habilidad para adquirir hierro. - Para esta variante, han sido descriptos varios serotipos capsulares (K1, K2, K5, K16, K20, K54, K57). - Asociada a infecciones serias (neumonía, infecciones abdominales, endoftalmitis, meningitis, etc, con elevada morbi-mortalidad. Presentan mayor viscosidad que el fenotipo ckp (clásico). Shones et al. Virulence 2013

38 Diagnóstico de laboratorio Desarrollo del microorganismo -Siembra en medios selectivos y/o diferenciales- Ej: Agar Mac Conkey sorbitol (1%) para ECEH (O157:H7 es sorbitol (-), pero no todas las sorbitol (-) son O157:H7). Ej: Agar sulfito de bismuto (BS), altamente selectivo para el aislamiento de S. enterica serovar Typhi: colonias negras con brillo metálico. Características del metabolismo -Pruebas bioquímicas- Ej: Lisina decarboxilasa y fermentación de lactosa para diferenciar EIEC de otros virotipos de E. coli. Ej: Propiedades bioquímicas diferenciales entre las especies y las subespecies de Salmonella. También las serovariedades de S. enterica subsp enterica tienen pruebas bioquímicas características (con excepción de Typhi y Paratyphi A). Detección de serotipo o serogrupo -Serotipificación o Seroagrupamiento- Ej: Detección del antígeno somático O157 (equipos comerciales basados en aglutinación con antisuero policlonal anti-o157 o aglutinación con partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos anti-o157). Ej: Detección de serogrupos A (S. dysenteriae), B (S. flexneri), C (S. boydii) o D (S. sonnei) de Shigella (aglutinación con antisueros polivalentes inicialmente, y si es A, B o C, luego se prueban antisueros monovalentes para detectar serotipo). Es fundamental la detección con monovalente para detectar S. dysenteriae 1, por su elevada patogenicidad. Ej: Detección de serogrupos en Salmonella que corresponden a los ag somáticos O más frecuentes: O:2 (A), O:4 (B), O:7 (C1), O: 8 (C2-C3), O:9 (D1), O:3,10 (E1), empleando aglutinación con antisueros con distintas combinaciones comerciales (polivalentes). A: Paratyphi A entre otras; B: Typhimurium entre otras; D: Typhi entre otras. Si hay aglutinación con algún polivalente, se prueban los antisueros de grupo O

39 Diagnóstico de laboratorio Detección de toxinas Cultivo celular. Ej: toxinas LT y ST causan efecto citopático en células Vero (efecto citotónico-céls alargadas- y efecto citotóxico-céls redondas-; respectivamente). Ensayos inmunológicos (EIA en microplaca con anticuerpos mono- o policlonales o Aglutinación con partículas de látex sensibilizadas con el anticuerpo). Ej: kits diagnósticos para detección de Stx1 y Stx2. Hibridización en fase sólida. Ejs: Sondas para detección de LT y ST (ETEC), bfpa que codifica la subunidad mayor de la fimbria Bfp o genes eae del locus LEE (EPEC), locus invasividad del pinv (EIEC), enterohemolisina (EHEC). PCR. Ejs: amplificación de toxinas LT y ST (ETEC), EAF (EPEC), fimbria Bfp (EPEC), gen ipah para Shigella spp/eiec. Complementariedad de métodos de diagnóstico Ejs: - Colonias no fermentadoras de sorbitol con seroagrupamiento positivo con el antisuero anti-o157: se debe realizar la diferenciación bioquímica entre E. coli y E. hermanii. - La producción de Stx no es específica de E. coli. Puede ser producida por Enterobacter o Shigella dysenteriae. Necesidad de confirmación bioquímica. - La agrupación por serogrupos es limitada, porque por ej: serogrupo D: S.

40 Bibliografía para consultar (Biblioteca FCByF, UNR) 1- Manual of clinical microbiology. James H. Jorgensen, Michael A. Pfaller (eds.) 11th ed. ASM Press Mandell, Douglas y Bennet. Enfermedades infecciosas. Principios y práctica. Gerald L. Mandell, John E. Bennett, Raphael Dolin (eds). 7a ed. Elsevier Bailey y Scott. Diagnóstico microbiológico. 12a ed. Editorial Médica Panamericana Koneman's color atlas and textbook of diagnostic microbiology. Winn Washington C, Allen Stephen, Janda William, Koneman Elmer. 6ª ed. Editorial Médica Panamericana Abigail A. Salyers and Dixie D. Whitt. Bacterial pathogenesis. 2nd edition. ASM, Sitios de internet 1- Manual de Microbiología Clínica de la Asociación Argentina de Microbiología. Volumen I. Bacterias de importancia. Lopardo H, Predari S, Vay C (eds).