Capítulo ÁNGEL GIL HERNÁNDEZ DANIEL RAMÓN VIDAL

Transcripción

1 DN recombinante apítulo 19 limentos transgénicos ÁNEL IL HERNÁNDEZ DNIEL RMÓN VIDL ËObjetivos n Entender el concepto de DN recombinante y las principales técnicas moleculares utilizadas actualmente en la ingeniería genética. n dquirir los conceptos de organismos modificados genéticamente y de alimentos transgénicos. n Describir las bases de la obtención de las plantas transgénicas y algunos ejemplos de aplicaciones de la ingeniería genética en agricultura. n onocer las bases de las modificaciones genéticas de las bacterias y otros microorganismos usados comúnmente en la industria alimentaria mediante tecnología de DN recombinante. n Entender los procesos y modalidades utilizados en la obtención de los animales transgénicos. n omprender los procedimientos utilizados para la clonación de animales. n onocer el protocolo que debe seguirse para solicitar la comercialización de los «nuevos alimentos». n onocer las aplicaciones de las normas vigentes sobre el etiquetado y la trazabilidad de nuevos alimentos e ingredientes en la Unión Europea. n omparar la legislación vigente en Estados Unidos con la de la Unión Europea en cuanto a

2 ontenido DN recombinante n INRODUIÓN n ONEPO Y LSIFIIÓN n DN REOMBINNE E INENIERÍ ENÉI n lonado molecular n Enzimas de restricción n Ligado de fragmentos de DN n Otras enzimas de interés en la tecnología del DN recombinante n Vectores de clonación n Selección del DN recombinante n Librerías genómicas n écnicas de visualización y cuantificación de fragmentos de ácidos nucleicos n PLIIONES DE L INENIERÍ ENÉI EN L PRODUIÓN DE LIMENOS n gricultura: plantas transgénicas Obtención de plantas transgénicas plicaciones de la ingeniería genética en agricultura n Industria alimentaria: microorganismos modificados genéticamente Obtención de bacterias lácticas modificadas genéticamente plicaciones en la industria alimentaria de las bacterias lácticas modificadas genéticamente Otras bacterias Obtención y aplicaciones de levaduras y hongos filamentosos modificados genéticamente n Producción animal: animales transgénicos Obtención de animales transgénicos plicaciones de los animales transgénicos n EVLUIÓN DE LIMENOS Y ULIVOS RNSÉNIOS n OMERILIZIÓN DE ORNISMOS MODIFIDOS ENÉIMENE O DE PRODUOS QUE LOS ONENN n Solicitud de autorización de comercialización de un alimento transgénico en el ámbito comunitario Dictamen de la utoridad utorización n Normas legislativas en España Informe de evaluación Régimen de autorización n Etiquetado y trazabilidad de nuevos alimentos y de nuevos ingredientes alimentarios: legislación en la Unión Europea Etiquetado razabilidad n SIUIÓN LEISLIV DE LOS LIMENOS MODIFIDOS ENÉIMENE EN ESDOS UNIDOS Y ÚLIMOS VNES EN L UNIÓN EUROPE n LEISLIÓN RELEVNE SOBRE ORNISMOS MODIFIDOS ENÉIMENE n RESUMEN n BIBLIORFÍ n SIIOS WEB DE INERÉS

3 limentos transgénicos PÍULO 19 n INRODUIÓN Los organismos modificados genéticamente (OM) pueden definirse como organismos en los cuales el material genético, formado por el ácido desoxirribonucleico (DN), ha sido alterado de un modo artificial mediante el uso de la denominada tecnología del DN recombinante o ingeniería genética. Esta técnica permite aislar genes de cualquier organismo vivo donador, seleccionarlos y transferirlos a otro organismo de una especie receptora que en la escala filogenética puede estar relacionada o distante de la donadora. En los países hispanoparlantes los OM también se denominan organismos transgénicos. Desde hace más de tres décadas se han desarrollado nuevos microorganismos, plantas y animales mediante estas técnicas genéticas, las que han permitido crear nue - vos alimentos con distintas propiedades. sí, se han desarrollado nuevas variedades de plantas con resistencia a insectos, virus o herbicidas, leguminosas con contenido mejorado de algún aminoácido o cereales con un mayor valor biológico de sus proteínas. ambién se han creado plantas de cuyas semillas se obtienen aceites con composición nutricional mejorada u otras cuyos frutos presentan un retraso en la maduración o tienen mejorada su textura o color. Por otra parte, se han generado nuevos microorganismos que pueden producir aditivos alimentarios, como colorantes y edulcorantes más eficaces, y se han obtenido microorganismos modificados útiles en los procesos fermentativos destinados a la producción de alimentos. Estas nuevas cepas de bacterias lácticas, levaduras y hongos filamentosos posibilitan el desarrollo de nuevos productos o la prevención de problemas industriales, al estar limitada su infección por virus, especialmente en el caso de las bacterias lácticas. unque el desarrollo de animales modi - ficados genéticamente es más difícil y plantea mayores problemas éticos, también se han desarrollado razas transgénicas para producir peces de mayor tamaño, mejorar la composición de la carne y de la leche en los mamíferos o aumentar la calidad de la lana, así como para producir proteínas con fines terapéuticos. Por otra parte, la clonación de animales de granja es un hecho y, aunque es un proceso aún muy complejo no exento de riesgos, en el futuro podrá permitir mayores producciones de alimentos con mejor calidad. odos estos alimentos transgénicos han de pasar un proceso de evaluación complejo antes de llegar al consumidor. Dicho proceso incluye el estudio de la mejora genética introducida (características del organismo donante y del receptor, sitio de inserción, patrón de expresión del gen transgénico y consecuencias potenciales de la modificación), la seguridad alimentaria del alimento (características nutricionales, composición e inocuidad, toxicidad y alergenicidad posibles, cambios potenciales en la ingesta e impacto nutricional a largo plazo) y el potencial impacto en el medio ambiente. demás, desde el 18 de abril de 2004 la nueva regulación sobre trazabilidad y etiquetado de los OM es de obligado cumplimiento en todos los estados miembros de la Unión Europea. La normativa establece que se indique la presencia de un OM en un producto cuando al menos el 0,9 % de uno de sus ingredientes sea OM o proceda de un OM. demás, la normativa exige conocer con exactitud el origen y los detalles del proceso de producción de los nuevos OM o de los alimentos que los contienen. En este capítulo se analiza el concepto de OM y se describen brevemente las técnicas más utilizadas en la tecnología del DN recombinante. simismo, se describen las técnicas más comunes para la producción de microorganismos, plantas y animales transgénicos de utilidad en alimentación y se ofrecen varios ejemplos de interés. Se destina especial atención a la evaluación sanitaria y medioambiental de dichos productos. Por otra parte, se abordan los aspectos legales relacionados con la producción, la comercialización, el etiquetado y la trazabilidad de los OM, así como su protección jurídica. n ONEPO Y LSIFIIÓN Los alimentos transgénicos, también llamados alimentos modificados genéticamente, son los diseñados para cubrir cualquier necesidad de mejora en los que se ha incorporado material genético distinto del original mediante técnicas de ingeniería genética. Según el derecho alimentario, se considera que se ha creado un nuevo alimento cuando: a) se trata de una materia prima nueva, b) es el resultado del uso de una nueva tecnología de fabricación o de tratamiento, o c) se establece un nuevo uso a un producto ya existente. l respecto, los alimentos obtenidos por modificación genética se consideran nuevos alimentos por pertenecer a una nueva tecnología de fabricación. De hecho, el Reglamento (E) n.º 258/97 del Parlamento Europeo y del onsejo clasifica los nuevos alimentos en seis categorías, quedando los alimentos transgénicos incluidos en dos de ellas. Por un lado, la categoría que considera nuevo alimento o nuevo ingrediente alimentario al que contenga OM o que consista en dichos organismos, por ejemplo, un yogur producido con bacterias de ácido láctico modificadas genéticamente o una lechuga transgénica. Por otro, la categoría que comprende a los alimentos que contengan ingredientes alimentarios producidos a partir de OM, por ejemplo, una galleta que contenga harina de maíz proveniente de una variedad de maíz transgénico. Históricamente, en la normativa jurídica de la Unión Europea, la definición de OM ha tenido un tratamiento especial. sí, la Recomendación de la omisión de 29 de julio de 1997 realizaba una clasificación científica de los nuevos alimentos con miras a la evaluación de su salubridad, en la cual aparecían seis clases de nuevos alimentos, quedando los alimentos modificados genéticamente encuadrados en tres de ellas, denominadas clases 3, 4 y 5, correspondientes respectivamente a vegetales, animales y microorganismos modificados genéticamente y sus productos. En las tres clases se incluían dos subclases relativas a organismos receptores con historial de uso como alimento en la omunidad en condiciones de preparación e ingesta comparables o sin dicho historial de uso. 3

4 OMO II O M P O S I I Ó N Y L I D D N U R I I V D E L O S L I M E N O S 4 Posteriormente, la Directiva 2001/18/E del Parlamento Europeo y del onsejo de 12 de marzo de 2001 sobre la liberación intencional al medio ambiente de organismos transgénicos definía el término OM como «el organismo, con excepción de los seres humanos, cuyo material genético haya sido modificado de una manera que no se produce naturalmente en el apareamiento ni en la recombinación natural». En la Posición omún (E) n.º 22/2003, aprobada por el onsejo el 17 de marzo de 2003, se definía al OM destinado a la alimentación humana como «aquel que puede utilizarse como alimento o como material de partida para la producción de alimentos». En la misma reglamentación se consideraban alimentos modificados genéticamente a «aquellos que contienen o están compuestos por OM, o han sido producidos a partir de ellos». onviene aclarar que la expresión «producido a partir de OM» para los legisladores europeos hace referencia a un derivado total o parcial de OM que no contenga OM o esté compuesto por OM. demás, en esta definición, las técnicas de modificación genética incluyen: a) técnicas de recombinación del DN que consideren la formación de combinaciones nuevas de material genético mediante la inserción de moléculas de ácido nucleico, obtenidas por cualquier medio fuera de un organismo, ya sea en un virus, plásmido bacteriano u otro vector, y su incorporación a un organismo hospedador en el que no se encuentren de forma natural pero puedan seguir reproduciéndose; b) técnicas que supongan la incorporación directa en el genoma de un organismo de material hereditario preparado fuera del organismo, incluidas la microinyección, la macroinyección y la microencapsulación, y c) técnicas de fusión de células (incluida la fusión de protoplastos) o de hibridación, en las que se formen células vivas con combinaciones nuevas de material genético hereditario mediante la fusión de dos o más células utilizando métodos que no se producen naturalmente. Por todo lo expuesto en los párrafos anteriores, resulta evidente que antes de entrar a tratar en profundidad los alimentos modificados genéticamente conviene plantear las técnicas destinadas a su diseño. n DN REOMBINNE E INENIERÍ ENÉI La esencia de la tecnología del DN recombinante es el aislamiento y la manipulación del DN, incluyendo la unión de secuencias de nucleótidos de orígenes diversos (virus, microorganismos, plantas y animales) para generar nuevas moléculas quiméricas o nuevas secuencias independientes. Esta tecnología implica la utilización de muchas metodologías distintas, que se tratarán en este apartado, cuya base es la existencia de varios métodos que implican cortar las cadenas de DN por lugares específicos mediante el uso de las denominadas enzimas de restricción, para posteriormente usar la enzima DN ligasa para unir segmentos de DN de orígenes diferentes, generando así nuevas moléculas de DN quiméricas. Por otra parte, existen técnicas de clonado que permiten amplificar el nuevo DN heterólogo. Su cuantificación, tanto del DN clonado como del RN que transcriba, es abordable gracias, entre otras técnicas, al uso de sondas de DN. Por otro lado, existen métodos químicos y enzimáticos automatizados que posibilitan la secuenciación de largos fragmentos de DN. ambién es posible la síntesis química de oligonucleótidos con una secuencia precisa. Finalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PR) permite la amplificación de una secuencia determinada de DN de forma muy sensible y selectiva. oda esta batería de métodos es la base del trabajo en ingeniería genética y con ellos se consiguen generar e identificar las moléculas quiméricas con las que generar los OM. Para conseguir introducir esas moléculas híbridas en un organismo receptor, en otras palabras, para generar un OM, existen varios métodos, entre los que se incluyen la transformación por plásmidos y la transfección por fagos para el caso de los microorganismos y la transformación, para animales y plantas. En todos ellos las células hospedadoras deben prepararse para poder recibir el DN foráneo. En la transformación microbiana, al generar un DN recombinante se inserta en él un marcador seleccionable que permite la identificación de las moléculas recombinantes, por ejemplo, un gen de resistencia a un antibiótico o un gen que codifica una enzima clave en la síntesis de un aminoácido (marcador auxotrófico). uando se utiliza un gen marcador de resistencia a un antibiótico, la célula portadora del DN recombinante crece en un medio de cultivo que contiene el antibiótico. uando se utiliza un marcador auxotrófico, por ejemplo, un aminoácido, la célula hospedadora es capaz de crecer en un medio de cultivo pobre en nutrientes que no contiene dicho aminoácido. La transfección con fagos supone generar fagos recombinantes en los que parte de su material hereditario se sustituye por el gen transgénico que se quiere expresar o, simplemente, se suplementa con dicho gen. La introducción del gen transgénico se realiza siguiendo el proceso natural de infección vírica. En el caso de la transformación no bacteriana, se transforman células de origen vegetal o animal mediante diferentes procesos, como la microinyección del DN directamente en el núcleo o el bombardeo de la célula con microproyectiles en forma de partículas de oro o tungsteno recubiertas con el DN recombinante. En el caso de los vegetales, también se puede utilizar una estrategia natural de transformación basada en el empleo del plásmido i de la bacteria grobacterium tumefaciens, que en la naturaleza transforma células vegetales generando tumores. Para ello, se eliminan de dicho plásmido las secuencias que codifican las proteínas implicadas en el desarrollo tumoral y se sustituyen por un marcador de resistencia y por el gen transgénico que se quiere expresar. omo en el caso de la transfección, a continuación se sigue el proceso de transformación que se da en la naturaleza. El DN recombinante funciona cuando la célula transformada expresa la proteína o las proteínas correspondientes a los genes presentes en él. Las proteínas recombinantes sólo se expresan en cantidades apreciables si, además de los genes, se incluye toda una serie de señales adicionales que permiten la transcripción y la traducción de dicha información genética. Estas secuencias son los pro-

5 limentos transgénicos PÍULO 19 motores, las secuencias génicas que permiten la unión de los mrn a los ribosomas y las señales de terminación (cap. 5, Síntesis, degradación y recambio de las proteínas, tomo I, y cap. 6, Regulación de la expresión génica en organismos eucariotas, tomo I). veces, se generan problemas si el gen recombinante contiene intrones o ciertas señales que actúan de terminadores en el hospedador bacteriano. De esta forma, la proteína recombinante puede ser procesada o plegada incorrectamente o incluso ser degradada. Mención aparte merece la producción de proteínas recombinantes de uso en agroalimentación en sistemas microbianos eucarióticos, fundamentalmente levaduras y hongos filamentosos. El uso de células animales es difícil, debido al hecho de que muchas de ellas necesitan una superficie para crecer y tienen necesidades nutritivas complejas. Sin embargo, algunas proteínas son demasiado complejas para poderse producir en bacterias. Sufren procesos de modificación química (acetilaciones, glucosilaciones) y obligatoriamente tienen que utilizarse células eucarióticas para producirlas correctamente. n lonado molecular Un clon es una población de moléculas, bacterias, células o individuos idénticos que derivan de un ancestro común. El clonado molecular permite la producción de gran número de moléculas idénticas de DN. Esta técnica se basa en la posibilidad de construir moléculas de DN híbrido o moléculas quiméricas utilizando vectores de clonado, como plásmidos, fagos, cósmidos o cromosomas artificiales, que se pueden replicar de forma autónoma en una célula hospedadora utilizando sus propios sistemas de control. De esta manera se puede amplificar el DN quimérico. ualquier procedimiento de clonación tiene cuatro partes esenciales: a) un método de obtención de fragmentos de DN; b) la unión del DN a un vector, con la consiguiente obtención del DN recombinante; c) la introducción del DN recombinante en un hospedador, y d) la disponibilidad de un método de selección del clon que ha adquirido el DN recombinante. La figura 19-1 ilustra el procedimiento general de obtención de DN recombinante y la figura 19-2, el de clonado de DN. Para la obtención de fragmentos de DN se utiliza preferentemente la digestión con enzimas de restricción (v. Enzimas de restricción, más adelante), pero también se pueden obtener por rotura mecánica, síntesis de cdn y síntesis química directa de oligonucleótidos. La unión al vector (v. Vectores de clonación, más adelante) se lleva a cabo mediante la ligación de extremos cohesivos, la ligación de extremos romos, el encolado mediante homopolímeros o el empleo de moléculas espaciadoras, utilizando varias enzimas (v. Ligado de fragmentos de DN y Otras enzimas de interés en la tecnología del DN recombinante, más adelante). La introducción del DN recombinante se lleva cabo mediante procedimientos de transformación bacteriana con DN plasmídico, transducción con fagos o cósmidos y, en el caso de células eucariotas, mediante transformación o transfección con vectores diversos (v. Vectores de clonación, más adelante). La selección de los clones se realiza mediante métodos microbiológicos, inmunoquímicos y de hibridación con ácidos nucleicos n Enzimas de restricción Las endonucleasas son enzimas que cortan el DN en secuencias específicas dentro de la molécula, en oposición a las exonucleasas, que digieren los extremos terminales de las moléculas de DN. Un tipo de endonucleasas, denominadas genéricamente enzimas de restricción porque su presencia en una bacteria determinada restringe el crecimiento de bacteriófagos, representa una herramienta clave en la tecnología del DN recombinante. Estas enzimas cortan el DN de cualquier origen en secuencias muy específicas, al contrario que otras enzimas o métodos químicos o físicos que lo hacen al azar. En la naturaleza protegen a la bacteria hospedadora de la infección por fagos, impidiendo la replicación del DN foráneo. ctualmente se conocen miles de estas enzimas, así como la secuencia específica de corte. Las enzimas de restricción están acompañadas en las células de otras enzimas que metilan el DN del hospedador, lo que impide la digestión por la propia enzima de restricción. sí, las metilasas específicas de sitio y las enzimas de restricción siempre están en las bacterias de forma apareada. Las enzimas de restricción se denominan mediante varias letras que hacen mención a la bacteria de la que proceden. Las tres primeras letras sirven para nombrar el género (primera letra) y la especie (segunda y tercera letras). Estas pueden ir seguidas de una letra que designa la cepa y de un número romano que indica el orden del descubrimiento. Por ejemplo, se ha obtenido de la cepa R de la bacteria Escherichia coli, y BamHI, de la cepa H de Bacillus amyloliquefaciens. La enzima I se obtuvo después de la (tabla 19-1). ada enzima de restricción corta una secuencia específica de DN de doble cadena de 4 a 7 pares de bases (pb), dando lugar a la aparición de extremos romos, como es el caso de I o HpaI o de extremos solapantes o cohesivos, por ejemplo BamHI. La figura 19-3 muestra el mecanismo de acción de la enzima de restricción. eniendo en cuenta que el DN está constituido por cuatro bases diferentes (,, y ), una enzima de restricción que reconoce una secuencia de 4 pb corta una media de cada 4 4 pb (256 pb) y una que reconoce una secuencia de 6 pb corta cada 4 6 pb (4.096 pb). Por lo tanto, se puede elaborar en una determinada secuencia o fragmento de DN un mapa de restricción utilizando varias enzimas. Los fragmentos producidos pueden separarse y, posteriormente, aislarse por electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, siendo éste un paso esencial para la clonación. n Ligado de fragmentos de DN El ligado de fragmentos con extremos cohesivos es teóricamente muy sencillo, ya que después del apareamiento, la 5

6 OMO II O M P O S I I Ó N Y L I D D N U R I I V D E L O S L I M E N O S DN complejo portador del fragmento de interés DN vector DN enteros DN digeridos Molécula recombinante Ligación Productos de la mezcla de ambos DN con 4 DN ligasa Figura Obtención de DN recombinante. 4 DN ligasa: DN ligasa procedente del bacteriófago 4. enzima DN ligasa une los fragmentos complementarios de los DN heterólogos, dando lugar a la formación de una molécula de DN recombinante (fig. 19-4). Sin embargo, los extremos de un vector pueden reconectarse por sí mismos después del tratamiento con una enzima de restricción. simismo, también pueden aparearse formando concatémeros heterogéneos. Para solventar estos problemas se usan diluciones extremas de los fragmentos. En el caso de moléculas In vitro In vivo Escherichia coli K12 portadora del vector élula que contiene el DN de interés Escherichia coli K12 para transformar élulas competentes 1 Purificación del DN 4 ransformación 2 Digestión 3 Ligación 5 Selección ción de clones transformantes 6 Detección de clones recombinantes 6 Figura Procedimiento general de clonado de DN.

7 limentos transgénicos PÍULO 19 abla 19-1 Enzimas de restricción y secuencias de corte del DN 5 Sitio de reconocimiento Endonucleasa Secuencia de corte Fuente bacteriana BamHI BgIII Bacillus amyloliquefaciens H Bacillus globigii ratamiento con olas complementarias Escherichia coli RY13 I Escherichia coli R245 HindIII Haemophilus influenzae Rd eneración de extremos cohesivos HhaI HpaI Haemophilus haemoliticus Haemophilus parainfluenzae Extremo cohesivo MstII N N Microcoleus strain PstI aqi Providentia stuartii 164 hermus aquaticus YI : adenina; : citosina; : guanina; : timina. Las flechas muestran el sitio de corte. Según el sitio de corte se forman extremos romos (p. ej., HpaI) o extremos cohesivos (p. ej., BamHI). con extremos romos se añaden nuevas colas de polinucleótidos a los extremos 3. Esta enzima se denomina transferasa terminal. Por ejemplo, si se añade poli-d al extremo 3 de un vector y poli-d al extremo 3 del DN, se aparearán entre sí. Este procedimiento se denomina encolado homopolimérico. ambién se pueden unir segmentos sintéticos de DN de doble cadena con extremos romos, que contienen uno o más sitios específicos para enzimas de restricción, denominados DN recombinante Figura Mecanismo de acción de la enzima de restricción y su aplicación en la generación de moléculas de DN recombinante. espaciadores o polilinkers, a los extremos del DN de cualquier fragmento utilizando la DN ligasa procedente del bacteriófago 4. Esta técnica permite unir cualquier par de extremos, aunque no existe control de la orientación de la inserción o del número de moléculas apareadas consigo mismas. n Otras enzimas de interés en la tecnología del DN recombinante En la tecnología del DN recombinante se utiliza otra serie de enzimas cuyas funciones se detallan a continuación. La fosfatasa alcalina desfosforila los extremos 5 del RN y del DN. Se utiliza para eliminar los grupos 5 -fos- 7

8 OMO II O M P O S I I Ó N Y L I D D N U R I I V D E L O S L I M E N O S Digestión con Digestión con Hibridación de fragmentos complementarios Hueco Hueco DN ligasa Figura Ligado de DN heterólogo y formación de DN recombinante. 8 fato y prevenir así la autoligación de fragmentos de DN. La nucleasa BL-31 degrada tanto el extremo 5 como el 3 de moléculas de DN, provocando el acortamiento progresivo de los fragmentos. Se utiliza para generar subfragmentos de secuenciación y también para localizar genes concretos. La DN polimerasa I sintetiza la formación de DN de doble cadena a partir de una hebra simple de DN que sirve como modelo. Se utiliza para la síntesis de cdn, la eliminación de mellas y la generación de extremos romos a partir de extremos cohesivos. La enzima DNasa I bajo condiciones apropiadas produce mellas en el DN y se utiliza en el mapeado de sitios hipersensibles del DN y en el mapeado de lugares de interacción del DN con proteínas. La exonucleasa l elimina nucleótidos del extremo 5 y la exonucleasa II elimina nucleótidos del extremo 3. mbas se usan en la secuenciación del DN. La polinucleótido quinasa transfiere fosfatos terminales en posición l desde el adenosintrifosfato (P) hasta los grupos hidroxilo en 5 del DN o del RN y se utiliza en el marcado con el isótopo 32 P del DN o del RN. La transcriptasa inversa sintetiza DN a partir de RN y se usa para sintetizar cdn a partir de RN y para el mapeado de regiones 5 del RN. Finalmente, la nucleasa S1 degrada el DN de cadena simple y se utiliza en la eliminación de bucles en la síntesis de cdn y en el mapeado de las regiones 5 y 3 del RN. n Vectores de clonación Los vectores de clonación son plásmidos o fagos o variaciones de ellos. Los plásmidos son moléculas de DN de doble cadena circulares cuya función natural más importante es conferir ventajas adaptativas a las células que los contienen. Los plásmidos tienen varias propiedades que hacen que sean muy útiles como vectores de clonado. Por ejemplo, están presentes en las bacterias como copias úni - cas o múltiples que se replican independientemente del DN bacteriano. ctualmente se conoce la secuencia completa de numerosos plásmidos, así como la localización precisa de los sitios de corte para diferentes enzimas de restricción y, por lo tanto, los lugares en los que es posible insertar DN de otros organismos. demás, los plásmidos, al tener un tamaño muy distinto al del cromosoma bacteriano, pueden aislarse con facilidad. La figura 19-5 muestra el mapa de restricción del plásmido pbr322 de E. coli, y la figura 19-6, la inserción de DN extraño en un plásmido. Los fagos son virus que atacan bacterias y están constituidos usualmente por moléculas de DN lineal, con varios sitios de corte para enzimas de restricción específicas en los cuales puede insertarse el DN foráneo, de forma que el conjunto se empaqueta en la cabeza proteica del virus. El DN quimérico formado puede recogerse después de que se complete el ciclo de lisis celular, de modo que se produzcan numerosas partículas infectivas. La ventaja de los fagos como vectores en el clonado molecular de DN es que pueden aceptar fragmentos de DN de kpb, mientras que los plásmidos tan sólo pueden aceptar fragmentos de 6-10 kpb. Los cósmidos son plásmidos que contienen unas secuencias específicas, denominadas cos, necesarias para el empaquetamiento del DN del fago l dentro de su cabeza. Estos plásmidos combinan las ventajas de los propios plásmidos y de los fagos, ya que crecen dentro de la bacteria como plás-

9 limentos transgénicos PÍULO 19 midos, pero pueden almacenar una cantidad mucho mayor de DN dentro de la cabeza del fago, ya que la mayor parte del genoma del fago l ha sido eliminada. Usualmente los cósmidos pueden llevar insertos de hasta 50 kpb. Otro tipo de vector de clonación son los cromosomas artificiales de levaduras (yeast artificial chromosome, Y). Pueden llevar insertos mucho más grandes, ya que se trata de segmentos cromosómicos de levaduras, por lo tanto lineales, que contienen la región centromérica, siendo segregados de manera muy estable de acuerdo con patrones mendelianos. Los Y permiten clonar segmentos de DN de más de 40 kpb, incluso hasta cientos de kpb y, por lo tanto, la amplificación de grandes moléculas de DN con un fondo genético simple. En las levaduras, además de los Y, se utiliza para la clonación toda una serie de plásmidos (episómicos, centroméricos, etc.). Para la inserción y expresión del cdn en células de mamíferos se han desarrollado vectores específicos basados en virus animales, por ejemplo adenovirus, que tie - nen genomas DN, y retrovirus, que tienen genomas RN. unque estos vectores tienen limitaciones en cuanto a la longitud de los insertos, son capaces de infectar numerosos tipos celulares y permiten la expresión eficiente de genes complejos. Un tipo especial de vector es el constituido por los denominados vectores de expresión. Permiten la expresión de uno o varios genes introducidos con el inserto de DN. Estos vectores están construidos de manera que, por un lado, contienen promotores muy activos fácilmente inducibles y, por otro, codones adecuados que permiten el inicio de la traducción en fase de los RN correspondientes. ambién contienen señales para la terminación de la transcripción y de la traducción y para el procesamiento de las proteínas (cap. 5, Síntesis, degradación y recambio de las proteínas, tomo I, y cap. 6, Regulación de la expresión génica en organismos eucariotas, tomo I). n Selección del DN recombinante omo anteriormente se indicó, todos los vectores llevan un marcador o propiedad genética seleccionable. Los plásmidos y los cósmidos llevan marcadores nutricionales o de resistencia a antibióticos u otros fármacos. En el caso de los fagos, la formación de placas de lisis representa en sí misma la propiedad seleccionada. En el caso de los DN recombinantes que llevan un vector plasmídico con marcadores de resistencia a antibióticos, la selección de las células clonadas se realiza utilizando medios de cultivo que llevan añadidos dichos antibióticos, ya que en estos medios sólo crecen las bacterias que llevan los plásmidos recombinantes. La inactivación por inserción del DN foráneo de un marcador de resistencia a antibióticos o de un gen como la b-galactosidasa son ejemplos de cómo se puede seleccionar una población de células recombinantes. Por ejem - plo, si en el conocido vector plasmídico pbr322, que tiene como marcadores de resistencia los genes que codifican para la resistencia a la tetraciclina (tet) y a la ampicilina (amp), se inserta un segmento de DN foráneo en el sitio único de corte para la enzima de restricción PstI (ubicado en el locus amp), las bacterias que incorporen este DN recombinante serán resistentes a la tetraciclina pero sensibles a la ampicilina. La detección por técnicas inmunoquímicas de clones que sintetizan una nueva proteína es útil si el gen insertado se transcribe y traduce a proteína, especialmente cuando el gen no confiere ninguna propiedad al hospedador fácilmente seleccionable con otros métodos. Para utilizar esta HindIII on sitios únicos de restricción para poder clonar en ellos on un marcador directamente seleccionable (selección) on un marcador que se inactive por la introducción del inserto (detección) mp r PstI pbr322 4,4 kb et r SalI Pequeñas moléculas de DN autorreplicativas (plásmidos o genomas fágicos) ole1ori Figura aracterísticas de los vectores de clonación. Se representa el plásmido pbr322 de E. coli que contiene un origen de replicación, varios sitios de restricción únicos (, HindIII, SalI) y dos marcadores de resistencia a antibióticos (ampicilina y tetraciclina). mp: ampicilina; et: tetraciclina. 9

10 OMO II O M P O S I I Ó N Y L I D D N U R I I V D E L O S L I M E N O S Plásmido DN para ser insertado Extremos cohesivos Recombinación y ligación de DN DN recombinante Figura Inserción de DN extraño en un plásmido. 10 técnica, es necesario disponer del anticuerpo específico para la proteína codificada en el transgén. Finalmente, es posible acudir a los métodos de hibridación con ácidos nucleicos para la selección de recombinantes. El procedimiento consiste en detectar secuencias determinadas de DN en colonias transformadas por hibridación in situ con sondas radiactivas o marcadas con un fluoróforo de fragmentos de DN del gen que se quiere detectar. Este método es capaz de identificar una colonia positiva entre miles de negativas. Una gran ventaja de los métodos de hibridación es que no requieren la expresión de los genes insertados y puede aplicarse a cualquier secuencia. n Librerías genómicas La combinación de enzimas de restricción y de varios vectores de clonado permite el empaquetado del genoma completo de cualquier organismo. La colección de clones recombinantes que constituyen el genoma global se denomina genoteca o librería genómica. De forma similar, una librería de cdn comprende todos los cdn complementarios de la población de mrn presentes en un organismo o tejido determinado. Las librerías genómicas se preparan por digestión parcial del DN genómico utilizando una enzima de restricción, con objeto de generar fragmentos suficientemente largos de DN de manera que contengan genes completos intactos. Estos fragmentos se reinsertan en vectores que permiten la inserción de fragmentos largos de DN como los Y o los vectores basados en el bacteriófago P1 de E. coli. Para detectar la función de genes presentes en el cdn de las librerías genómicas se utilizan vectores de expresión, algunos de ellos con genes que codifican para inhibidores de proteasas, con lo que la producción de la proteína final aumenta. Las sondas marcadas con 32 P o con una molécula fluorescente se utilizan para reconocer secuencias complemen-