EL RATÓN CON SENESCENCIA ACELERADA (SAMP8): UN MODELO EXPERIMENTAL PARA CARACTERIZAR LOS PRIMEROS CAMBIOS NEURONALES EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER

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1 EL RATÓN CON SENESCENCIA ACELERADA (SAMP8): UN MODELO EXPERIMENTAL PARA CARACTERIZAR LOS PRIMEROS CAMBIOS NEURONALES EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Investigadoras principales: Dra. Mercè Pallàs Lliberia Facultat de Farmàcia UB Dra. Gemma Casadesús Rierola Case Western Reserve University USA Duración: 3 años 1

2 1. Resumen El objetivo del estudio ha sido: 1) establecer la cronología de la aparición de tres marcadores patológicos asociados al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer: 1) el estrés oxidativo, 2) alteraciones del ciclo celular y 3) la hiperfosforilación de tau y utilizar terapias dirigidas a estos marcadores, como el litio (inhibidor de la fosforilación de la proteína tau), el resveratrol y sus derivados (antioxidante y activador de sirtuinas) para establecer los efectos sobre las vías de señalización relacionadas con la fosforilación de tau (GSK3β, cdk5) y la hiperfosforilación de tau, así como el potencial sinérgico de estos eventos con el estrés oxidativo. La última parte del estudio se ha dedicado a determinar si en alguno de estos tratamientos experimentales está implicada la vía de la sirtuina 1 en el proceso de neuroprotección, mediante el uso de litio, el resveratrol y la restricción calórica. El análisis sistemático de la cronología de estos acontecimientos significativos y la interrelación de estos aspectos en lo que respecta a muerte celular y patología nos permitirá afinar el enfoque terapéutico para detener el desarrollo y la progresión de la enfermedad de Alzheimer en sus primeras fases. 2. Resultados SAMP8 como modelo de la enfermedad de Alzheimer. Los datos obtenidos indicaron que las diversas formas de tau hiperfosforilada están más presentes en el SAMP8 en comparación con SAMR1. Es importante destacar que hemos demostrado que la hiperfosforilación de tau en el ratón SAMP8 está impulsada por los mecanismos relacionados con la enfermedad de Alzheimer, como el aumento de GSK3β y la activación de la vía cdk5/p35, cinasas claves en el proceso de hiperfosforilación de tau y implicadas el envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas. En particular, hemos demostrado un aumento temprano de la fosforilación de tau (a los 5 meses) en los ratones SAMP8, lo que sugiere que este proceso es una parte integral de envejecimiento y, relacionado con el estrés oxidativo, un proceso también 2

3 temprano en estos animales. Además, la acumulación de placas seniles en algunos, pero no todos, los modelos de la EA se asocia a deterioro cognitivo. En los ratones SAMP8, se demostró un aumento del péptido Aß con la edad, utilizando anticuerpos policlonales que reconocían Aβ1-42 y Aβ1 40 y otros fragmentos del procesamiento de la proteína precursora del β-amiloide (AßPP) en comparación con el control SAMR1. Respecto a la expresión de proteínas del ciclo celular se encontraron diferencias significativas entre SAMR1 y SAMP8. También se pueden observar diferencias entre los de la misma cepa (SAMR1 o SAMP8) a diferentes edades; en resumen, se puede detectar un aumento en los niveles de proteínas del ciclo celular con la edad, y entre las especies. Las proteínas analizadas hasta ahora incluyen E2F-1, PRB, ciclina D, ciclina E, ciclina a, cdk2 y cdk4. El litio como posibilidad terapéutica Para este fin tratamos ratones SAMP8 con litio durante 8 semanas, un modulador bien conocido de GSK-3β. El tratamiento reduce la activación de la caspasa 3 y calpaína, lo que indica que el litio proporciona neuroprotección. El litio reduce tanto los niveles y la actividad de GSK-3β como la activación de cdk5. Consistente con esto, se analizaron tres epítopos diferentes de fosfo-tau, es decir, en Ser199, Ser212 y Ser396, y demostró una reducción de la hiperfosforilación de tau después del tratamiento con litio. También hemos examinado la capacidad de cloruro de litio para modular el estrés oxidativo y los parámetros del ciclo celular en este grupo de animales. El cloruro de litio tiene un efecto antioxidante global en los ratones SAMP8, reduciendo así HNE y los niveles de HO-1, además de la carbonilación de proteínas y un incremento de defensas antioxidantes endógenas como MnSOD. Hemos demostrado que, en el modelo control SAMR1, éste no era el caso. En SAMR1, el litio aumentó los niveles de peroxidación de lípidos y los redujo en SAMP8. No se encontraron cambios significativos en la expresión de la proteína SOD y CAT o cambios en la actividad de la SOD en todas las condiciones experimentales evaluadas. Con referencia a la expresión de genes relacionados con la transcripción de estrés oxidativo, el litio aumentó la expresión génica de SOD y disminuyo la de glutatión. Otros genes como el glutatión S- 3

4 transferasa, catalasa, glutatión peroxidasa modificaron su expresión después del tratamiento con litio. Siendo el litio un potente inhibidor de GSK3 y, por lo tanto, regulador de la hiperfosforilación tau, una posibilidad es que la hiperfosforilación de tau conduzca directamente al estrés oxidativo que se redujera por litio; sin embargo, en la ausencia de tau hiperfosforilada que el litio tuviera un efecto pro-oxidante. Por otra parte, también hemos descubierto que el litio es capaz de normalizar los niveles de OPA-1, pero no los niveles de PGC-1. Estos datos sugieren que litio puede tener una acción sobre la dinámica mitocondrial, y que la modulación observada de la oxidación y los niveles de estrés oxidativo vayan más allá de efectos a través de regulación de GSK3beta. Hemos determinado que litio en dosis bajas es eficaz en la protección de la función cognitiva en SAMP8. También hemos determinado que a dosis bajas (la mitad de la dosis utilizada en el tratamiento del trastorno bipolar) el litio reduce significativamente GSK3beta y aumenta los niveles de sinapsina 1, un marcador sináptico íntimamente asociado con la liberación de neurotransmisores. La modulación de la vía de la sirtuina Nuestro grupo determinó que la expresión de sirtuina estaba reducida en corteza e hipocampo de SAMP8 en comparación con SAMR1, por ello hemos aplicado estrategias que activan la vía de la sirtuina 1, como la suplementación en la dieta de resveratrol y análogos o la restricción calórica. Nuestros resultados indican que el resveratrol y pterostilbeno no son capaces de modular la expresión de sirtuina 1 a dosis bajas en SAMP8. Este hecho se ha confirmado por la falta de diferencias en la desacetilación p53. Sin embargo, el pterostilbeno es capaz de incrementar las defensas antioxidantes endógenas (MnSOD) a niveles similares a los controles. También hemos determinado que el tratamiento con pterostilbeno, pero no con resveratrol, reduce la fosforilación de JNK y aumenta la fosforilación de FoxO1 en sitios dependientes de Akt. Por último, hemos determinado que el pterostilbeno pero no el resveratrol regula a la baja la activación NFκB. Debido a que pterostilbeno ha demostrado ser un agonista PPAR alfa in vitro, y la activación del PPAR alfa inhibe el NFκB y aumenta la expresión de MnSOD, hemos analizado la expresión de PPAR y se ha determinado que la 4

5 expresión está aumentada, lo que señala a un nuevo mecanismo de señalización de este compuesto. Es importante destacar que hemos determinado que el pterostilbeno, pero no el resveratrol, es eficaz para mejorar la función cognitiva en los ratones SAMP8. El resveratrol en dosis equivalente a 2 vasos de vino no produjo una mejora cognitiva en el paradigma utilizado (laberinto radial en agua) en los ratones SAMP8, pero sí lo hizo el pterostilbeno, que muestra una mayor biodisponibilidad. Ni pterostilbeno ni resveratrol tuvieron un impacto significativo en la hiperfosforilación de tau, lo que indica que los efectos de estos compuestos son independientes de la patología tau. La restricción calórica es una estrategia ampliamente utilizada para activar la vía de la sirtuina 1. Se sometió a los animales SAMP8 a un protocolo de ayuno intermitente, como método de reducción de la ingesta calórica. Se observó una reducción significativa de la hiperfosforilación de tau en la corteza e hipocampo de SAMP8 en restricción calórica, así como una disminución de la activación de p-gsk3ß Tyr216 forma activa de esta cinasa. Adicionalmente, SAMP8 presentaba una expresión proteica significativamente menor de ADAM 10 (proteasa implicada en la vía no amiloidogénica de APP) en comparación con SAMR1 a los 5 meses; sin embargo, la expresión de esta proteína se recuperó en los ratones en restricción calórica. La expresión de sirtuina 1 fue menor en la corteza y el hipocampo de SAMP8 que SAMR1. Los ratones SAMP8 bajo restricción calórica recuperaron parcialmente la expresión proteica de sirtuina 1. SAMP8 presentó mayor NFκB acetilado que SAMR1 y la restricción calórica redujo la forma acetilada de este factor de transcripción en SAMR1 y SAMP8. Con respecto a FoxO1, estudios de inmunoprecipitación de este factor de transcripción indicaron que, en los animales no en ayunas, la forma acetilada de FoxO1 fue significativamente mayor en SAMP8 que en SAMR1, mientras que en los animales con régimen de restricción calórica si se determinó una reducción significativa de FoxO1 acetilado. Como medida del efecto neuroprotector de la restricción calórica en el envejecimiento, se estudiaron el factor neurotrófico BDNF y la HSP70, un marcador de la supervivencia neuronal. La expresión de BDNF en SAMP8 fue menor que en SAMR1. Sin embargo, hubo un aumento significativo en los niveles de BDNF 5

6 tras la restricción calórica en los SAMP8. En nuestras condiciones experimentales, SAMP8 muestra una menor expresión de HSP70 que SAMR1. Se observó una recuperación significativa en la expresión de HSP70 en el SAMP8 sometido a restricción calórica respecto al SAMP8, normal, alcanzando valores similares a SAMR1. Respecto al análisis genómico, se realizó el análisis de microarrays con el fin de analizar simultáneamente la expresión de varios genes implicados en las vías de señalización relacionadas con el estrés oxidativo, la apoptosis, la función mitocondrial, el ciclo celular, la familia sirtuinas y otras proteínas asociadas a enfermedades neurológicas, con la estructura celular y otros procesos celulares. Se analizaron 62 genes, y los z-scores resultantes fueron obtenidos a partir de cuatro experimentos independientes, cada uno de los cuales se realizó por duplicado. Se comparó la expresión de estos genes entre SAMP8 y SAMR1, y SAMP8 con restricción calórica. Hemos encontrado algunos genes con un z-score de entre 1,5 y 2,0. Por ejemplo, en el ratón SAMP8 bajo restricción calórica tres genes superaron un z-score de 1,5: Rb1 (-1,95), Casp9 (-1,65) y Park2 (-1,50). Por otro lado, la comparación de SAMP8 y SAMP8 bajo restricción calórica mostraron que sólo Gpx1 (-1,89), jun (-1,76) y E2F-1 (-1,57) redujeron su expresión y sólo App aumentó su expresión (1,61) en el segundo. Por lo tanto, al menos en cuanto a transcripción, no se han producido modificaciones significativas en los genes analizados tras la restricción calórica en el modelo SAMP8. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos El objetivo final del presente proyecto integrado para proporcionar nuevos conocimientos que pueden ser utilizados por los científicos en la investigación traslacional de la lucha contra la demencia en la sociedad envejecida. 1) Los resultados obtenidos en el presente proyecto han permitido la identificación de los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a las 6

7 acciones neuroprotectoras de compuestos como el litio, el resveratrol y pterostilbeno. A través de la modulación de los perfiles de estrés oxidativo, las vías asociadas con la función cognitiva y las vías metabólicas tales como la activación sirtuina 1, hemos determinado nuevos mecanismos de protección que se pueden desarrollar en nuevas terapias dirigidas al tratamiento del deterioro cognitivo leve y enfermedad de Alzheimer precoz. 2) La investigación desarrollada puede resultar en un avance de la metodología científica. La caracterización completa de SAMP8 como modelo animal que sea una reproducción fidedigna de la fisiopatología humana y de las consecuencias del envejecimiento y/o enfermedad de Alzheimer. Se ha pretendido que a través de una batería de pruebas neuroquímicas, pruebas funcionales y de comportamiento proporcionar a los científicos una nueva herramienta para el estudio de la enfermedad de Alzheimer, su relación con la edad y un nuevo modelo para la investigación farmacológica de posibles nuevas terapias. 4. Publicaciones Tajes, M.; Gutierrez-Cuesta, J.; Folch, J.; Ferrer, I.; Caballero, B.; Smith, M.A.; Casadesus, G.; Camins, A.; Pallás, M. Lithium treatment decreases activities of tau kinases in a murine model of senescence. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 67 (6): IF: Pallàs, M.; Pizarro, J.G.; Gutierrez-Cuesta, J.; Crespo-Biel, N.; Alvira, D.; Tajes, M.; Yeste-Velasco, M.; Folch, J.; Canudas, A.M.; Sureda, F.X.; Ferrer, I.; Camins, A. Modulation of SIRT1 expression in different neurodegenerative models and human pathologies. Neuroscience, 154(4): IF:

8 Gutierrez-Cuesta, J.; Tajes, M.; Jiménez, A.; Coto-Montes, A.; Camins, A.; Pallàs, M. Evaluation of potential pro-survival pathways regulated by melatonin in a murine senescence model. Journal of Pineal Research 45( 5): IF: Pallàs, M.; Verdaguer, E.; Tajes, M.; Gutierrez-Cuesta, J.; Camins, A. Modulation of sirtuins: new targets for antiageing. Recent Patents on CNS Drug Discovery 3(1): IF: Pallas M.; Camins A.; Smith MA.; Perry G.; Lee HG.; Casadesus G. From aging to Alzheimer's disease: unveiling 'the switch' with the senescence-accelerated mouse model (SAMP8). Journal of Alzheimer's Disease 15(4): IF: Pallàs, M.; Pizarro, J.G.; Gutierrez-Cuesta, J.; Crespo-Biel, N.; Alvira, D.; Tajes, M.; Yeste-Velasco, M.; Folch, J.; Canudas, A.M.; Sureda, F.X.; Ferrer, I.; Camins, A. Modulation of SIRT1 expression in different neurodegenerative models and human pathologies. Neuroscience. 154(4): IF: 3,556 Tajes, M.; Yeste-Velasco, M.; Zhu, X.; Chou, S.P.; Smith, M.A.; Pallàs, M.; Camins, A.; Casadesús, G. Activation of Akt by lithium: pro-survival pathways in aging. Mechanisms of Ageing and Development. 130(4): IF: Camins A, Crespo-Biel N, Junyent F, Verdaguer E, Canudas AM, Pallàs M. Calpains as a target for therapy of neurodegenerative diseases: putative role of lithium. Current Drug Metabolism. 10 (5): IF:

9 Pizarro, J.G.; Folch, J.; Esparza, J.L.; Jordan, J.; Pallàs, M.; Camins, A. A molecular study of pathways involved in the inhibition of cell proliferation in neuroblastoma B65 cells by the GSK-3 inhibitors lithium and SB Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13(9B): IF: Tajes, M.; Gutierrez-Cuesta, J.; Ortuño-Sahagun, D.; Camins, A.; Pallàs, M. Anti-aging properties of melatonin in an in vitro murine senescence model: involvement of the sirtuin 1 pathway. Journal of Pineal Research 47(3): IF: Camins, A.; Verdaguer, E.; Junyent, F.; Yeste-Velasco, M.; Pelegrí, C.; Vilaplana, J.; Pallàs, M. Potential mechanisms involved in the prevention of neurodegenerative diseases by lithium. CNS Neurosciences and Therapeutics. 15 (4): IF: Camins A, Sureda FX, Junyent F, Verdaguer E, Folch J, Beas-Zarate C, Pallas M. An overview of investigational antiapoptotic drugs with potential application for the treatment of neurodegenerative disorders. Expert Opin Investig Drugs. 19(5), , 2010 IF: Pizarro JG, Verdaguer E, Ancrenaz V, Junyent F, Sureda F, Pallàs M, Folch J, Camins A. Resveratrol Inhibits Proliferation and Promotes Apoptosis of Neuroblastoma Cells: Role of Sirtuin 1. Neurochem Res. 36 (2) , 2011 IF: Camins, A.; Sureda, F.X.; Junyent, F.; Verdaguer, E.; Folch, J.; Beas-Zarate, C.; Pallas, M. An overview of investigational antiapoptotic drugs with potential application for the treatment of neurodegenerative disorders. Expert Opinion On Investigational Drugs. 19 (5) IF:

10 Tajes, M.; Gutierrez-Cuesta, J.; Folch, J.; Ortuño-Sahagun, D.; Verdaguer, E.; Jiménez, A.; Junyent, F.; Lau, A.; Camins, A.; Pallàs, M. Neuroprotective role of intermittent fasting in senescence-accelerated mice P8 (SAMP8). Experimental Gerontology 45 (9): IF: