Facultad de Ciencias de la Salud Carrera de Licenciatura en Farmacia

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1 UNIVERSIDAD DE BELGRANO Las tesinas de Belgrano Facultad de Ciencias de la Salud Carrera de Licenciatura en Farmacia Descripción de la actividad antiviral de Microcina J25 y Fragarina contra virus de importancia sanitaria Nº 97 Yanina Lorena Rosenberg Tutora: Mónica B. Wachsman Departamento de Investigación Abril 2004

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3 A mis padres por su incondicional apoyo en este y todos mis emprendimientos. A mi novio por estar a mi lado en cada momento, ayudándome siempre. A mis compañeros de carrera porque con ellos el camino se me hizo más fácil. A quien inspiro en mí este tipo de trabajo. Agradecimientos. A la Dra. Mónica B. Wachsman por su gran dedicación y paciencia, por ayudarme y confortarme constantemente y por haber confiado en mí para hacer este trabajo. Mi especial agradecimiento por mostrarme el mundo de la virología más de cerca y por mantener siempre un excelente e incomparable trato. También le agradezco por la revisión crítica de este trabajo. A la Dra. Celia E. Coto por haberme dado la posibilidad de trabajar en el laboratorio de Virología del Departamento de Química Biológica, de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad de Buenos Aires y por su trato tan cordial. A la Lic. Laura Talarico por su gran colaboración y ayuda.

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5 Indice Resumen abstract... 7 Introducción Antivirales Generalidades Mecanismo de acción Búsqueda de nuevos antivirales Características de un antiviral ideal Aplicaciones clínicas de los antivirales Antivirales de uso clínico Inhibidores de la ADN polimerasa viral Inhibidoresde la transcriptasa reversa Bloqueantes de los canales iónicos Bloqueo de la adsorción y del desnudamiento del virión Inhibidores de la proteasa viral Oligonucleótidos específicos Inhibidores de proteínas reguladoras Interferón Limitaciones de la quimioterapia antiviral Mutantes resistentes Virus Virus Herpes Simples Características Estructura del virión Ciclo de multiplicación viral Epidemiología Sintomatología y tratamiento Virus de la Poliomielitis Características Estructura del virión Ciclo de multiplicación vira Epidemiología Sintomatología y tratamiento Virus del Sarampión Características Estructura del virión Ciclo de multiplicación viral Epidemiología Sintomatología y tratamiento Virus de la estomatitis vesicular (VSV) Características Estructura del virión Ciclo de multiplicación viral Epidemiología Sintomatología y tratamiento Arenavirus Características Estructura del virión Ciclo de multiplicación viral Epidemiología Sintomatología y tratamiento Microcina J25 y Fragarina Compuestos antivirales de origen natural Péptidos antimicrobianos Clasificación Mecanismo de acción de los péptidos antimicrobianos

6 3.3- Microcina J Fragarina Objetivos Materiales y Métodos Medios de cultivo Células Virus Compuestos ensayados Obtención de los stocks virales Ensayo de viabilidad celular Ensayos antivirales Titulación de la infectividad viral Ensayo de inhibición del rendimiento viral Actividad virucida Resultados Preparación de stocks virales Evaluación del efecto de la MccJ25 y fragarina sobre la viabilidad celular Evaluación de la actividad antviral de la MccJ25 y fragarina Evaluación de la actividad virucida de la Mcc J25 y fragarina Discusión Referencias Abreviaturas

7 Resumen Todas las especies animales y vegetales poseen ciertos mecanismos de defensa ante agentes extraños. Algunos de estos son secretados en respuesta a una agresión. Mientras que otros, como los compuestos aquí estudiados, son producidos en condiciones normales. La Microcina J25 es un ciclopéptido antibacteriano de 2.107Da producido por Escherichia coli AY25. La Fragarina es un compuesto de 306Da, también con actividad antimicrobiana, aislado de hojas de frutilla Fragaria ananassa. En este trabajo, se describe una serie de ensayos en los cuales ambos compuestos muestran indicios de actividad antiviral contra virus Herpes simplex 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2), virus de la estomatitis vesicular (VSV), poliovirus (PV), sarampión (SARV) y los arenavirus Junín (VJ) y Tacaribe (TAC) en células Vero. Esta actividad se observó, a través del ensayo de inhibición del rendimiento viral, a concentraciones muy por debajo de las citotóxicas. La microcina J25, con índices de selectividad mayores a 42,3 y 71,5, es el compuesto que mejor actividad antiviral manifestó contra PV y VSV respectivamente. La fragarina inhibió la replicación de SARV y HSV-2 mejor que la de los otros virus, aunque con menores índices de selectividad: 14,2 y 10 respectivamente. Ambos compuestos, inhibieron la multiplicación viral de forma dosis-dependiente y mostraron una acción antiviral no virucida. Abstract All animal and vegetal species posses several defense mechanisms against foreign agents. Some of these are secreted in response to an aggression. Whereas others, such as the ones studied here, are produced in normal conditions. Microcin J25 is an antibacterial cyclopeptide produced by Escherichia coli AY25. Fragarin is a compound of 306Da, also with antimicrobial activity, isolated from the leaves of the strawberry Fragaria ananassa. In this paper, a series of assays are described in which both compounds show antiviral activity against Herpes simplex viruses type 1 and 2 (HSV-1 and HSV-2), vesicular stomatitis virus (VSV), poliovirus (PV), measles virus (MV) and the arenaviruses Junín (VJ) and Tacaribe (TAC) in Vero cells. This activity was observed using the yield reduction assay, at concentrations much lower than citotoxic ones. Microcin J25, with selectivity indexes higher than 42.3 and 71.5, is the compound with the best antiviral activity manifested against PV and VSV, respectively. Fragarin inhibited the replication of SARV and HSV-2 better than that of the other viruses, but with lower selectivity indexes: 14,2 and 10 respectively. Both compounds, inhibited the viral multiplication in a dose-dependent manner without virucidal effect. 7

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9 Introducción 1- Antivirales Generalidades. Los antivirales son aquellos compuestos capaces de inhibir una o varias etapas del ciclo de multiplicación viral dentro de la célula huésped. En la práctica se procura, para una quimioterapia selectiva, que una droga inhiba la replicación viral a concentraciones no tóxicas para el huésped. Sin embargo, el desarrollo de este tipo de drogas se encuentra obstaculizado por la dificultad que presenta el virus al utilizar la maquinaria intracelular para su replicación. La clave para una quimioterapia exitosa, sería entonces, la inhibición de la replicación viral sin afectar el funcionamiento de la célula huésped. Y de esta forma minimizar la aparición de efectos adversos. La forma más efectiva de combatir las enfermedades virales es a través de vacunas. Pero la prevención no siempre es posible ya que hay enfermedades para las cuales no se han podido desarrollar las mismas. Es por eso que surge la necesidad de nuevas drogas antivirales. En la actualidad, se dispone de un número reducido de drogas antivirales si se compara con la cantidad de antibióticos en el mercado [1]. A pesar de la gran cantidad de compuestos ensayados, la mayoría resultan tóxicos durante su uso in vivo. A este inconveniente se le suma la problemática del surgimiento de cepas resistentes por el uso de antivirales en tratamientos prolongados. Esto conlleva a la utilización de terapias combinadas así como a una acelerada y más diversificada búsqueda de nuevas drogas que eliminen o atenúen la enfermedad evitando el surgimiento de resistencias Mecanismo de acción. El mecanismo de acción de los antivirales se centra en la inhibición de algún proceso esencial para la replicación viral que no involucre ningún paso del metabolismo celular. La adsorción, la penetración y el desnudamiento son eventos que no ocurren en células no infectadas. La transcripción y traducción del genoma viral y clivaje de proteínas precursoras mediadas por enzimas virales son también blancos para los antivirales. Por ejemplo, la inhibición de la proteasa codificada por HIV evita el clivaje del precursor gag (que contiene a las tres proteínas virales principales) y la posterior generación de viriones infecciosos [2]. En el cuadro 1 se muestran algunos ejemplos de drogas y sus respectivos blancos. De acuerdo al mecanismo de acción específico de cada compuesto, los antivirales pueden ser clasificados en: compuestos que interaccionan directamente con sus blancos de acción o compuestos que necesitan primero una activación intracelular. La amantadina, la rimantadina y el foscarnet actúan con sus blancos de acción sin necesidad de una activación previa. Por el contrario, los análogos de nucleósidos, como el aciclovir, necesitan ser activados mediante la fosforilación por quinasas celulares y/o virales para luego interactuar con sus blancos. A su vez, los análogos de nucleósidos pueden inhibir competitivamente la Compuesto Activación intracelular Blanco de acción Proceso inhibido Aciclovir Es fosforilado a monofosfato por la TK* 1 y luego a formas di y tri fosfato por quinasas celulares. ADN polimerasa viral Replicación del ADN Inhibidores de proteasa Ninguna Proteasa viral Clivaje post-traduccional. Zidovudina, inhibidor no nucleosídico de la transcriptasa reversa Es fosforilado a trifosfato. Transcriptasa reversa Transcripción reversa. Rimantadina Ninguna Proteínas de membrana Ensamblaje de los viriones. Ribavirina Es fosforilada a trifosfato por Procesamiento de los ARN enzimas celulares Varios transcriptos. Interferones Ninguna ARNm Traducción Foscarnet Ninguna ADN polimerasa viral Replicación del ADN. Cuadro 1. Blancos de acción. Ejemplos de drogas antivirales y sus respectivos blancos de acción. 9

10 elongación de la cadena de ADN o ser incorporados a la misma produciendo la terminación de esta cadena, interfiriendo de esta forma con la replicación viral Búsqueda de nuevos antivirales. Durante los últimos años los métodos de búsqueda de drogas antivirales fueron evolucionando considerablemente. Las técnicas de screening, hoy en día, pueden lograr que se prueben cientos de compuestos contra un blanco específico en muy poco tiempo. Una aproximación lógica al descubrimiento de nuevos antivirales sería aislar o sintetizar sustancias cuyo blanco se pueda predecir. Para esto, se podría utilizar como punto de partida la estructura de un sustrato de una enzima viral [3]. En la actualidad es posible conocer en detalle estas estructuras gracias a la cristalografía de rayos-x. Conociendo las estructuras primaria y secundaria de dicha enzima es posible predecir, mediante programas computacionales de modelado molecular, si cierto compuesto podría interactuar con la enzima. También, es posible saber de qué forma y las variables que se podrían modificar para optimizar no sólo la actividad antiviral del compuesto sino sus parámetros de solubilidad, hidrofobicidad, etc. De esta forma, se puede llegar a obtener una librería de compuestos análogos a una sustancia de origen natural, algunos de los cuales podrían resultar novedosos en la terapéutica. La propuesta más reciente en la terapia antiviral es la utilización de compuestos basados en oligonucleótidos, así como también el uso de aquellos que puedan modular el sistema inmune [3] Características de un antiviral ideal. Para que una droga sea considerada para el tratamiento de una infección viral debe cumplir ciertos requisitos. La droga debe ser específicamente activa contra el virus target, inhibiendo algún paso esencial de su metabolismo y debe poder debilitar a las cepas resistentes que puedan surgir. Además, debe tener ciertos parámetros que permitan a la droga ser de alta biodisponibilidad oral, rápida penetración en los tejidos infectados y atóxica para las células normales y el organismo en general a corto y largo plazo. La droga debe ser transformada a su forma activa solamente en células infectadas, debe ser excretada sin ser metabolizada o sin generar metabolitos tóxicos, y tener baja frecuencia de administración. Por último, la droga debe tener bajo costo para que pueda estar disponible para toda la población. Todas estas características, entre otras, dificultan el descubrimiento de nuevas drogas efectivas para el tratamiento de las enfermedades virales Aplicaciones clínicas de los antivirales. En la práctica la utilización de antivirales es determinada por las características de la enfermedad. Las enfermedades para las cuales no hay una vacuna disponible, incluyendo las enfermedades causadas por varios agentes etiológicos, son las que tienen prioridad en el desarrollo de drogas antivirales. También es importante encontrar drogas para el tratamiento de las reactivaciones de infecciones latentes, tales como el herpes simplex y zoster (a pesar de que de esta forma el virus no puede ser eliminado). Tampoco se deben olvidar aquellas enfermedades mortales, como la fiebre hemorrágica argentina y la rabia, para las cuales la existencia de una droga antiviral puede significar salvar vidas Antivirales de uso clínico. A continuación se describen brevemente algunas de las drogas utilizadas para la quimioterapia antiviral y sus principales mecanismos de acción. En la figura 1 se muestran sus estructuras Inhibidores de la ADN polimerasa viral. Muchos de los agentes antivirales utilizados en la terapéutica son análogos de nucleósidos, la mayoría de los cuales están dirigidos a los herpesvirus. Los primeros prototipos inhibían indiscriminadamente la síntesis de ADN viral y celular produciendo numerosos efectos adversos. En 1977, Elion et al, desarrollaron una prodroga que depende de una enzima viral para su activación, llamada acilguanosina (aciclovir). La acilguanosina (9-(2-hidroxietoximetil)guanina), más conocida como aciclovir, es un derivado de guanina con una cadena lateral acíclica [4]. Su ventaja respecto de los primeros derivados de nucleósidos es que se requiere de la enzima viral, timidin quinasa (TK) para fosforilar a la acilguanosina intracelularmente a acilguanosina monofosfato (AG-P). Luego, la AG-P necesita de una quinasa celular dependiente de GMP para ser activada completamente a acilguanosina trifosfato (AG-PPP). Este, inhibe a la ADN polimerasa viral competitivamente y es incorporada al ADN, causando la terminación de la cadena. Esto es porque el aciclovir carece del grupo hidroxilo en el extremo 3 que se requiere para la elongación de la cadena. Debido a que la prodroga requiere la activación de una enzima viral, el aciclovir no es tóxico para células no infectadas. 10

11 Los virus Herpes simplex 1 y 2 son muy susceptibles al aciclovir. También lo es el virus de la varicela zoster (VZV) a mayores concentraciones. Otros virus humanos, deficientes en TK, son susceptibles al aciclovir en forma limitada debido a la producción de la acilguanosina monofosfato por la quinasa celular dependiente de GMP. El aciclovir puede ser administrado por vía oral, por vía intravenosa o tópicamente como una crema acuosa. Se registraron mutantes resistentes al aciclovir in vivo y en cultivos celulares. Generalmente, la mutación se localiza en el gen codificante de la TK. Este mutante puede resultar deficiente en la producción de TK o puede tener modificada su especificidad por el sustrato, por lo que no puede fosforilar al aciclovir. Menos frecuentemente, se encuentra una mutación en el gen que codifica para la ADN polimersa. Cabe resaltar que estos mutantes resistentes no son encontrados en pacientes con inmunidad normal. Por el contrario, en pacientes transplantados es fácil encontrar cepas resistentes [5]. Algunos derivados del aciclovir tienen mayor actividad contra HSV y VZV. Por ejemplo, el Valaciclovir, tiene mayor absorción oral. El ganciclovir (9-(1,3-dihidroxi-2-propoxi)metilguanina) es un derivado del aciclovir y es la primera droga en ofrecer un tratamiento satisfactorio para la infección con citomegalovirus (CMV). El mecanismo de acción del ganciclovir es similar al del aciclovir, excepto que no produce terminación de cadena. Esta droga es principalmente utilizada para tratar infecciones severas por CMV tales como retinitis, colitis y neumonía en pacientes con SIDA y en pacientes transplantados. La droga se administra por vía intravenosa durante varias semanas, pero la enfermedad es recurrente con el retiro de la droga. Dada la alta toxicidad de la droga la droga se administra sólo en casos severos de individuos inmunocomprometidos. La ribavirina (1-b-D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-3-carboxamida, virazol) es un análogo de guanosina. No tiene licencia para uso general por su alta toxicidad. La droga, de amplio espectro antiviral contra virus ARN y ADN parecería tener un mecanismo de acción múltiple. La ribavirina inhibe a la enzima celular IMP deshidrogenasa y a la guanililtrasnferasa, sugiriendo una posible acción en caminos celulares críticos para el virus. Por ejemplo, inhibiendo la síntesis de ARN viral, induciendo la formación del CAP en el extremo 5 del ARN e interfiriendo en la elongación del ARN. La administración oral e intravenosa de ribavirina reduce considerablemente la mortalidad por virus Lassa y Hantaan y tiene actividad contra los virus sincicial respiratorio, influenza A y B y HIV in vitro. El foscarnet (fosfonoformato trisódico), un análogo de pirofosfato, inhibe a la ADN polimerasa de herpesvirus [6] y hepatitis B y a la transcriptasa reversa de HIV, bloqueando el sitio de unión de la enzima. La administración de foscarnet por vía tópica acelera la cura de las lesiones provocadas por herpes facial y genital recurrentes y por vía sistémica disminuye la progresión de la infección por citomegalovirus en pacientes inmunocomprometidos. A pesar de la selectividad del foscarnet para inhibir la ADN polimerasa celular y viral a altas y bajas concentraciones respectivamente, el compuesto tiende a la acumulación provocando toxicidad en los riñones. Por eso, esta droga sólo se administra en aquellos casos donde esta en juego la vida del paciente. La resistencia al foscarnet es debida a mutaciones en el gen de la ADN polimerasa viral. La idoxiuridina (5-yodo-2 -deoxiuridina, IDU) y la trifluridina (5-trifluoro-2 deoxitmidina, TFF) poseen una alta toxicidad (posee efectos mielosupresivos, mutagénicos y teratogénicos tras su administración sistémica) por lo que su uso está limitado al tratamiento por vía tópica. La trifluridina se utiliza en forma de gotas para tratar la queratitis herpética, mientras que la idoxiuridina se utiliza para tratar lesiones en la piel. Ambas drogas son inhibidoras de la timidilato sintetesa viral, reduciendo la síntesis de novo de dttp. La vidarabina (arabinosido de adenina, Vira-A) es un nucleósido de purina y fue el primer compuesto antiviral que se usó sistemicamente. Marcó un cambio en el tratamiento de la encefalitis herpética y el herpes neonatal, reduciendo la mortalidad y las secuelas neurológicas. Esta droga también se puede utilizar para el tratamiento de la queratitis herpética. Debido a la escasa hidrosolubilidad, la droga debe administrarse en grandes volúmenes por vía endovenosa provocando serios efectos adversos (temblor, ataxia, náuseas, vómitos y diarrea). La vidarabina es fosforilada por quinasas celulares a la forma trifosfato inhibiendo a la ADN polimerasa viral. A pesar de que no se registraron mutantes resistentes en la clínica, en la actualidad, esta droga fue reemplazada por el aciclovir, que posee mayor eficacia Inhibidores de la transcriptasa reversa. El primer compuesto aprobado para uso humano contra el HIV con suficiente actividad antiviral in vivo fue el AZT (3 -azido-2,3 -dideoxitimidina o zidovudina). El AZT, luego de ser fosforilado a su forma trifosfato, inhibe a la transcriptasa reversa de HIV por incorporación a la cadena creciente de ADN provocando su terminación. Además, el AZT monofosfato, compite por la TK, disminuyendo el pool intracelular de TTP. Debido a la persistencia indefinida del virus en las células, con esta droga sólo se suprime la replicación viral pero no se elimina el virus del organismo. 11

12 La gran cantidad de efectos adversos (dolor de cabeza, náuseas, insomnio, anemia y neutropenia, entre otros) puede conducir a la suspensión del tratamiento, reducción de las dosis o a la utilización de terapias combinadas con otro análogo de nucleósido, interferón u otros como inhibidores de proteasas. Los primeros ensayos clínicos en 1986 dieron fuertes evidencias de mayor supervivencia y menor incidencia de enfermedades oportunistas en pacientes a los cuales se les había administrado la droga, así como también se produjo la recuperación de las células T helpers y reducción de los niveles de antigeno de HIV en sangre [4]. Se aislaron cepas resistentes con mutaciones en el gen que codifica para la transcriptasa reversa. Otros dideoxinucleósidos, tales como la dideoxicitidina y la dideoxiinosina no muestran resistencia cruzada con el AZT, por lo que terapias combinadas ayudarían a disminuir la aparición de mutantes resistentes. Algunos inhibidores de la transcriptasa reversa no nucleosídicos disponibles son la nevirapina (Viramune ), efavirenz (Sustiva ) y delavirdina (Rescriptor ). Algunos de los nucleosídicos son: lamivudine or 3TC (Epivir ), stavudine o d4t (Zerit ), abacavir (Ziagen ), zalcitabine or ddc (Hivid ), didanosine or ddi (Videx ) y zidovudine or AZT or ZDV (Retrovir ). Fig. 1. Compuestos antivirales. Estructura de algunos de los compuestos antivirales usados en clínica. 12

13 Bloqueantes de los canales iónicos. La amatadina (1-amadantanamina) inhibe la replicación del virus de la influenza A [4]. El blanco principal de esta droga es la proteína M2, que es un componente de la envoltura viral, que se supone es la encargada de estabilizar la hemaglutinina viral. Esta proteína forma un canal iónico transmembrana que sirve para reducir el gradiente de ph en endosomas acidicos. Y estos endosomas están involucrados en el desnudamiento de los viriones y en el transporte de nueva hemaglutinina hacia la membrana plasmática. La amantadina, aumenta el ph del endosoma, evitando que se produzca el cambio conformacional en la hemaglutinina requerida para la fusión de la envoltura viral con la membrana del endosoma para liberar ribonucleoproteínas del virión. La amantadina también evita que la hemaglutinina adquiera su conformación correcta para ser incorporada en la envoltura de los viriones emergentes. La administración temprana de amantadina reduce la severidad de los síntomas en un 50%. Pero varios efectos adversos fueron registrados: falta de concentración, insomnio, ansiedad, mareos, etc. La rimantadina (a-metil-1-adamantano-metilamina hidrocloruro) posee menos efectos adversos que la amantadina y casi su misma eficacia, por lo que la rimantadina es la droga de elección. Este tipo de compuestos puede servir como prototipo para aquellos otros virus que también poseen proteínas hidrofóbicas transmembrana de bajo peso molecular, tales como vpu de HIV o LMP del virus Epstein-Barr Bloqueo de la adsorción y del desnudamiento del virión. La inhibición de las primeras etapas de la replicación viral pueden lograrse mediante el diseño de sustancias que imiten al receptor celular o al ligando viral [4]. Por ejemplo, la adsorción del HIV a su receptor (CD4) puede ser bloqueada por CD4 soluble o por un péptido sintético que corresponde al ligando de la glicoproteína viral de la envoltura gp120. El problema de estos imitadores de ligandos es que la saturación del receptor puede interferir con las funciones celulares. Otro ejemplo de esto es el uso de sialiloligosacáridos que imitan al receptor de la hemaglutinina viral bloqueando la adsorción de los viriones a la célula huésped. Esto es en el caso de los virus influenza para los cuales se conoce la estructura tridimensional de las glicoproteínas de la envoltura Inhibidores de la proteasa viral. Las proteasas, codificadas por los virus, cumplen la función de clivar proteínas para activación de enzimas, fusión de glicoproteínas de envoltura, maduración de viriones, etc. Algunos de los compuestos utilizados en clínica que inhiben a dichas proteasas son [2]: indinavir (Crixivan ), saquinavir (Invirase ), nelfinavir (Viracept ) y amprenavir (Agenerase ) Oligonucleótidos específicos. En la teoría, pequeños oligodeoxinucleótidos sintéticos complementarios con la secuencia del ARN viral deberían inhibir la expresión de los genes virales [4]. Cortas secuencias de ADN de una sola hebra demostraron actividad antiviral contra HIV, HSV e influenza virus en cultivos celulares. Pero en la práctica, aún se describen problemas de estabilidad y especificidad de los oligodeoxinucleótidos Inhibidores de proteínas reguladoras. La función principal de las genes reguladores es controlar la expresión de otros genes. Por ejemplo, el producto protéico del gen tat de HIV se une específicamente a un elemento llamado TAR presente en el cdna integrado de HIV y en todos los ARNm del mismo virus. Esto resulta en el aumento de la expresión de los genes de HIV, incluyendo al tat, produciendo un feedback positivo que permite la producción de un número mayor de viriones. Un compuesto que se pueda unir a la proteína tat o a la secuencia nucleotídica TAR podría resultar un efectivo inhibidor de la replicación del HIV [4] Interferón. Los interferones, descubiertos en 1957 por Isaacs y Lindemman [7], son productos celulares naturales de la infección viral y tienen amplio espectro contra todos los virus. Los primeros ensayos clínicos se realizaron con cantidades inadecuadas de interferones sempirurificados que habían sido producidos por tratamiento de fibroblastos humanos con un paramixovirus. Sin embargo, en 1980 se clonó el gen para un interferón humano y se expresó en Escherichia coli. Desde entonces, las cantidades obtenidas de interferones son mayores y su costo es mucho menor. Los interferones no son administrables por vía oral, por lo que se requiere su administración por vía intramuscular. Se observan efectos adversos tóxicos tales como fiebre, fatiga, mialgia, náuseas, vómitos, pérdida de peso, alopecia, sequedad bucal, neuropatía sensorial periférica reversible, mielosupresión y función hepática anormal en altas concentraciones durante períodos prolongados. 13

14 El tratamiento con interferón para hepatitis C resulta exitoso en el tratamiento a largo plazo pero la enfermedad reincide con el retiro de la droga. También se registraron casos en los cuales el tratamiento con interferón produjo una regresión en ciertos tipos de cáncer [4]. Por lo tanto, se espera que en un futuro no muy lejano se administren combinaciones de interferón con drogas antivirales y con drogas anticancerígenas Limitaciones de la quimioterapia antiviral. El mayor problema de las drogas antivirales es la presencia de efectos tóxicos. Pero también existen otros inconvenientes. Por ejemplo, cuanto más selectiva sea una droga, más reducido es su espectro de acción. Además, la quimioterapia antiviral es imposible de llevar a cabo en el estado latente de un virus, por lo que este tipo de infecciones son, hasta el momento, imposibles de erradicar. Es importante detectar rápidamente la enfermedad para poder iniciar un tratamiento sin demoras y evitar mayores daños. Por último, existe el problema del surgimiento de mutantes resistentes, lo que impulsa la búsqueda de nuevos compuestos Mutantes resistentes. Está evidenciado el surgimiento de mutantes resistentes para todos los compuestos con actividad antiviral específica [8]. Las cepas mutantes resistentes surgen tanto in vitro como in vivo durante el tratamiento antiviral, especialmente en las terapias de larga duración y en pacientes inmunocomprometidos. Generalmente, la resistencia es el resultado de una mutación en el gen que codifica para la proteína blanco de la droga. La sensibilidad de una droga puede ser analizada por crecimiento de una cepa en un cultivo celular en presencia de diluciones seriadas del compuesto. La indicación de resistencia a la droga a través de este ensayo durante su desarrollo es un hecho que puede frenar la fase clínica de investigación. La emergencia de mutantes resistentes se diferencia entre los distintos grupos de virus. Para determinar de la resistencia se debe analizar la frecuencia de mutación, el estado de bienestar del virus y la potencia de la droga. Las cepas mutantes existen aún antes de empezar el tratamiento, sólo que dicho tratamiento alienta el dominio de las cepas mutantes sobre la población viral. Dado que la ARN polimerasa carece de prueba de lectura, los virus ARN tienen mayor frecuencia de mutación que los virus ADN. A esto se le puede adicionar el hecho de administrar drogas inmunosupresivas, que pueden incrementar el riesgo de resistencia como resultado de una mayor replicación. Una droga poco potente permite la replicación viral con un lento desarrollo de resistencia. Mientras que una droga más potente va a inducir resistencia más rápidamente, a menos que se inhiba la replicación completamente [8]. Los procedimientos a seguir tras el surgimiento de resistencias está determinado por la evolución y tipo de enfermedad, el estado físico del paciente y la droga administrada, entre otras cosas. Pero generalmente suelen aumentarse las dosis orales en primera instancia para luego pasar a la administración intravenosa del medicamento, cambio de la droga o combinación de terapias [9]. 2- Virus VIRUS NO ENVUELTOS. 14 Arenaviridae Rhabdoviridae Herpesviridae. Su genoma consiste en Su genoma consiste en Su genoma consiste ARN simple cadena ARN simple cadena ADN doble cadena. Paramixoviridae Su genoma consiste en ARN simple cadena.

15 VIRUS NO ENVUELTOS. Picronaviridae. Su genoma consiste en ARN simple cadena. Fig 2. Composición genómica de los virus utilizados en este trabajo Virus Herpes Simplex: Características. El virus herpes simplex pertenece a la familia Herpesviridae, subfamilia Alphaherpesvirinae. Esta familia incluye numerosos virus patógenos para el hombre como el herpes simplex tipo 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2), el herpesvirus B, el virus varicela-zoster (VZV), el citomegalovirus (subfamilia betaherpesvirinae) y el virus Epstein-Barr (subfamilia Gammaherpesvirinae) [10]. Existen dos tipos virales dentro del género herpes simplex: HSV-1 y HSV-2. El HSV-1 está asociado con las lesiones orales y oculares y se transmite a través de secreciones orales y respiratorias. En cambio, el HSV-2 está asociado a lesiones genitales y anales y su transmisión es fundamentalmente sexual. La infección inicial del virus se produce a través de una mucosa erosionada (labios, boca, ojo, genitales) o de la piel, donde comienza la multiplicación. Luego, el virus difunde a los ganglios linfáticos donde se produce la multiplicación secundaria. La latencia viral explica las recurrencias de las lesiones, que en este caso está asociada a las neuronas de los ganglios trigémino en la zona facial y sacra en la zona genital. Dado que el virus alcanza otras células epiteliales por diseminación célula-célula (es decir, por fusión de membranas de dos células contiguas), este no contacta el medio extracelular evitando encontrarse con los anticuerpos. Pero el hecho de que hayan anticuerpos evitan la diseminación viral por lo que las reincidencias de las lesiones se llevan a cabo en el lugar de la infección original [10]. Las recurrencias están asociadas a factores físicos (lesiones cortantes, irradiación solar) y factores emocionales (disgustos, stress). La reincidencia suele ser de evolución más corta y sintomatología moderada con completa regeneración del epitelio Estructura del virión. El virión es esférico y envuelto de aproximadamente 150nm de diámetro. Contiene una cápside icosaédrica con 162 capsómeros, rodeados por un tegumento amorfo. Dentro de la cápside se encuentra un core electrodenso que contiene el genoma viral constituido por ADN lineal doble cadena (codifica para más de 70 proteínas en la célula infectada). El genoma de HSV que comprende aproximadamente 150 Kpb está compuesto por dos secuencias L (larga) y S (corta). La envoltura presenta espículas en su superficie Ciclo de multiplicación viral. La glicoproteína de la envoltura gc se une a los residuos heparan sulfato que se encuentran en la superficie celular. La glicoproteína gd es también una mediadora de la unión a receptores celulares promoviendo la penetración viral por fusión ph dependiente de la envoltura viral con la membrana plasmática, proceso en el que, además, estarían involucradas las glicoproteínas gb y gh. Proteínas del tegumento son liberadas. Una de ellas suprime la síntesis de proteínas celular, y la cápside es transportada a un poro nuclear donde el ADN viral es liberado y se circulariza. Otra proteína que se libera 15

16 al tegumento activa la transcripción de los 5 genes a. Esta proteína viral se asocia a dos proteínas celulares para formar un complejo multiprotéico que reconoce la secuencia en la región promotora del ADN viral disparando la transcripción mediante la polimerasa celular. Los a ARNm son transportados al citoplasma donde son traducidos a proteínas regulatorias de la expresión de los genes tardíos. Una proteína a inicia la transcripción de los genes b, que codifican para enzimas requeridas para incrementar el pool de nucleótidos y otras necesarias para la replicación viral. El genoma viral se replica por un mecanismo circular. Siguiendo el ciclo de replicación, algunas proteínas b inducen la transcripción de los genes g, que al ser traducidos se generan proteínas requeridas para la formación del virión. El ensamblaje de proteínas de la cápside forman una cápside vacía en donde luego se empaqueta el ADN viral [11]. La adquisición de la envoltura se puede explicar de dos formas. La cápside dejaría el núcleo recubierta con la membrana nuclear interna y el virus sería transportado a golgi para maduración de proteínas y posterior liberación por exocitosis. O el virus perdería la envoltura de la membrana nuclear al fusionarse con el retículo endoplasmico y adquiriría una nueva envoltura de la membrana de golgi donde estarían insertas las glicoproteinas virales maduras. Finalmente, serían liberadas por exocitosis Epidemiología. El huésped natural del HSV es el hombre. La prevalencia de la infección por virus herpes simplex es aproximadamente del 100% en la edad adulta. Es importante resaltar que existe liberación de virus infeccioso en mucosas y/o epitelios que no evidencian lesión alguna. De esta forma el virus se transmite entre personas aparentemente sanas Sintomatología y tratamiento. Se desarrolla cierta picazón y ardor antes de la reincidencia del HSV en la zona donde se produjo la infección inicial y donde luego aparecen las lesiones vesiculares con alto contenido vírico, úlceras y costras. Las lesiones varían su gravedad de acuerdo al lugar de la infección: mucosa oral-respiratoria, mucosa genital, queratoconjuntivitis y encefalitis. El aciclovir es el tratamiento de elección para esta viremia. Su mecanismo de acción ya fue descripto en otra sección anterior. Desafortunadamente, todavía no existe ninguna vacuna aprobada para su utilización. Pero se encuentran en fases de desarrollo vacunas basadas en glicoproteínas de la envoltura Virus de la poliomielitis Características: El virus de la poliomielitis (PV) pertenece al género Enterovirus que a su vez está clasificado dentro de la familia Picornaviridae (que incluye también Rhinovirus y Hepatovirus). Presenta tres serotipos: poliovirus 1, 2 y 3. Estos virus se multiplican en el tracto intestinal donde el ph ácido les resulta óptimo. La poliomielitis o parálisis infantil es una infección aguda viral y el curso de la misma puede evolucionar de diversas formas: asintomático, abortiva y enfermedad paralítica [12]. El virus se transmite por vía oral, aérea y fecal de un humano infectado durante el final del período de incubación, todo el período de invasión, de estado y de convalecencia. El virus llega al organismo por la mucosa orofaríngea, siendo la replicación de mayor intensidad en las amígdalas y placas de peyer del ileon. De allí, pasan a los ganglios linfáticos cervicales y mesentéricos alcanzando la circulación sistémica provocando una viremia transitoria o viremia menor. Al alcanzar otros tejidos se produce la viremia secundaria y es cuando comienzan las manifestaciones clínicas Estructura del virión: El virus de la poliomielitis posee una cápside proteica desnuda de estructura icosaédrica y diámetro de aproximadamente 25nm, formada por 32 capsómeros. Contiene 4 proteínas estructurales con 60 copias de cada una en el virión. El genoma consta de una molécula de ARN monocatenario de polaridad positiva de 7,2 a 8,4 Kpb Ciclo de multiplicación viral: El receptor celular para los poliovirus es un miembro de la familia de inmunoglobulinas. Luego de la adsorción, penetración y desnudamiento sucede la replicación del ARN. Esta comprende la síntesis de un ARN complementario que sirve como templado para la síntesis de ARN genómico, que a su vez sirve como ARNm y se traduce a un gran polipéptido que incluye a todas las proteínas virales. Este polipéptido se cliva 16

17 autocataliticamente a los intermediarios P1, P2 y P3. P1 es, a su vez, clivada para dar VP0, VP1 y VP3 y finalmente las cuatro proteínas estructurales VP1, VP2, VP3 y VP4. La región P2 codifica para dos proteínas no estructurales y P3 para proteínas requeridas para la replicación. La terminación de la traducción se produce gracias a una proteasa que inactiva al complejo que es necesario para unir ARNm a los ribosomas. La replicación y el ensamblaje ocurre en el citoplasma y el nuevo virión se libera por lisis celular Epidemiología: El reservorio de la enfermedad es el humano exclusivamente. Se presenta una prevalencia estacional para los meses de temperaturas cálidas en climas templados. La letalidad es de entre el 2 y el 20% para la enfermedad paralítica. El serotipo 1 es el agente causante de poliomielitis más frecuente en la actualidad. El tipo 2 es el serotipo más controlado mediante vacunación por lo que su presencia en la población es un indicador de la falta de eficiencia en los planes de inmunización Sintomatología y tratamiento: La enfermedad consta de un período de incubación de 3 a 6 días, un período de estado con sus respectivas complicaciones tales como insuficiencia respiratoria, hipertensión arterial, úlceras y atrofia muscular progresiva entre otras y un último período de convalecencia. La poliomielitis no tiene un tratamiento específico por lo que es de suma importancia tomar medidas de prevención. La vacuna a virus inactivado o Salk, de administración intramuscular, se utiliza desde 1955 (actualmente, sólo para embarazadas y personas inmunocomprometidas). La vacuna oral trivalente con virus atenuado se administra desde 1964 a los 2, 4 y 6 meses de edad y se refuerzan las dosis a los 18 meses y 6 años de edad. Esta vacuna está incluida en el Programa Ampliado de Inmunizaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y en el Calendario Nacional Virus del Sarampión Características. El virus del sarampión (SARV) pertenece a la familia de los Paramixoviridae, que a su vez está dividida en dos subfamilias: Paramixovirinae y Peumovirinae. La subfamilia Paramixovirinae esta formada por dos géneros: Paramixovirus y Morbillivirus. Dentro de este último género se encuentra el virus del Sarampión, que tiene un solo tipo antigénico. El sarampión es una enfermedad infecciosa aguda muy contagiosa predominante en los niños. Cursa con rinitis, conjuntivitis, bronquitis, exantema característico y exantema eritematomaculo-papular morbiliforme generalizado. El reservorio del virus es humano exclusivamente y dicho virus es transmisible durante el último período de incubación, el período de invasión y los primeros días de estado por vía aérea y contacto directo. El virus penetra en el hombre por la mucosa respiratoria y/o conjuntival y se multiplica a nivel epitelial. La infección se extiende a los ganglios linfáticos donde continúa su replicación y constituye la viremia primaria, durante el cual el virus se disemina en los leucocitos y alcanza el sistema reticuloendotelial. La necrosis de las células reticuloendoteliales provoca reinvasión a leucocitos produciendo la viremia secundaria. El exantema se presenta junto con los anticuerpos específicos. Una característica de las lesiones son las células multinucleadas que se forman por acción de la proteína fusionante [13] Estructura del virión. El sarampión es un virus esférico, pleomórfico de un diámetro entre 120 y 170 nm. El ácido nucléico consiste en un ARN monocatenario de sentido negativo no segmentado. La nucleocápside es una ribonucleoproteína que presenta simetría helicoidal y 18nm de diámetro. Está constituida por tres proteínas estructurales, de las cuales una es la ARN polimerasa. La envoltura es una bicapa lipídica derivada de la célula huésped. En la envoltura se encuentran espículas de 10 nm constituidas por dos glicoproteínas transmembrana. Algunas de estas espículas presentan actividad de hemaglutinina. Otro grupo de espículas está formado por la proteína fusionante de membrana Ciclo de multiplicación viral. La adsorción del virus a la superficie celular se debe a la función hemaglutinina de una espícula de envoltura. La penetración se produce por fusión mediada por la glicoproteína F de membrana. La transcripción se produce en el citoplasma utilizando la ARN polimerasa viral. El genoma se transcribe a ARN positivo y este se comporta como ARNm, que luego se traduce a proteínas especificas. Hay varios ARNm que luego se traducen. La nucleocápside helicoidal se ensambla y el virus se libera por gemación. 17

18 Epidemiología. El sarampión es una enfermedad prevenible por vacunación. La prevalencia de la enfermedad es durante los meses de temperaturas más bajas. La mayor incidencia se registra entre los 0 y 9 años de edad aunque cualquier grupo de edad es susceptible a la infección a menos que haya sido vacunado o ya haya contraído la enfermedad Sintomatología y tratamiento. El período de incubación dura aproximadamente 10 días y el de invasión 3. Este último período comienza bruscamente con alta temperatura, y triple catarro (conjuntival, nasal, faringolaringotraqueobronquial). Al final de este período se observan manchas de Koplik, que contienen antígenos y nucleocápsides virales. El período de estado dura aproximadamente 6 días y se inicia con la aparición del exantema y pico febril. Algunas de las complicaciones pueden ser neumonía, diarrea, meningoencefalitis y otras. El período de convalecencia dura entre 2 y 4 semanas. El sarampión no tiene tratamiento especifico. En las formas no complicadas el tratamientos es higiénicodietético y sintomático. La vacuna antisarampionosa está preparada con virus atenuado cultivado en células de embrión de pollo y se administra por vía subcutánea o intramuscular. Esta vacuna esta incluida en el Programa Ampliado de Inmunizaciones de la OMS y en el Calendario Nacional y se aplica a los 12 meses de edad Virus de la estomatitis vesicular (VSV) Características. El virus de la estomatitis vesicular pertenece al género Vesiculovirus, dentro de la familia Rhabdoviridae. Esta familia también comprende al género Lyssavirus, dentro del cual se encuentra el virus de la rabia. El VSV es zoonótico y se puede transmitir al hombre a partir de fluidos vesiculares y tejidos infectados de animales, pero no hay medidas aplicadas para evitar la infección [14] Estructura del virión. Los virus de esta familia miden aproximadamente 70 nm de ancho y 170 nm de largo y consisten en una envoltura lipídica con glicoproteínas insertas alrededor de una nucleocápside helicoidal que le confiere a los virus una forma de bala característica. El ácido nucléico es una ARN de cadena simple, de polaridad negativa, de aproximadamente 11-12kb Ciclo de multiplicación viral. Los viriones se unen a receptores celulares vía la glicoproteína G, entra la célula por endocitosis y se desnudan, liberando la nucleocápside al citoplasma. La transcripción comprende 5 ARNm monocistrónicos: N (nucleoproteína), P (proteínas no estructurales), M (proteínas de la matriz), G (glicoproteínas) y L (ARN polimerasa). Ambas cadenas de polaridad opuesta se unen a nucleoproteínas pero sólo la de polaridad negativa se asocia con M para disparar la salida de los viriones a través de las zonas de la membrana plasmática que posee la glicoproteína G. La replicación del VSV causa una citopatologia rápida, posiblemente debido a la inhibición de la transcripción del ARNm celular por la proteína M Epidemiología. Los reservorios son los animales como ganado y caballos pero es transmisible al hombre. Los casos reportados en el hombre son debido a descuidos durante brotes en el ganado Sintomatología y tratamiento. La enfermedad en humanos es semejante a la influenza, presentando fiebre, escalofríos y dolor muscular. La enfermedad se resuelve sin complicaciones a los 7 o 10 días. No hay medidas de prevención desarrolladas para los humanos. El tratamiento es exclusivamente sintomatológico Arenavirus Características. La familia Arenaviridae se divide en dos grupos: Arenavirus del Viejo Mundo, que incluye a los virus de la coriomeningitis linfocitaria (LCM), virus Lassa, Mopeia, Mobala, etc, aislados en el continente africano y los Arenavirus del Nuevo Mundo o complejo Tacaribe que incluye a los virus Junín (VJ), Tacaribe (TAC), Machu- 18

19 po, Pichindé, Guanarito, etc, aislados en el continente americano [15]. La fiebre hemorrágica argentina (FHA), producida por el virus Junín, es una enfermedad endémica del área central de la Pampa Húmeda. Causa infección persistente en roedores con eliminación del virus en orina [16]. Para que el hombre se infecte debe estar en íntimo contacto con el roedor. El huésped natural del virus Junín son los roedores Calomys musculinus y C. Laucha pero otros roedores también pueden infectarse. La patología está delimitada al sistema circulatorio produciendo hemorragias, trombocitopenia, leucopenia, hemoconcentración, proteinuria, hipotensión y a veces muerte por shock hipovolémico. El virus Tacaribe es el único arenavirus que fue aislado de murciélagos (Artibeus sp.). Este virus no es patógeno para el hombre Estructura del virión (de arenavirus) Las partículas virales son redondeadas, ovales o pleomórficas, con un diámetro de nm. El «core» exhibe una zona clara conteniendo un número variable de gránulos semejantes a ribosomas. La envoltura, cubierta por espículas, se forma de la membrana plasmática celular. El genoma viral comprende dos segmentos de ARN lineales de 8,2 (L) y 3,4 (S) Kb respectivamente, cada uno de los cuales forman un círculo por uniones puente de hidrógeno en sus puntas. La mayor parte del genoma es de polaridad negativa pero la mitad 5 del segmento S y una pequeña secuencia en el 5 del L tienen polaridad positiva. El segmento S codifica para las proteínas estructurales nucleoproteína N y glicoproteína precursora de glicoproteinas G1 y G2, que conforman las espículas de la envoltura Ciclo de multiplicación viral Luego de la entrada del virión a la célula y su desnudamiento, el ARNm que codifica para la nucleoproteína N es transcripto por la transcriptasa viral desde el extremo 3 negativo del segmento S. Lo mismo ocurre con el segmento L. La traducción de las proteínas N (nucleoproteína) y L (polimerasa) se requieren antes de la replicación viral, que a su vez requiere la síntesis de copias complementarias completas de ambos segmentos. Recién después, se pueden transcribir la proteína G y la proteína Z (que une zinc) del otro extremo de los segmentos S y L, respectivamente. Luego de la glicosilación y clivaje de la proteína G, los viriones brotan a través de la membrana plasmática [17] Epidemiología. El virus penetra a través de lesiones en la piel o por inhalación. La FHA es una enfermedad ocupacional, que afecta a adultos dedicados a la cosecha del maíz. Por lo tanto, es una enfermedad estacional, prevaleciendo en los meses de Abril, Mayo y Junio, durante la época de cosecha. La mortalidad por infección con el virus Junín, sin tratamiento específico es en promedio un 13% Sintomatología y tratamiento. La infección del hombre con un arenavirus puede producir desde síntomas parecidos a los de la influenza hasta fiebre hemorrágica, pasando por meningitis. Algunos de los síntomas incluyen: algias, mareos, constipación, dolor retro-ocular, náuseas, insomnio, vómitos, tos, dolor de garganta y fotofobia. Y entre los signos se encuentran: adenopatías axilares o inguinales, petequias, halo congestivo en encías, hipotensión arterial, halitosis, adenopatías cervicales y encías sangrantes a la presión. El período de incubación dura entre 1 y 2 semanas y es cuando la replicación viral ocurre en diversos órganos. La fiebre hemorrágica causada por estos tipos de virus parece producirse porque la coagulación intravascular diseminada no se produce hasta la fase terminal de la enfermedad. En la infección con virus Junín, es prominente el sangrado con trombocitopenia severa. La prevención de la FHA se basa en el control de los roedores, aunque esta tarea se dificulta en zonas rurales. El curso de la enfermedad es modificable por administración de plasma de convaleciente dentro de la primera semana de la enfermedad. La ribavirina es la única droga de amplio espectro antiviral que se ensayó contra el virus Junín en animales y humanos [18]. A pesar de resultar eficaz, el compuesto no está en uso por su alta toxicidad. Actualmente, en nuestro país, está aprobada una vacuna a virus vivo atenuado llamada Candid 1, que presenta mutaciones en el extremo amino terminal del precursor de las glicoproteínas (GPC), región correspondiente a la glicoproteína madura G1, una vez clivado el receptor. Esta vacuna demostró ser altamente eficaz [19]. 19

20 3- Microcina J25 y Fragarina Compuestos antivirales de origen natural. Debido a la creciente demanda de compuestos antivirales, ya sea por la necesidad de curar pandemias como el SIDA o por el surgimiento de resistencias, la comunidad científica internacional está centrando su atención en compuestos de origen natural. Está demostrado que en el mundo vegetal y animal existen compuestos con gran potencial como antimicrobianos [20]. Muchos de ellos aún no pudieron ser aislados ni muchos otros identificados. Por ejemplo, los brasinosteroides son un grupo nuevo de esteroides aislados de plantas, en donde cumplen una función esencial para el normal crecimiento y desarrollo de las mismas. Este grupo de compuestos contiene un esqueleto en común: el 5-a-colestano. Los análogos obtenidos por variaciones de los grupos funcionales y su respectiva esteroquímica, mostraron una alta actividad antiviral contra el virus del sarampión [21] así como contra HSV-1, VJ, TAC y Pichindé [22]. También son alentadores los resultados contra HSV-2 [23]. Para los arenavirus, los índices de selectividad (razón entre concentración citotóxica cincuenta y concentración efectiva cincuenta) obtenidos fueron entre 10 y 18 veces más altos que el de la ribavirina para VJ. Cabe destacar que las modificaciones de los grupos funcionales también mostraron variaciones en la citotoxicidad [24]. Otro ejemplo de la gran variedad de compuestos presentes en la naturaleza es el de los galactanos sulfatados obtenidos de algas rojas Gymnogongrus griffithsiae y Cryptonemia crenulata. Estos compuestos también demostraron tener una alta actividad antiviral contra varias cepas de HSV-1, HSV-2 y virus dengue tipo 2 (DEN-2) [25]. El hombre, como parte del ecosistema, también posee en sus defensas compuestos con una alta actividad antimicrobiana. Varios investigadores reportaron la presencia de actividad inhibitoria contra varios virus en fluidos y tejidos corporales [26]. Aún muchos de estos compuestos no han sido identificados. Por ejemplo, en la saliva se encontraron desde peroxidasas hasta péptidos antimicrobianos como las defensinas y lactoferrinas. Se sugiere la posible existencia de un inhibidor aún no descubierto en saliva ya que los compuestos identificados no inhiben al HIV lo suficientemente bien como para explicar la no transmisión del HIV a través de este fluido. [26, 27, 28]. La mayoría de los organismos multicelulares poseen péptidos antibióticos en su sistema inmune. [29]. Los péptidos maduros de humanos (LL-37) y de ratones (CRAMP) son codificados por genes similares (CAMP and Cnlp) y tienen estructuras -helicoidales similares [30]. A pesar de las divergencias en sus secuencias y taxonomía, la mayoría de estos antibióticos comparten un mismo mecanismo de acción. Por todo esto, podría resultar de gran utilidad estudiar más profundamente esta clase de péptidos Péptidos antimicrobianos: Clasificación. Los péptidos antimicrobianos, ampliamente estudiados en la actualidad, pueden ser agrupados en dos grandes grupos [31]: v Péptidos de síntesis no ribosomal: Este tipo de péptidos son producidos por bacterias y hongos. Generalmente, presentan aminoácidos modificados y son el resultado de la acción de complejos multienzimáticos constituídos por sintetasas que catalizan la formación de las cadenas peptídicas sin participación de los ribosomas. Las polimixinas, bacitracina y gramicidina S son algunos de los péptidos incluidos en este grupo. Se demostró que la ciclosporina A, péptido producido por el hongo Tolyplocadium inflatum posee actividad inhibitoria contra HSV-1, HSV-2, VSV, HIV, citomegalovirus murino y vaccinia [32]. v Péptidos de síntesis ribosomal: Este tipo de péptidos tienen en común el hecho de tener carga neta positiva por ser ricos en arginina o lisina (existen algunos péptidos derivados de bacterias débilmente cargados) y ser anfipáticos. De acuerdo a su estructura también pueden ser agrupados en péptidos de estructura beta estabilizada por puentes disulfuro (por ejemplo: defensinas producidas por mamíferos, insectos, plantas), péptidos de estructura -hélice (por ejemplo: cecropina, melitina, magainina, bomvinina) y péptidos de estructura extendida con predominio de uno o dos aminoácidos (por ejemplo: indolicindina y profenina). La falta de homología en las secuencias dificulta la predicción de la actividad de estos péptidos in vivo. Los péptidos antimicrobianos también pueden ser agrupados de acuerdo a su lugar de obtención: 20