Diagnósticos Basados en Epigenómica

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1 Clinical Chemistry 56: (2010) Q&A Eleftherios P. Diamandis 1 Diagnósticos Basados en Epigenómica El término epigenética, acuñado en 1942, se refiere a rasgos hereditariosdecélulas(atravésdemuchasrondasdedivisión celular) que no implican cambios en la secuencia de ADN subyacente. Los 2 mecanismos epigenéticos predominantes son metilación del ADN y la modificación de histonas. Los cambios epigenéticos, especialmente la metilación del ADN en la posición 5 de la citosina, que se produce en las regiones de guanina/citosina (Islas CpG), pueden tener efectos importantes sobre la transcripción genética. Por ejemplo, se sabe que la amplia metilación en regiones ricas en GC de promotores de genes u otras áreas puede afectar dramáticamente la transcripción genética y, en consecuencia, la biología entera de una celda determinada. Los cambios epigenéticos se conservan cuando las células se dividen. Aunque es bien sabido que el cáncer puede ser causado por la pérdida de genes supresores de tumor (por ejemplo, mediante la eliminación o mutación), otro importante mecanismo de silenciamiento de genes críticos es a través de la metilación. Hay numerosos ejemplos de genes que pueden ser silenciados por metilación. Por lo tanto es razonable sugerir que la metilación del ADN puede ser un marcador de silenciamiento de genes y que dichas modificaciones pueden correlacionar con progresión e iniciación de cáncer. Por esta razón, es probable que los cambios epigenéticos en el ADN puedan llevar información de diagnóstico, pronóstico o predicción. Por lo tanto no es de extrañar que los cambios epigenómicos/epigenéticos hayan atraído mayor atención recientemente para su posible aplicación en cáncer y otros diagnósticos de la enfermedad. En este Q&A, 4 expertos en el campo debaten el presente y el futuro de la epigenómica cuando se aplican a los diagnósticos. Podría describir brevemente el campo de la epigenómica? David Sidransky 2 : El campo de la epigenómica se centra en encontrar alteraciones genómicas más allá de los cambios en la secuencia de ADN. Peter W. Laird 3 : La Epigenómica es el estudio del genoma-escala de la distribución de marcas epigenéticas, que son modificaciones estables al ADN o envases de ADN que transmiten codificación no genética a la información hereditaria. Aunque existe un debate sobre qué marcas se conservan fielmente durante la división celular, es generalmente aceptado que las marcas epigenómicas incluyen la citosina 5 metilación del ADN, modificaciones de las colas de histona y posicionamiento de nucleosoma. Paul Cairns 4 : El estudio de la metilación de ADN, modificaciones de la histona, el estado de cromatina, el ARN interferente y el efecto relacionado sobre la expresión del gen en diferentes tipos de células normales que comparten un genoma idéntico, entre la célula progenitora normal y la célula tumoral, así como en otras enfermedades humanas. Bharati Bapat 5 : La epigenómica se refiere a la regulación del genoma por cambios hereditarios en la expresión génica mediada por factores de secuencia de falta de ADN. Estos incluyen la metilación de ADN, regulación de cromatina estructura, función y regu- 1 Eleftherios p. Diamandis, jefe de bioquímica clínica, departamento de bioquímica clínica, Hospital Monte Sinaí, red de salud de la Universidad, profesor y director de la División de bioquímica clínica, medicina del departamento de laboratorio y patobiología, Universidad de Toronto, Toronto, Ontario, Canadá. 2 David Sidransky, Director, Investigación de Cáncer de Cabeza y Cuello, Centro de Cáncer Johns Hopkins Sidney Kimmel, y Profesor de Otorrinolaringología y Oncología, Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD; y Director de la Red de Investigación en Detección Temprana, Instituto Nacional de Cáncer, Rockville, MD. 3 Peter W. Laird, Director del Centro de Epigenoma de la USC, Centro Norris para la Comprensión del Cáncer, Escuela de Medicina Keck, Universidad de Southern California y Profesor Asociado de los Departamentos de Cirugía y Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Southern California, Escuela de Medicina Keck, Los Angeles, CA. 1216

2 lación pequeña no codificada mediada por ARN. Una característica singular es que a diferencia de las mutaciones en las secuencias de ADN, muchas de estas alteraciones son potencialmente reversibles en la naturaleza y así ofrecen destinos atractivos para enfoques terapéuticos. Qué técnicas se utilizan para el diagnóstico de la epigenómica? Estos son fácilmente adaptables a los laboratorios de diagnósticos? David Sidransky: Hay muchas técnicas para encontrar cambios epigenómicos en las células cancerosas. De metilación del promotor, estos incluyen secuencias de ADN modificado y enfoques basados en la matriz de ensayos cuantitativos basados en PCR. Sí, todos estos enfoques pudieran ser adaptados en laboratorios de diagnóstico. Algunos, como la PCR cuantitativa, están ya integrados en muchos laboratorios. Peter W. Laird: Las técnicas genoma-escala para análisis epigenético son técnicamente difíciles y poco probables de ser adaptadas por los laboratorios de diagnóstico en un futuro próximo. Los ensayos de genes específicos basados en PCR en tiempo real se adaptan más fácilmente a plataformas comerciales presentes en los laboratorios de diagnóstico y ofrecen la ventaja de mayor técnica sensibilidad y especificidad. Paul Cairns: La metilación específica de PCR es la tecnología predominante utilizada para el diagnóstico basado en la epigenómica. La disponibilidad de kits de modificación de bisulfito comercial y tecnología PCR cuantitativa en tiempo real significa que la metilación es más fácilmente adaptable a los laboratorios de diagnóstico. Más recientemente, se ha utilizado para la detección de expresión, la PCR cuantitativa de transcripción inversa de microarn como una herramienta de diagnóstico. Bharati Bapat: Varias técnicas están disponibles para detectar cambios de la epigenómica. La metilación del ADN es detectada por análisis de secuencias de bisulfito de ADN modificado. Los diagnósticos epigenéticos, transcritas y metilación del ADN se detectan por ensayos de PCR cuantitativo basado y técnicas basados en microseries de alto rendimiento. Los ensayos basados en la PCR son fácilmente adaptables a los laboratorios de diagnóstico y ya están implementados en el de cáncer. Cuáles son las diferentes ventajas de la epigenómica sobre otras técnicas de diagnóstico? Qué creen que son las más graves desventajas del diagnóstico basado en la epigenómica? David Sidransky: En cáncer, la metilación del promotor produce una señal positiva, por lo que encontrar alelos metilados lleva al trabajo de encontrar células o moléculas raras, más fácil que buscar eventos que están ausentes en las células. En contraposición a las mutaciones genéticas, donde un conjunto de tumores puede tener cientos de diferentes mutaciones, definir metilación densa en un lugar es más fácilymás manejable para técnicas de alto rendimiento. Las desventajas de este enfoque son que los cambios epigenéticos diversos y requieren distintos tipos de materiales y ensayos. Uno también, tiene que probar varios lugares o alteraciones para cubrir un tipo de tumor. Peter W. Laird: Los perfiles de la epigenómica son bastante estables y relativamente impermeables a las fluctuaciones en el estado fisiológico y las condiciones de la recogida de la muestra. Los ensayos de metilación del ADN tienen la ventaja de que el analito de ADN es resistente a la degradación, tanto en vivo y después de obtener la muestra. Las marcas epigenéticas en una región del genoma determinan el potencial de la expresión del gen, en lugar de hacerlo en el estado de expresión real. Por lo tanto, el epigenoma transmite información no totalmente capturada por perfiles de expresión génica. El más grave inconveniente de diagnósticos basados en la epigenómica es la dificultad técnica del análisis epigenómico. Paul Cairns: Para el diagnóstico de cáncer las ventajas son que la hipermetilación aberrante es frecuente y temprana en la exposición, lo cual es un cambio positivo, y que la tecnología de detección sensible está disponible. Las desventajas de metilación son: se necesita una cantidad relativamente grande de bio-especimen (al igual que con cualquier destino basado en ácidos nucleicos de detección) y que la solidez del ensayo depende de un cuidadoso diseño y operación. Bharati Bapat: La detección de cambios epigenéticos, especialmente cambios de metilación del ADN, tiene varias ventajas sobre los marcadores genéticos convencionales. Para un gen determinado, las mutaciones puntuales ocurren a menudo en varios sitios en tu- 4 Paul Cairns, Profesor Asociado en los departamentos de Cirugía Oncológica y Patología, Centro de Cáncer Fox Chase, Philadelphia, PA. 5 Bharati Bapat, Científico del Instituto de Investigación Samuel Lunenfeld, Hospital Mount Sinai, y Profesor del Departmento de Laboratorio Médico y Patobiología, Universidad de Toronto, Toronto, Ontario, Canada. Clinical Chemistry 56:8 (2010) 1217

3 mores individuales. En contraste, la metilación del ADN se produce normalmente en la misma región del gen (por ejemplo, promotor), y esto simplifica enormemente el diseño y la interpretación de pruebas de detección. La metilación del ADN constituye una señal positiva detectable, frente a una pérdida de señal, como delaciones cromosómicas. La metilación del ADN anormal generalmente no se produce en las células normales. Por lo tanto, el ADN derivado del tumor puede detectarse con un alto grado de especificidad, particularmente en los fluidos corporales como esputo, suero o muestras de orina. La principal desventaja de los diagnósticos basados en la epigenómica es que pueden ser necesarios varios y diferentes ensayos para detectar tipos de cambios epigenéticos en un cáncer. Cuáles son los cánceres preferidos para el diagnóstico por epigenómica? David Sidransky: Todos los cánceres tienen alteraciones epigenómicas. Cáncer de pulmón, mama, próstata, cabeza, cuello y de colon también pueden ser manejables para los métodos de detección temprana. Peter W. Laird: Se han descrito anomalías epigenómicas para una amplia variedad de tipos de cáncer. Los perfiles de la epigenómica pueden utilizarse para identificar subtipos moleculares de un cáncer particular, con los resultados clínicos asociados. Un ejemplo de esto serían los fenotipos metiladores de la isla CpG, descritos por varios tipos de cáncer. Patrones de metilación del ADN anormales pueden utilizarse para detectar la presencia de células malignas o preneoplasticas en muestras luminales o biopsias de tejido para cánceres en sitios accesibles. La metilación del ADN anormal también puede detectarse en el ADN flotante derivado del tumor en el torrente sanguíneo de algunos pacientes con cáncer. Estas determinaciones se aplican mejor a cánceres con procedimientos de detección de seguimiento establecidos, como la colonoscopia para el cáncer colon rectal. Paul Cairns: Existen estudios de factibilidad de diagnóstico de todos los tipos de cáncer en la literatura. Los cánceres que son obtenidos por biopsias de tejido probablemente tienen la mayor tracción porque generalmente contienen una mayor proporción de células neoplásicas en comparación con una muestra de fluido corporal. Bharati Bapat: Todos los cánceres tienen alteraciones epigenéticas. En la actualidad, se ofrecen pruebas de detección de metilación del ADN para la detección de cáncer de próstata, pulmón y cáncer de cerebro y también ciertos subtipos (reparador de desajustes deficientes) de cáncer de colon. Los ensayos de detección de MicroARN actualmente también se están desarrollando para la detección de cáncer de páncreas y otros. Hay aplicaciones en diagnósticos epigenómicos además del cáncer que han sido considerados? David Sidransky: No soy un experto en esta área. Peter W. Laird: Las caracterizaciones de la epigenómica están en marcha para un gran nḿero de enfermedades crónicas, incluyendo enfermedades psiquiátricas y neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares y diabetes. Dos grandes problemas frente al uso del diagnóstico epigenómico de tales enfermedades. En primer lugar, estas enfermedades generalmente no tienen expansión clonal de células con una anormalidad epigenética definida y, en segundo lugar, el tejido objetivo de la enfermedad no puede ser fácilmente accesible para los ensayos de diagnósticos. En la medida en que la enfermedad sea reflectiva de las alteraciones sistemáticas epigenómicas, los suplentes de los tejidos como los glóbulos blancos pueden ser fuentes adecuadas de diagnósticos de ADN o la cromatina. Paul Cairns: Sí, para dos enfermedades, los síndromes de Prader Willi y Angelman, donde en una minoría de los casos surgen de un defecto en la impresión. Bharati Bapat: Otras aplicaciones de diagnósticos epigenéticos no son tan comunes como los vistos para el diagnóstico de cáncer. Sin embargo, el análisis de metilación del ADN es una de las pruebas de diagnóstico ofrecidas por trastornos genéticos heredados asociados con impresión genómica, tales como el síndrome de Angelman, síndrome de Prader Willi y síndrome de Beckwith Wiedemann. Los dos ĺtimos trastornos están asociados con el desarrollo del tumor. Hay algún ensayo comercial para el diagnóstico epigenómico en este momento? Estos son utilizados en la clínica? David Sidransky: La MGMT 6 (O-6-metilguanina- DNA metiltransferase) metilación glioblastoma metilación de GSTP1 (glutación S-transferasa pi 1) en los 6 Genes Humanos: MGMT, O-6-metilguanina-DNA metiltransferasa; GSTP1, glutation S-transferasa pi 1; APC, poliposis adenomatosa coli; SEPT9, septina 9; MLH1, mutl homologa 1, cáncer colon, no poliposis tipo 2 (E. coli); BRCA1, cáncer de pecho 1, inicio temprano Clinical Chemistry 56:8 (2010)

4 cánceres de próstata tienen buenos estudios y se ofrecen ahora en los laboratorios de la CLIA. Ambos suelen ser aprobados relativamente pronto por la Administración para Drogas y Alimentos de los EU. Peter W. Laird: Tengo un conflicto de interés en responder a esta pregunta. Paul Cairns: La hipermetilación del gen promotor MGMT para predicción de respuesta a la temozolomida en tejido de glioma, GSTP1 y la hipermetilación de APC (poliposis adenomatosa coli) en el tejido de la biopsia de próstata para detección de cáncer, la metilación de vimentina en pantalla basada en el taburete para el cáncer colon rectal y metilación de SEPT9 (septina 9) en suero de ADN para cáncer colon rectal. También hay ensayos de síndromes Prader Willi y Angelman. Bharati Bapat: Sí. La detección de metilación GSTP1 en cáncer de próstata, MLH1 [mutl homólogo 1, cáncer de colon, mĺtiple tipo 2 (e. coli)] metilación para los reparadores de desajustes con deficiencia de cáncer de colon y la metilación de MGMT en glioblastoma son algunos ejemplos de estas determinaciones utilizadas en la clínica. Cuál es su visión sobre el futuro de diagnósticos basados en epigenómica durante los próximos 10 años? David Sidransky: Las pruebas epigenómica serán incorporadas a la mayoría de tipos de cáncer para la detección temprana, el pronóstico y la predicción de respuesta terapéutica. Peter W. Laird: La aplicación clínica de diagnóstico epigenético es probable que sea restringido a los marcadores de la metilación del ADN en un futuro próximo. El costo rápidamente decreciente de secuenciación genómica puede permitir a la epigenómica de todo el genoma perfilado en la próxima década. Sin embargo, es más probable que se utilizará para el descubrimiento de marcador en configuración de investigación enfoques de todo el genoma y que los ensayos clínicos epigenéticos se basará en genes individuales o en grupos de genes. Paul Cairns: Para el cáncer, dependerá nuestra comprensión de exposición temprana y, en particular la interfaz entre el envejecimiento y el cáncer. Es posible que la metilación aberrante se convierta en un marcador de riesgo de cáncer. Para otras enfermedades comunes, como ha señalado Andy Feinberg, las alteraciones del epigenoma acumulado a lo largo de la vida al menos como obligar a una causa subyacente de la diferente susceptibilidad a la enfermedad entre los individuos como, digamos, polimorfismos de nucleótido único, y la epigenómica en enfermedades distintas de cáncer se está convirtiendo en una zona de intenso estudio. Bharati Bapat: Los diagnósticos basados en la epigenómica es un área emergente con un gran potencial para la aplicación clínica. En el futuro, la metilación del ADN y ensayos basados en microarn serán progresivamente incorporados como biomarcadores de la detección precoz de cáncer, pronóstico y predictores de respuesta al tratamiento. En el contexto de la medicina personalizada, cómo se comunicará la epigenómica con otros desarrollos de diagnósticos moleculares? David Sidransky: La epigenómica será una de varias alteraciones comúnmente probadas en la definición de la mejor manera de manejar o tratar a un paciente con cáncer. Peter W. Laird: Los perfiles de la epigenómica transmiten información que complementa los perfiles de expresión y la mutación del gen. Algunos subtipos moleculares, tales como los fenotipos de metiladores de la isla CpG se reconocen más fácilmente por los perfiles de expresión de la epigenómica, el número de copias o perfiles de mutación. Por lo tanto, espero que el análisis epigenómico sea una herramienta indispensable en nuestro arsenal diagnóstico para seleccionar las estrategias terapéuticas más adecuadas para cada paciente. Paul Cairns: Para el cáncer, por ejemplo, es muy probable que esa quimio resistencia intrínseca y adquirida tendrá un componente epigenético. La inactivación de BRCA1 (cáncer de mama 1, aparición precoz) por hipermetilación de mama esporádica o cáncer de ovario debe conferir una sensibilidad similar a los inhibidores de la polimerasa poly (ADP-ribosa) como inactivar mutaciones puntuales en los cánceres hereditarios. Para otras enfermedades humanas comunes es posible, incluso probable, que el trasfondo de la epigenómica será tan importante como el genoma en la susceptibilidad. Bharati Bapat: La detección de uno o varios biomarcadores epigenéticos se integrará con otras pruebas de diagnóstico molecular para determinar las estrategias óptimas para tratamientos de pacientes de cáncer. Contribuciones de autor: Todos los autores confirmaron que han contribuido al contenido intelectual de este documento y han reunido los siguientes 3 requisitos: (a) contribuciones significativas a la Clinical Chemistry 56:8 (2010) 1219

5 concepción y diseño, adquisición de datos, o análisis e interpretación de datos; (b) redacción o revisión del artículo de contenido intelectual; y (c) la aprobación final del artículo publicado. Revelaciones de potenciales conflictos de interés de los autores: Tras la presentación del manuscrito, todos los autores completaron el formulario de divulgación de potencial conflicto de intereses. Potenciales conflictos de interés: Empleo o liderazgo: no se declara Papel del consultor: D. Sidransky, Oncomethylome Sciences; P.W. Laird, Epigenomics; P. Cairns, Oncomethylome Sciences me. Propiedad: D. Sidransky, Oncomethylome Sciences; P. Cairns, Oncomethylome Sciences. Honorarios: P.W. Laird, Epigenomics. Financiamiento de la investigación:d. Sidransky, Oncomethylome Sciences. Testimonio de expertos: No se declaran Papel de patrocinador: los organismos patrocinadores no desempeñanalgún papel en el diseño del estudio, la elección de los pacientes inscritos, la revisión y la interpretación de datos, o la elaboración o aprobación del manuscrito. Previously published online at DOI: /clinchem Clinical Chemistry 56:8 (2010)