Inmunoanálisis y pruebas de detección de drogas de abuso en el laboratorio de toxicología. Jennifer A. Collins, Ph.D. MEDTOX Laboratories, Inc.

Transcripción

1 Inmunoanálisis y pruebas de detección de drogas de abuso en el laboratorio de toxicología Jennifer A. Collins, Ph.D. MEDTOX Laboratories, Inc.

2 Orden del día Antecedentes y conceptos básicos Tipos de inmunoanálisis Temas de reactividad cruzada Formatos y modelos de pruebas Aplicaciones en el mercado

3 Antecedentes y conceptos básicos Yalow & Berson, 1959: aplicación de radioisótopos en la medición de insulina (RIA) Recibió el premio Nobel en 1977

4 Conceptos básicos: Anticuerpos Sitio de unión del antígeno Regiones variables Regiones comunes Los anticuerpos comparten una estructura básica común, pero incluyen regiones variables que les permiten adaptarse a antígenos específicos. Esta flexibilidad proporciona la heterogeneidad requerida para una inmunidad eficaz.

5 Conceptos básicos: Antígenos Los antígenos inducen la formación de anticuerpos cuando se los introduce en un huésped extraño Interacción entre anticuerpo y antígeno: los antígenos y los anticuerpos muestran comportamientos de afinidad y unión en solución (concepto de cerradura y llave) La unión de los antígenos y los anticuerpos conduce a la eliminación del inmunógeno

6 Conceptos básicos: Inmunoanálisis Los inmunoanálisis son un grupo variado de técnicas analíticas basadas en interacciones específicas de anticuerpo-antígeno que producen una señal mensurable que puede relacionarse con la concentración de un compuesto en solución Aplicaciones en casi todas las áreas de laboratorio; esta presentación estará limitada a los ensayos y aplicaciones de las drogas de abuso Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden ser dirigidos a moléculas de drogas muy específicas o a una clase entera de drogas

7 Inmunoanálisis competitivo Basado en la competencia entre la droga de la muestra y un derivado de la droga marcado en un reactivo para una cantidad limitada de anticuerpo Anticuerpo Antígeno en la muestra Antígeno marcado

8 Inmunoanálisis no competitivo En los métodos no competitivos, la mezcla de reacción generalmente incluye un exceso del anticuerpo marcado, de modo que se una la totalidad de la droga y el metabolito. La cantidad del complejo anticuerpo-antígeno se mide luego para determinar la cantidad de droga presente en la muestra.

9 Inmunoanálisis heterogéneos vs. homogéneos Los inmunoanálisis heterogéneos requieren la separación de los componentes unidos y separados después de que tuvo lugar la reacción (por ej. ELISA) En los inmunoanálisis homogéneos, la reacción de unión se mide "en el lugar" sin la separación de los componentes de reacción

10 Inmunoanálisis utilizados en pruebas de detección de drogas de abuso RIA EIA FPIA KIMS Flujo lateral

11 Radioinmunoanálisis (RIA) El RIA utiliza un marcador radiactivo (generalmente 125 I, 3 H o 14 C), que emite una radiación que puede medirse con un contador beta o gamma En años recientes se ha observado una tendencia que se aleja del RIA y se acerca a las técnicas no isotópicas Tubo cubierto con anticuerpos RIA DE TUBO CUBIERTO Agregar muestra Agregar droga 125 I COMPETENCIA Incubado Decantar y contar

12 Enzimoinmunoanálisis (EIA) Los enzimoinmunoanálisis utilizan marcadores de enzimas como por ejemplo glucosa-6-fosfato dehidrogenasa (G6PD) y B-galactosidasa para proporcionar una señal mensurable Las reacciones se controlan fotométricamente como cambios en la absorbancia

13 Ejemplos de EIA: EMIT R Anticuerpo Sustrato Droga Enzima con droga acoplada Sustrato que reacciona con la enzima Droga que bloquea la droga acoplada a la enzima La actividad/absorbancia de la enzima es directamente proporcional a la concentración de la droga La droga de la muestra y la droga marcada con G6PD compiten por los sitios de unión del anticuerpo La unión inhibe la actividad de la enzima, mientras que las enzimas libres permanecen activas para interactuar con el sustrato

14 Ejemplos de EIA: CEDIA R Anticuerpo Analito DE Monómero de AE Conc. alta del analito Conc. baja del analito Los fragmentos de la enzima creada por ingeniería genética de la enzima B-galactosidasa se vuelven a unir en forma espontánea en la solución para formar una enzima activa Monómero de AE Enzima activa La concentración de la droga es directamente proporcional a la actividad de la enzima Sin actividad enzimática La droga de la muestra compite por los sitios de unión del anticuerpo

15 Ejemplos de EIA: ELISA Ensayo inmunosorbente ligado a enzimas: EIA competitivo, heterogéneo Los componentes de reacción se absorben o se unen a la superficie de una fase sólida, generalmente una placa de microtitulación La absorbancia se mide usando un lector de microplaca La absorbancia de la muestra es inversamente proporcional a la concentración de la droga

16 Polarización fluorescente FPIA: ensayos competitivos, homogéneos que utilizan marcadores fluorescentes. Los resultados se miden fotométricamente.

17 FPIA Agregar muestra y reactivos Zona de incubación Droga marcada con fluorosceína Anticuerpo contra droga Droga Excitación Emisión Detección fluorescente El valor de polarización de la muestra es inversamente proporcional a la concentración del analito La droga de la muestra compite con la droga marcada con fluoresceína por los sitios de unión del anticuerpo La mezcla de reacción es excitada por medio de luz polarizada plana Cuando el marcador regresa a un estado de menor energía, emite luz; se mide la polarización

18 Interacción cinética de micropartículas en solución (KIMS) La droga de la muestra compite con el derivado de la droga por los sitios de unión del anticuerpo Las micropartículas unidas al anticuerpo forman aglomerados (aglutinados) que aumentan la absorbancia de la mezcla de reacción La absorbancia es inversamente proporcional a la concentración de la droga en la muestra Ensayo en línea (Gen I) - Negativo Anticuerpo anti-droga Anticuerpo anti-droga Aglomeración Sin aglomeración Droga unida a micropartículas Ensayo en línea (Gen I) - Positivo Droga unida a micropartículas Droga en la muestra

19 Pruebas de detección de drogas de abuso en centros de atención: Tecnología de flujo lateral Inmunoanálisis competitivos heterogéneos Marcador: anticuerpos dorados coloidales secados en la almohadilla de la muestra Derivados de drogas "secados" en tira en ubicaciones definidas La muestra de orina aplicada a una almohadilla de muestra emigra hacia abajo en la tira La droga en la muestra se une a anticuerpos que dan como resultado una señal de lectura visual

20 Inmunoanálisis de flujo lateral

21 Fortalezas Aplicaciones en todas las áreas de laboratorio Buena sensibilidad, gran variedad de pruebas Fácilmente automatizados con aplicaciones en muchas plataformas de instrumentos En la mayoría de los casos, no se necesita una preparación de la muestra; eficientes; económicos

22 Limitaciones Los inmunoanálisis son más útiles si comprendemos sus limitaciones Dependiendo del reactivo, pueden tener un rango dinámico limitado Reactividad cruzada y especificidad Interferencias de compuestos sin relaciones estructurales La interpretación de los resultados siempre debe efectuarse en este contexto

23 Reactividad cruzada Problemas de pruebas de rutina

24 Reactividad cruzada Los fabricantes realizan estudios extensivos de reactividad cruzada tanto para compuestos con relaciones estructurales como no relacionados Sin embargo...

25 Reactividad cruzada Generalmente los estudios se realizan durante el desarrollo del ensayo, no se incluyen los compuestos más nuevos La mayoría utiliza compuestos precursores, los metabolitos pueden presentar una reactividad cruzada no identificada Para algunos compuestos, las concentraciones en orina del uso terapéutico pueden alcanzar o exceder los niveles analizados (por ej. efedrina)

26 Anfetaminas Dependiendo del reactivo, la especificidad se puede optimizar a anfetamina o metanfetamina sin reactividad cruzada al otro compuesto por ej. los kits específicos para anfetaminas pueden no responder a muestras que presentan únicamente metanfetaminas La capacidad de detectar drogas "de diseño" MDMA y MDA varía según el reactivo La reactividad cruzada es generalmente un % del compuesto objetivo

27 Anfetaminas Los kits monoclonales tienen una reactividad cruzada minimizada con otros simpatomiméticos como la efedrina y la fenilpropanolamina, sin embargo, las concentraciones en orina pueden alcanzar niveles suficientes como para provocar una respuesta Los ensayos policlonales son menos específicos para las anfetaminas/metanfetaminas y se pueden utilizar como una clasificación general para las aminas simpatomiméticas que es lo que se prefiere en ciertos mercados

28 Opiatos REACTIVIDAD CROSS-REACTIVITY CRUZADA al límite de 300 ng/ml* Compound Approximate Compuesto Reactividad cruzada Cross aproximada Reactivity 6-Acetylmorphine 77% 6-Acetilmorfina Codeine 130% 150% Dihydrocodeine 63% Codeína 167% Diacetylmorphine 69% Dihidrocodeína Ethyl Morphine 81% 94% Hydrocodone 28% Nalorfina Hydromorphone 19% 2% Morphine-3-glucoronide 53% Oximorfona <1,5% Thebaine 26% Hidrocodona Meperidine <0.3% 157% n-norcodeine 2% Hidromorfona Oxycodone <0.3% 54% Morfina-3-glucoronida Naloxona Meperidina n-norcodeína Oxicodona 47% <0,03% <0,2% 2% 11% * Tabla de reactividad cruzada de opioides para Abbott Architect c8000 Generalmente optimizado para la morfina Buena reactividad cruzada con codeína, morfina, hidrocodona, hidromorfona Insuficiente reactividad cruzada con oxicodona, fentanilo, meperidina y otros opioides

29 Benzodiazepinas Reactividades cruzadas variables dependiendo del reactivo; la reactividad cruzada del lorazepam puede ser insuficiente, la mayoría son inadecuadas para el flunitrazepam Variabilidad adicional en respuesta a la droga conjugada contra la no conjugada Las pruebas de detección de reactividad cruzada generalmente superan los componentes de prueba de confirmación estándar

30 Metadona El anticuerpo es dirigido a la droga precursora La reactividad cruzada con el metabolito es insuficiente; puede dar como resultado un negativo falso en pacientes que están tomando dosis entre bajas y moderadas de metadona o de metabolizadores rápidos También es un problema para el control de la desviación de la droga en programas de tratamiento con metadona

31 Fenciclidina La PCP está plagada de reactividades cruzadas con drogas bastante comunes (venlafaxina, dextrometorfano, difenhidramina) La prevalencia es muy baja, la mayoría de los resultados positivos no son confirmados por GCMS Es interesante destacar que en poblaciones donde la prevalencia de la droga es mayor (ciertas ubicaciones geográficas en los EE.UU.) los índices de confirmación mejoran en forma significativa

32 Cocaína, THC Cocaína Las pruebas se optimizan a benzoilecgonina; reactividad cruzada insuficiente con la cocaína precursora (Cedia es una excepción) Muy poca reactividad cruzada con otros compuestos, los índices de confirmación son altos Metabolitos de THC (marihuana) Muy pocas reactividades cruzadas documentadas con compuestos no cannabinoideos, los índices de confirmación son altos

33 Formatos y modelos de pruebas Cualitativos y semicuantitativos Pruebasclínicasy forenses Componentes del programa

34 Formatos de pruebas La mayoría de los sistemas de reactivos de inmunoanálisis para las pruebas de detección de drogas de abuso son aptos para los formatos de resultados o calibración tanto cualitativos como semicuantitativos La elección del formato depende de las preferencias individuales del laboratorio, el tipo de cliente y el diseño y compatibilidad del programa con otros sistemas de pruebas que puedan encontrarse en el analizador

35 Cualitativos Punto de calibración único en un límite específico Los resultados son "positivos" o "negativos"; por ejemplo por encima o por debajo del límite Los requisitos de control de calidad también son cualitativos Aplicación muy sencilla Muchos laboratorios de gran volumen operan de este modo

36 Semicuantitativos Puntos de calibración múltiples Proporcionan resultados numéricos que son una estimación de la concentración de la droga; esto se ve dificultado por la reactividad cruzada de drogas múltiples dentro de una clase El control de calidad se evalúa de forma cuantitativa Pueden ser un mejor método de predicción de diluciones en pruebas de confirmación Se pueden usar con la normalización de creatinina para controlar la eliminación de la droga con el paso del tiempo

37 Reactividad cruzada de drogas múltiples dentro de una clase MORFINA MORPHINE vs vs SCREEN DETECCIÓN Recordatorio de que cuando varias drogas dentro de una clase reaccionan en forma cruzada, ni los formatos cualitativos ni los semicuantitativos son buenos métodos de predicción de la concentración real de la droga CG/EM G C /M S CUANTITATIVAS Q U A N T RESULTADO SCREEN DE DETECCIÓN MORFINA MORPHINE

38 Clínico vs. forense En general, el término prueba forense de droga en orina se utiliza para referirse a los programas de pruebas donde los resultados pueden estar sujetos a litigios y/o tener implicaciones punitivas para el donante El ejemplo más común son las pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo

39 Clínico vs. forense Pruebas clínicas se refiere generalmente a las pruebas utilizadas en diagnóstico y tratamiento Un ejemplo común son las pruebas utilizadas para controlar individuos en tratamiento por abuso de sustancias Menos probabilidad de estar sujetas a litigio, sin embargo, eso no es incuestionable; existe cruzamiento entre los dos tipos de pruebas

40 Modelos de programas de pruebas de detección de drogas de abuso Pruebas de detección por inmunoanálisis con confirmación automática Se exige para todas las pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo Se recomienda para cualquier tipo de prueba con implicaciones legales o cuando las consecuencias son graves Pruebas de detección por inmunoanálisis con confirmación a pedido Se utiliza frecuentemente en la justicia penal y en los mercados de rehabilitación Se solicitan las confirmaciones después de consultar con el donante o antes de tomar alguna medida

41 Modelos de programas de pruebas de detección de drogas de abuso Pruebas de detección por inmunoanálisis solamente Se pueden usar en aplicaciones de sala de emergencia cuando el tratamiento no depende de una identificación específica Justicia penal y mercados de rehabilitación Se puede utilizar en marcados afectados por el costo Pruebas integrales utilizando inmunoanálisis y técnicas cromatográficas adicionales Se pueden utilizar cuando se debe controlar un espectro de compuestos más amplio; por ej. clínicas para el dolor, profesionales de atención a la salud

42 Aplicaciones Lugar de trabajo Profesionales con problemas Clínicas de tratamiento del dolor Justicia penal Tratamiento de abuso de sustancias Toxicología de urgencia Pruebas de detección de drogas en neonatos

43 Pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo Gran mercado en los Estados Unidos, desarrollado a principios de la década del 80, presenta una gran evolución Con frecuencia es un criterio para la contratación; los motivos para realizar las pruebas incluyen evaluaciones previas a la contratación, después de un accidente, aleatoriamente, al regresar a las tareas Las pruebas son consideradas forenses; se requiere una cadena de custodia para la documentación

44 Pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo Extremadamente reguladas El programa federal de pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo cubre a la mayoría de los empleados federales y los individuos que trabajan en industrias reguladas por el gobierno federal (por ej. el transporte) Administrado por SAMHSA en el Departamento de Salud y Servicios Humanos Los laboratorios debe estar certificados por la agencia Las drogas, límites y metodología se establecen en pautas escritas que deben cumplirse

45 Pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo Pruebas no federales A menudo se las denomina "no reguladas", pero es inexacto. Los parámetros para las pruebas están cubiertos por otros organismos reguladores o certificadores (por ej. CAP, CLIA, leyes estatales) Incorpora una gama más amplia de compuestos, límites y metodología

46 Pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo Modelos Todas son pruebas de detección por inmunoanálisis iniciales con confirmación automática de presuntos resultados positivos La mayoría de los laboratorios utilizan un formato de ensayo cualitativo Los límites estándares están disponibles, satisfacen la mayoría de las necesidades Se usan modelos semicuantitativos en menor medida Proporciona una variedad más amplia de límites Para algunos compuestos, presenta información comparativa más específica para revisión e informe de resultados

47 Profesionales con problemas Este es un mercado más selectivo; profesionales de atención a la salud en tratamiento por problemas de abuso de sustancias Se requieren pruebas en orina de detección de drogas, de rutina y aleatorias, para poder conservar la licencia Las pruebas son consideradas forenses; si se detecta un incumplimiento puede revocarse la licencia

48 Profesionales con problemas Modelos Pruebas de detección por inmunoanálisis iniciales con confirmación automática de presuntos resultados positivos Se utilizan formatos tanto cualitativos como semicuantitativos

49 Manejo del dolor Las pruebas de detección de drogas en pacientes con dolor crónico son un mercado emergente en los EE.UU. No es necesariamente una prueba "clínica"; el problema: abuso de drogas y desviación de drogas Muchas clínicas de tratamiento del dolor exigen que los pacientes que están recibiendo tratamiento a largo plazo con opiatos firmen un "contrato sobre opiatos" Exige que el paciente revele todo el uso de las drogas Estipula la posible terminación del paciente según el cumplimiento con las pruebas de orina de detección de drogas

50 Manejo del dolor Desafíos en el control del cumplimiento en pacientes con dolor crónico: Requiere la detección de una amplia gama de opioides incluida oxicodona, tramadol y fentanil Actualmente hay disponibles ensayos homogéneos más nuevos para opiatos sintéticos más esotéricos Las pruebas de detección de drogas están diseñadas para detectar la presencia de drogas; las clínicas de tratamiento del dolor están interesadas en la ausencia de drogas críticas

51 Manejo del dolor Puede requerir un enfoque más amplio para la realización de las pruebas que incluya inmunoanálisis y métodos de detección cromatográficos La detección de drogas secundarias (antidepresivos, anticonvulsivos, sedantes, medicamentos de venta libre, etc.) da una buena indicación del cumplimiento general con los regímenes de drogas prescritos y el uso de otras drogas

52 Justicia penal Gran mercado en los Estados Unidos Arresto/etapa previa al juicio Prisioneros Personas en libertad condicional Relaciones significativas entre el delito y el uso/abuso de sustancias Amplias variaciones en modelos de prueba, se realizan generalmente de modo forense con cadena de custodia para la documentación

53 Justicia penal Los modelos de prueba van desde pruebas de detección con confirmación automática a pruebas sólo de detección Son comunes las pruebas de detección por inmunoanálisis con confirmación a pedido Los resultados de las pruebas de detección de drogas se entregan al oficial que hace el seguimiento de la persona en libertad condicional Las personas en libertad condicional a menudo admiten el consumo Las confirmaciones se solicitan únicamente cuando se niega el consumo o cuando es posible el encarcelamiento

54 Justicia penal Se utilizan modelos tanto cualitativos como semicuantitativos Los valores cuantitativos se pueden corregir a la concentración de creatinina Seguir concentraciones corregidas en serie puede ser útil para determinar un nuevo consumo de marihuana

55 Tratamiento de abuso de sustancias Si bien los formatos de pruebas se asemejan mucho a las pruebas de la justicia penal, las pruebas de los servicios de rehabilitación generalmente se consideran clínicas; los resultados se utilizan en el diagnóstico y tratamiento de un trastorno de abuso de sustancias Sin embargo, si los resultados tienen implicaciones punitivas, las pruebas se deben manejar de acuerdo con los estándares forenses

56 Toxicología de urgencia Pruebas de abuso de sustancia puramente clínicas Las pruebas se utilizan conjuntamente con la observación clínica En muchos casos, el tratamiento de urgencia se determina por los síntomas clínicos; la prueba de detección de drogas puede confirmar o refutar el diagnóstico clínico pero es probable que no afecte el tratamiento en general

57 Toxicología de urgencia Generalmente los modelos son sólo de detección; pueden dar una confirmación con motivos puramente informativos Son comunes los paneles de inmunoanálisis discretos Los paneles amplios proporcionan mejor información, sin embargo, generalmente no están disponibles en los laboratorios hospitalarios de rutina

58 Pruebas de detección de drogas en neonatos Otro mercado selectivo para pruebas de abuso de drogas Las pruebas están diseñadas para bebés en riesgo de exposición a drogas en forma intrauterina Las muestras pueden ser orina o meconio La orina da sólo la exposición reciente Las pruebas en meconio pueden medir la exposición desde el segundo trimestre en adelante

59 Pruebas de detección de drogas en neonatos Las pruebas a menudo se realizan para que los esfuerzos de intervención temprana puedan tener efecto sobre posibles problemas médicos y de desarrollo En algunos casos, las pruebas tienen implicaciones legales Retiro de los niños del hogar Clasificación delictiva de la exposición a drogas intrauterina Por lo tanto, si bien las pruebas se pueden realizar en un laboratorio clínico, se pueden aplicar estándares forenses

60 Pruebas de detección de drogas en neonatos El modelo es una prueba de detección por inmunoanálisis con confirmación automática, se recomienda una cadena de custodia Los problemas de matriz y la preparación de la muestra requerida presentan problemas exclusivos para el laboratorio Los protocolos utilizan en forma rutinaria pruebas FPIA semicuantitativas para proporcionar una sensibilidad adecuada

61 Resumen El inmunoanálisis es una poderosa herramienta para las pruebas de abuso de drogas Comprender la reactividad cruzada de los ensayos es fundamental para comprender e interpretar los resultados Muchos modelos de programas diferentes, los formatos tanto cualitativos como semicuantitativos son útiles en mercados específicos

62 Gracias por su atención