Universidad Autónoma de Querétaro (2) Laboratorio de Biotecnología Molecular. Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A.C.

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1 RESUMEN COEXPRESIÓN DE LAS CHAPERONAS DNAK Y DNAJ Y VASOSTATINA RECOMBINANTE EN Escherichia coli. Aguilar González, M. (1) ; De León Rodríguez, A. (2) ; Vázquez Rodríguez, G. (2) (1) Facultad de Química Universidad Autónoma de Querétaro (2) Laboratorio de Biotecnología Molecular Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A.C. La Vasostatina es un péptido de 30 aminoácidos derivado del extremo amino terminal de la Calreticulina, actúa como un potente inhibidor de la angiogénesis suprimiendo el crecimiento tumoral y la progresión de la metástasis en cáncer. En este trabajo se realizó la Coexpresión de las chaperonas Dnak y DnaJ (DnaK/J) en la producción de la Vasostatina Recombinante en E. coli BL21-SI con el fin de evaluar si este sistema de chaperonas tiene efectos en la producción de Vasostatina. El sistema Dnak/J es caracterizado por asistir en el plegamiento de proteínas nacientes y replegamiento de proteínas mal plegadas que forman cuerpos de inclusión, los cuales limitan la óptima producción de las proteínas recombinantes. Se llevaron a cabo dos ensayos de expresión de la Vasostatina con y sin chaperonas a dos temperaturas distintas, 28 C Y 37 C. De acuerdo con los resultados obtenidos se observó que el sistema de chaperonas Dnak/J produjo un incremento en la producción de Vasostatina a 28 C de temperatura, y no se observó ningún efecto significativo en la producción de Vasostatina cuando se expresó a 37 C de temperatura. INTRODUCCIÓN La Angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes, y es esencial en muchos procesos fisiológicos como el desarrollo embrionario y la cicatrización de heridas, pero también es importante en la sobrevivencia y crecimiento tumoral. La inhibición de este proceso representa una alternativa para el tratamiento contra el cáncer, debido a que al inhibir la Angiogénesis en los tumores se limita el entorno que los rodea, impidiendo así que les lleguen nutrientes y oxigeno necesarios para sobrevivir y proliferar. Varios inhibidores angiogénicos han sido estudiados como la endostatina, la angiostatina, y la vasostatina. La vasostatina es un péptido de 30 aminoácidos derivado del extremo N- terminal de la Calreticulina, y tiene como funciones principales bloquear las acciones proliferativas de factores proangiogénicos de crecimiento como el VEGF y FGFb, suprime neovascularización in vivo y previene o reduce el crecimiento tumoral en modelos murinos (Li y Jiang, 2007). Debido a la importancia de esta proteína en el sector terapéutico se ha reportado la producción de Vasostatina Recombinante en E. coli y su mayor limitante ha sido la formación de cuerpos de inclusión (Sun y col, 2004). Una alternativa para disminuir la cantidad de estos agregados es el uso de Chaperonas Moleculares; estas son proteínas que regulan el correcto plegamiento y ensamblaje de otras proteínas, se unen a las mal plegadas o recién sintetizadas y las asisten hasta que alcanzan una conformación terciaria funcional. En este trabajo se evaluó a la chaperona DnaK y a su Cochaperona DnaJ pertenecientes a la familia de las chaperonas de Heat schock (Hsp70) dependientes de ATP que asisten en el plegamiento y replegamiento de proteínas nacientes y de proteínas desnaturalizadas por estrés, y en el ensamblaje y desensamblaje de complejos proteicos (Acebrón y col, 2010). 1

2 Estas Chaperonas Moleculares interactúan con las proteínas mal plegadas o no plegadas mediante los segmentos hidrofóbicos que estas exponen. Estructuralmente la chaperona Dnak consiste en un dominio N-Terminal ATPasa altamente conservado de 44 kda. La DnaK funciona en conjunto con su Cochaperona DnaJ que presenta un dominio altamente conservado de 80 aminoácidos llamado dominio J. El mecanismo de acción de las chaperonas es un ciclo que inicia con la asociación de DnaJ con el sustrato, seguido de la transferencia del sustrato a la Dnak-ATP debido a la hidrólisis del ATP estimulada por la DnaJ, la energía liberada es usada para acomodar el sustrato en la cavidad de Dnak, después se estimula la liberación del ADP del complejo Dnak- ADP-sustrato liberando el ADP, consecuentemente otra molécula de ATP se une a Dnak liberando el sustrato (Siegenthaler y col, 2006). EXPERIMETACIÓN Se obtuvo el plásmido plna2 que codifica para las chaperonas Dnak y DnaJ con resistencia a Cloramfenicol. Se prepararon células electrocompetentes E. coli BL21-SI que contenían el plásmido pgvr-vs con el fragmento que codifica para la Vasostatina y con resistencia a ampicilina. Posteriormente se transformó a las cepas BL21-SI pgvr-vs por electroporación. Las cepas transformantes que se obtuvieron fueron crecidas en medio LB sin sal con ampicilina y cloramfenicol como antibióticos de selección. Posteriormente se realizo una Miniprep y una restricción con la enzima BamHI para linearizar y asegurar la presencia de los dos plásmidos pgvr-vs y plna2 en las cepas transformadas. Se realizaron 4 ensayos de expresión, los primeros dos ensayos con la cepa E. coli BL21-SI transformada con el plásmido plna2 que codifica para las chaperonas Dnak y DnaJ, y el plásmido pgvr-vs que codifica para la Vasostatina, un ensayo a 28 C y el otro a 37 C de temperatura; los otros 2 ensayos de expresión se realizaron también con la cepa E. coli BL21-SI pero solamente transformada con el plásmido pgvr-vs a 28 C y 37 C. Se crecieron inóculos de las dos cepas en medio mínimo BSG, al llegar a una OD 600 nm de.5 se indujo la expresión de la Vasostatina y las Chaperonas con NaCl al 0.3 M e IPTG 0.5 M. Se tomaron muestras cada tres horas durante un periodo de doce horas y se almacenaron en refrigeración. Totas las muestras se centrifugaron a 6000 rpm 5, el pellet fue resuspendido en 1 ml de PBS y lisado por Sonicación a 21% de Amplitud. Se separaron las muestras en fracción total y fracción soluble. Se cuantifico la proteína por método de Lowry y las muestras fueron analizadas en geles de poliacrilamida Tris-Tricina. Posteriormente se tiñeron, escanearon y analizaron las bandas de los geles por Densitometría.. DISCUSIÓN DE RESULTADOS De acuerdo a los resultados obtenidos en la primera parte del proyecto se puede observar que efectivamente se obtuvieron colonias transformantes con el plásmido plna2 que codifica para las chaperonas Dnak y DnaJ. En la Figura 1 se muestra la miniprep de una colonia transformada de E. coli BL21-SI y en la Figura 2 se muestra la restricción de los dos plásmidos de las colonias transformadas el pgvr-vs ya anteriormente presente en las células competentes y el plásmido plna2 con el que se transformó a las células. Esto nos indica y asegura la presencia de los dos plásmidos necesarios para llevar a cabo los ensayos de expresión. 2

3 Concentración ng/ml A1 A2. Fig. 1. Miniprep de colonias transformadas E. coli BL21. Fig. 2. Restricción de los plásmido con BamHI. A1 es el plásmido plna2 y A2 es el plásmido pgvr- VS. Una vez confirmada la transformación de la cepa E. coli BL21-SI, se realizaron los ensayos de expresión a 2 temperaturas 28 C y 37 C. En la Grafica 1. se presentan la concentraciones de Vasostatina producidas en ng/ml de las muestras obtenidas a 28 C con y sin expresión de Chaperonas, en estos resultados se puede observar un incremento en la producción de Vasostatina cuando se coexpresó con las chaperonas Dnak y DnaJ a las seis y doce horas después de la inducción con NaCl e IPTG. Esto concuerda con los resultados mostrados en la Figura 3. donde se observa la diferencia de intensidad de las bandas de Vasostatina coexpresada con chaperonas en comparación con las bandas de Vasostatina expresada sin chaperonas Tiempo (h) 12 FS S/C FT S/C FS C/C FT C/C Gráfica 1. Incremento de la concentración de la Vasostatina en ng/ml a las 6 y 12 horas de inducción con NaCl e IPTG a 28 C. FS-Fracción Total, FT-Fracción Soluble, S/C-sin chaperonas, C/C-con chaperonas. Fig. 3. Efecto de las chaperonas Dnak/ J en la producción de Vasostatina a 28 C. En la Gráfica 2 se presenta la producción de Vasostatina en presencia de las chaperonas Dnak y DnaJ a una temperatura de 37 C, pero no se pudo comparar con la producción de la proteína en ausencia de las chaperonas ya que a 37 C fue casi nula la concentración de Vasostatina expresada. En la Figura 4 se puede observar que las bandas correspondientes a la Vasostatina no se distinguen con claridad en el gel de poliacrilamida con las muestras de los ensayos de expresión en presencia de las chaperonas y en el gel con las muestras de la expresión sin chaperonas no se observa nada. Lo cual nos indica que a 37 C no es una temperatura favorable para la expresión de la Vasostatina ni de las Chaperonas Moleculares Dnak y DnaJ, como también se observo en los trabajos realizados por Sun,Q y col. en

4 Concentración ng /ml FS C/C FT C/C 0 6 Tiempo (h) 12 Gráfica 2.Producción no significativa de Vasostatina Recombinante en ng/ml a las 6 y 12 horas de inducción con NaCl e IPTG a 37 C. FS-Fracción Total, FT-Fracción Soluble, C/C-con chaperonas. Fig4. Efecto de las chaperonas Dnak/ J en la producción de Vasostatina a 37 C. CONCLUSIONES El sistema de chaperonas Dnak/J incremento la producción de Vasostatina recombinante en E. coli BL21 al expresarse a una temperatura de 28 C, en cambio al expresarse a una temperatura de 37 C no hubo un incremento en la producción de la proteína, posiblemente debido a que a esa temperatura óptima para las chaperonas, las bacterias gastaron su energía para producirlas dejando de lado la producción de la Vasostatina Recombinante. Pero finalmente se observo que estas chaperonas moleculares si presentan un efecto en la producción de la proteína recombinante lo cual nos da pauta para realizar otros ensayos con otras chaperonas o con las Dnak/J pero probando diferentes condiciones para observar si se puede lograr un incremento muchos más significativo que el obtenido en este trabajo, por ejemplo probar diferentes tiempos de inducción de las chaperonas con IPTG o diferentes concentraciones del este inductor. REFERENCIAS BILBIOGRAFICAS Missiakas. D., The Escherichia coli Heat Shock Gene htpy: Mutational Analysis, Cloning, Sequencing, and Transcriptional Regulation. JOURNAL OF BAC1ERIOLOGY, May 1993, p Acébron. S., DnaJ Recruits DnaK to Protein Aggregates. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 3, pp , January 18, Jhamb. K., Immobilized chaperones: A productive alternative to refolding of bacterial inclusion body proteins. Process Biochemistry 43 (2008) Siegenthaler. R., Tuning of DnaK Chaperone Action by Nonnative Protein Sensor DnaJ and Thermosensor GrpE. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 45, pp , November 10, Vo. Bo. Investigador Titular C Antonio de León Rodríguez 4

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