INFORME TÉCNICO AVANCE N 1

Transcripción

1 INFORME TÉCNICO AVANCE N 1 "Desarrollo de Sugarlow, producto inhibidor de alfa amilasa, para el control de peso y tratamiento de obesidad con primer uso en animales domésticos y aplicación en humanos en el mediano plazo" Código Consultora Biotecnológica S.A. 1

2 CONTENIDO 1. Objetivo del proyecto 2. Protocolo estandarizado de extracción 3. Logros del año 1 del proyecto 4. Conclusiones del año 1 5. Objetivos para el año 2 del proyecto 6. Anexo experimental Caracterización del inhibidor de la invertasa Caracterización del inhibidor de la alfa amilasa Protocolo de purificación de inhibidores Trabajo con extracto 818 en ratones para demostrar no alteración de la palatabilidad del alimento. 2

3 1.- Objetivo del Proyecto SUGARLOW La obesidad humana denominada la pandemia silenciosa del hombre del siglo XXI esta causando estragos en la población humana sin distinguir sexo, raza, edad, condición social o geográfica. Esta enfermedad que rápidamente se esta introduciendo en nuestras sociedades no es fácil de combatirla pues tiene múltiples causas que involucran el background genético y el hábito alimenticio de la persona afectada. Diferentes alternativas se han propuesto y llevado a la práctica, desde el empleo de drogas que inhiben el hambre, operaciones quirúrgicas que implican la eliminación de un porcentaje importante del estomago, cambios alimenticios y la substitución del azúcar considerado como uno de los causantes principales de la obesidad junto con las harinas. Al respecto, la mejor alternativa para sustituir el azúcar ha sido reemplazarla por diferentes moléculas que son capaces de endulzar una comida liquida o sólida pero sin aportar calorías al consumidor Figura 1. Lamentablemente, el valor de estas moléculas fluctúa entre 50 a 100 veces más que el del azúcar limitando así su consumo por toda la población afectada. Además, hasta ahora no hay un substituto para las harinas a excepción de una modificación genética realizada en Australia con el trigo que impide la digestión de su harina, pero por ser un organismo genéticamente modificado hay restricción en su cultivo. El proyecto SUGARLOW tiene como objetivo identificar moléculas inhibitorias de las enzimas involucradas en la digestión del azúcar de caña o remolacha, la invertasa y de las harinas, la alfa amilasa. Más aun, estas moléculas deberán tener ciertas propiedades que les permitirán incluirse en los alimentos, de tal manera que el consumidor no tendrá necesidad de cambiar su hábito alimenticio sino más bien controlar su ingesta Figura 1. Es importante mencionar que esta idea es la primera ves que se desarrolla a nivel mundial. 3

4 Figura Nº1 Cómo resolver la obesidad causada por hidratos de carbono? 1. Alternativa N 1 Encontrar un substituto al azúcar.nutrasweet. - Nutrasweet es 100 veces más caro que el azúcar. 2. Alternativa N 2, SUGARLOW... Reducir la digestión de los carbohidratos Carbohidratos Sugarlow Bloqueo enzimático Glucosa 1.- Las glándulas salivales y el páncreas poseen enzimas que digieren los carbohidratos complejos hasta glucosa, fructuosa y galactosa. 2.- La actividad de SUGARLOW es inhibir éstas enzimas. Así no se asimilarán como grasa al organismo y se eliminarán con las heces. a. SUGAROW I Azúcar: inhibidor de invertasa que digiere el azúcar producido desde la caña de Azúcar o remolacha convirtiendo la sacarosa en glucosa y fructuosa. b. SUGARLOW II Harina: inhibidor de la alfa amilasa que digiere las harinas producidas desde arroz, papa (almidón, polímero de glucosa, dextrina) y la harina de trigo (Amilosa, Amilopectina). 4

5 2.- Protocolo estandarizado para extraer principio activo Procedimiento Estándar para extracción del extracto 818 (SugarLow) Crecimiento Bacteriano. Se procede a crecer 818 en un medio ori. Se deja con agitación en un Shaker por 5 días Sonicación. Se procede a sonicar el extracto 818. Se deja alrededor de 30 a 60 minutos, dependiendo del volumen. Para 2 litros se deja 30 minutos. 5

6 2.3.- Evaporación. En esta etapa se procede a evaporar el extracto sonicado 1, para lo cual, se procede a dejar en la vitrina a ~ 5 C por 30 minutos. Luego se coloca en el baño del rotavapor a 25 C, con vacío y agitación suave. El sube la temperatura a cada 20 minutos en escalas de 4 C hasta llegar a una temperatura de 45 C. Se deja hasta llegar a un volumen aproximado de 100 ml Extracción con centrífuga. Se utilizan frascos de vidrio de 100 ml. Se agrega un volumen de 40 ml de extracto y 40 ml de solvente orgánico (Hexano p.a.). Se agitan en forma vigorosa y se colocan en la centrífuga a 2100 RPM por 20 minutos. Luego de este procedimiento se trasvasija a un balón de 500 ml para su posterior evaporación. 6

7 2.5.- Rendimiento. Se procede a pesar un balón de 100 ml y se trasvasija el compuesto evaporado. Con esto obtenemos un peso por volumen de extracto bacteriano Placas TLC. Se procede a realizar placas TLC (cromatografía en capa fina) con el objeto de observar el comportamiento de los compuestos extraídos a una polaridad determinada (10% Acetato de Etilo:hexano) Fraccionamiento del extracto mediante columna y análisis por GCMS El extracto fraccionado en una columna mixta (resina-carbón) y se recuperaron 7 fracciones para ser analizadas en su actividad (inhibición de la α-amilasa) y por GCMS. NOTA El resultado GCMS se incluirá en el anexo 7

8 3. Logros del año 1 del Proyecto 3a. SUGARLOW I Azúcar: inhibidor de la invertasa. Empleando como modelo la invertasa de levadura que tiene una estructura y función similar a la presente en el intestino humano (producto bacteriano), se evaluaron 503 extractos químicos de diferentes clones bacterianos (ver detalle en anexo sobre técnica). Empleando el ensayo se demostró actividad en 50 de ellos (Figura 2). Luego, los extractos positivos fueron expuestos a una incubación de 100ºC por 1.5 hora y luego se realizó la evaluación inhibitoria del extracto bacteriano expuesto a esta condición. Nº de Extracto % inhibición después de 100ºC 1.5h Control Aunque la inhibición observada sale de la curva Standard realizada de inhibición, creemos que estos son los mejores inhibidores, candidatos para elucidar su estructura. La razón por la cual se deseaba un inhibidor capaz de resistir 100ºC es nuestro interés que este inhibidor se incluya en el azúcar durante su proceso de cristalización que ocurre a 80ºC. De esta manera estamos seguros que no es sensible a la temperatura y su propiedad inhibitoria se mantendrá intacta. Titulación Inhibición Inhibición 8

9 3b. SUGARLOW II harina: Inhibidor de la alfa amilasa Detección e inhibición de la actividad alfa-amilasa como ejemplo de proceso de glicosilación Para determinar la inhibición de la actividad de la enzima alfa-amilasa, se utilizó como referencia de inhibición, la disminución de la afinidad de derivados del almidón con el Yodo metálico. El almidón forma un complejo con el yodo, el cual presenta un color oscuro azulado. Cuando el almidón se hidroliza por la acción de la alfa amilasa, los productos de su hidrólisis, amilopectina y amilosa, no son capaces de unírsele, observándose entonces un color amarillo claro derivado de la presencia de yodo en solución. La ausencia de actividad de alfa-amilasa en una solución que contiene almidón presentan una coloración oscura, en tanto que la coloración de la solución cuando esté presente la actividad enzimática será de un color amarillo claro (Figura 1A). Para determinar cualitativamente la capacidad inhibidora de alfa amilasa de extractos de los microorganismos, se agregaron los extractos a la solución de almidón e inmediatamente esta mezcla se incubó con la enzima. Los resultados muestran la presencia de varios inhibidores de alfa-amilasa, los cuales, a juzgar por las diferentes coloraciones de los complejos obtenidos (quizás diferentes grados de inhibición enzimática), presentan diferente actividad específica, reflejado en (Figura 1B). Estos resultados apoyan la existencia de inhibidores de glicosilasas en los extractos a evaluar, dejando así la posibilidad encontrar nuevas principio para combatir la patología propuesta. A. B. Figura 1. A. Presencia (Izquierda) y ausencia (derecha) de actividad α- amilasa. B. Presencia de inhibidores de actividad α-amilasa en algunos de los extractos bacterianos evaluados. Nótense los diferentes grados de inhibición de esta actividad enzimática, revelado por las diferentes tonalidades de amarillo obtenidas. Nº Extractos Positivos 100% inhibición

10 4. Conclusiones logros del año 1 4a.- Para el SUGARLOW I Azúcar: 4a1.- Tenemos 5 extractos candidatos del cuál obtener la molécula de interés. Empezaremos por el extracto Nº1521 y tenemos 4 extractos back up. 4a2.- El extracto Nº1521 fue temperatura resistente (100ºC por 1.5 h) esto permitirá que se incluya durante el proceso de cristalización del azúcar que ocurre a 80ºC. 4a3.- El ensayo de la invertasa ha funcionado y demostrado su efectividad para detectar inhibición de la invertasa. Por lo tanto, el mismo ensayo será empleado para aislar la molécula inhibitoria. 4b.- Para el SUGARLOW II harina: 4b1.- Las prueba realizada con ratones demostró que no cambió el sabor del alimento lo cual se confirma por la no disminución en el peso los animales expuestos a un alimento que embebidos el extracto que contenía el principio SUGARLOW II harina. 4b2.- Se demostró que es ph ácido resistente pues fue su actividad no disminuyó después de una incubación a 3 horas a ph 3.0 4b3.- Se demostró que es temperatura resistente pues fue incubado a 135 C por 30 minutos y mantuvo su capacidad inhibitoria. 10

11 5.- Objetivos de año 2 del proyecto 5a.- Para el SUGARLOW I Azúcar: 5a1.- Purificar, aislar y determinar la estructura molecular del inhibidor presente en el extracto Nº a2.- Lograr la síntesis del inhibidor presente en el extracto Nº a3.- Demostrar que el principio Nº1521 es temperatura resistente (100ºC) y que puede incluirse durante el proceso de cristalización del azúcar que ocurre a 80ºC. 5a4.- Demostrar que no sea mutagénico, carcinogénico, promotor tumoral ni teratogénico. 5a5.- Que no induzca anomalías digestivas incompatibles con la digestión de los azúcares. 5b.- Para el SUGARLOW II harina: 5a1.- Purificar, aislar y determinar la estructura molecular del inhibidor presente en el extracto Nº818. 5a2.- Lograr la síntesis del inhibidor presente en el extracto Nº818. 5a3.- Demostrar que el principio Nº18 es temperatura resistente (135ºC) y que puede incluirse durante el proceso de producción de fideos y resiste a la cocción. 5a4.- Demostrar que no sea mutagénico, carcinogénico, promotor tumoral ni teratogénico. 5a5.- Que no induzca anomalías digestivas incompatibles con la digestión de los azúcares. 5b6.- Buscar la modificación que permita que el inhibidor resista 30 minutos a 220ºC lo cual permitirá su empleo en la producción del pan. 11

12 ANEXO EXPERIMENTAL 12